DIFFERENTATION OF CD34+ CELLS DERIVED FROM HUMAN CORD BLOOD TO MEGAKARYOCYTES AND PLATELETS EX VIVO

Abstract

Despite of the fact that the basic essentials of thrombocytopoesis are well known, there are still a lot of unanswered questions regarding to the mechanism of this process. And because of the very low frequency of megakaryocytes in bone marrow (<1%), they often need to be produced in cell culture in order to study the process. The development of the approaches for ex vivo production of megakaryocytic progenitors, megakaryocytes and platelets cuts a swath and opens a prospect for their use in clinical practice. This paper examines the protocol of using serum free medium with addition of thrombopoietin, stem cell factor, interleukin-6 and -9 for production of megakaryocytic progenitor and megakaryocytes from CD34+ cells derived from cord blood, which are capable to produce platelets.

Full Text

Процесс образования тромбоцитов является очень сложным, в нем принимают участия как гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), так и более дифференцированные прогениторные клетки, микроокружение костного мозга и целый ряд цитокинов. И хотя с момента открытия основных принципов тромбопоэза прошло более 100 лет и стали ясны многие важные ключевые моменты - в первую очередь благодаря клонированию и описанию тромбопоэтина (ТПО) в 1994 г. - трудно сказать, что на сегодняшний день этот процесс изучен в полной мере [1]. Но его дальнейшее изучение может открыть большие перспективы для развития биотехнологических производств для получения тромбоцитов в условиях ex vivo для клинического применения. В настоящее время тромбоциты для клинического применения могут быть получены только от взрослых доноров крови и ее компонентов, и их количество главным образом зависит только от количества доноров. Донорские тромбоциты сегодня используют не только в хирургической, акушерской и гематологической практике, но и для нужд активно развивающихся высокотехнологичных видов медицинской помощи, таких как трансплантация ГСК [2]. Кроме того, они применяются для лечения тромбоцитопений, являющихся результатом злокачественных образований, химиотерапии, иммунных заболеваний, инфекций и врожденных нарушений тромбоцитопоэза [3]. Дефицит компонентов крови, в том числе и тромбоцитов, растет и, по мнению специалистов, в ближайшее время Россия столкнется с еще большим дефицитом доноров в силу того, что предполагается увеличение количества высокотехнологичных операций в кардиологии, ортопедии и онкологии [2]. Важно отметить, что существует еще и целый ряд ограничений по использованию донорских тромбоцитов, связанных с небольшим сроком использования полученного концентрата тромбоцитов (всего 5 суток) [4], инфекционной безопасностью [5, 6] и тем, что повторные трансфузии могут вызвать образование антител против аллогенных антител HLA или HPA на донорских тромбоцитах [7]. В связи с этим на клеточные технологии возлагаются большие надежды в этой области, а использование стволовых клеток для получения компонентов крови может стать переломным моментом в развитии службы крови. Разработка эффективной системы, независимой от доноров, которая могла бы обеспечить растущие нужды службы крови, является целью огромного количества исследований по всему миру. На сегодняшний день уже получены важные результаты по получению эритроцитов и тромбоцитов человека из ГСК из различных источников, ЭСК и ИПСК [8, 9, 10, 11]. Проводятся эксперименты по воссозданию условий ниши внутри проточных биореакторов для получения тромбоцитов и изучения деталей процесса [12, 13, 14, 15, 16], а также методики по очистке полученных ex vivo тромбоцитов [17]. Однако, вопреки всем приложенным усилиям к решению поставленной задачи, еще не разработано ни одной достаточно эффективной для клинических целей модели по получению тромбоцитов человека [18, 19]. Несмотря на огромный потенциал подобных технологий, в Российской Федерации аналогичные исследования в этом направлении до настоящего времени не проводились. В представленной работе описывается эксперимент по получению мегакариоцитов и тромбоцитов человека из ГСК, полученных из пуповинной крови в условиях ex vivo. Материалы и методы Пуповинная кровь. Пуповинная кровь объемом от 47,95 мл до 81,8 мл была собрана после подписания полного информированного согласия роженицами. В исследование были взяты образцы пуповинной крови от женщин, не имеющих семейных случаев тяжелых соматических, онкологических и генетических заболеваний, в т.ч. патологий эритропоэза, лейкопоэза, тромбоцитопоэза и иммунодефицитов. Период гестации - 38-40 недель. Все роды были естественными, вес новорожденных - 3000-3570 г, количество баллов по шкале Апгар - 8-10. Пуповинная кровь была собрана пункцией пупочной вены после отсечения пуповины. Кровь была собрана в гемаконы («Грин Кросс», Южная Корея) с ЦФДА-1 в качестве антикоагулянта и доставлена в лабораторию при комнатной температуре (21°С) в течение 12-19 часов. Выделение лейкоцитарной фракции и очистка CD34+ клеток. Выделение и очистка лейкоцитарной фракции осуществлялось с использованием фиколла (Диаколл/Diacoll, Диа-М, Россия), натрий-фосфатного буфера («Биолот», Россия) согласно следующему протоколу. Гемаконы с пуповинной кровью центрифугировались при 428g, 7 мин для разделения на фракции. После этого лейкоцитарный слой нескольких ЕПК (3-4) объединялся для увеличения общего количества клеток, а также для сглаживания интердонорской вариабельности. После этого производилась очистка мононуклеарной фракции на фиколле согласно инструкциям производителя. Анализ клеточных компонентов цельной пуповинной крови и мононуклеарной фракции проводился на гематологических анализаторах MINDRAY BC-2800 (MINDRAY, Китай) и ABX Pentra 60 C+ (HORIBA Medical, Франция). CD34+ клетки были очищены из выделенной чистой лейкоцитарной фракции с помощью позитивной иммуномагнитной селекции с использованием бесколоночной системы EasySep™ Magnet и набора EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit (STEMCELL Technologies, Канада) согласно протоколу производителя. Условия культивирования. Культивирование поводилось в 24-х луночных планшетах с рабочим объемом 0,8-1 мл при 37°С, 5% CO2. Клетки вносились в среду в концентрации 2,77-3,28х104 кл/мл. В среду на основе IMDM было добавлено 20% BIT 9500 (Gibco, США), 100μМ 5х10-2 2-меркаптоэтанола (Helicon, Россия), 1% антибиотика-антимикотика, а также смесь цитокинов ТПО - 30 нг/мл; SCF - 2 нг/мл; ИЛ-6 - 7,5 нг/мл и ИЛ-9 - 13,5 нг/мл (Gibco, США). На 4-ые сутки суспензия клеток была перемешана пипетированием, удалена половина среды и внесен тот же объем свежеприготовленной среды того же состава. На 7 сутки общая концентрация клеток была доведена до 3-3,4х105 кл/мл добавлением свежеприготовленной среды. Морфологический анализ. Морфологический анализ проводился регулярно при помощи световой микроскопии с использованием систем Zeiss AxioObserver, на ПО AxioVision V 4.6.3.0 и Zeiss AxioStar Plus (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия). Проточная цитометрия. Анализ клеточной популяции был проведен с помощью проточной цитометрии на проточном цитометре FACS Canto (BD, США) с использованием антител против CD34, CD41a (BD, США). Абсолютный подсчет количества CD34+ клеток был проведен с использованием пробирок Trucount Tubes (BD, США). Подсчет абсолютного количества клеток. Подсчет количества ядросодержащих клеток на протяжении культивирования и тромбоцитов проводился с помощью гемоцитометра Metallized Hemacytometer Reichert Bright-Line (Hausser Scientific Company, США) на 4, 7, 10 и 14 сутки согласно инструкции производителя. Статистическая обработка данных. Обработка данных и построение графиков проводилось с помощью программного обеспечения SigmaPlot version 11.0, Systat Software, Inc., США. Результаты Экспансия клеток. В процессе культивирования отмечена экспансия ядросодержащих клеток с 8,217 ± 2,177 х106 на 4 сутки до 198,656±44,51 х106 на 14-ые сутки культивирования. Кроме того, увеличилось и количество CD34+ клеток с 0,735±0,052 х106 на 0 сутки до 3,026 ± 0,185 х106 на 10-ые сутки культивирования. Результаты экспансии клеток представлены в таблице 1 и рисунках 1 и 2. Созревание мегакариоцитов. Созревание мегакариоцитов оценивалось по экспрессии маркеров CD34 и CD41a на протяжении культивирования. Уже на 7 сутки было отмечено появление популяции клеток, коэкспрессирующих CD34 и CD41a (промегакариоцитов). В процессе культивирования процентное соотношение этой популяции выросло с 1,6±0,9% на 4 сутки до 36,85±0,49% на 7 сутки, затем их количество стало снижаться до 21,42±0,286% на 16 сутки культивирования. Созревая, мегакариоцитарные предшественники (промегакариоциты) утрачивали экспрессию CD34 антигена. Результаты динамики роста популяции этих клеток представлены в таблице 2. Начиная с 6 суток, наблюдалось появление незрелых мегакариоцитов, крупных клеток диаметром более 20 мкм (рис. 3a). Появление зрелых мегакариоцитов и образование большого количества протромбоцитов было хорошо заметно уже на 12 сутки культивирования (рис. 3б). Морфологический анализ полученных тромбоцитов с помощью световой микроскопии показал их идентичность с контрольными тромбоцитам венозной крови (рис. 4). Микроскопия мазков препаратов, полученных в ходе проведения эксперимента, также показала их морфологическую идентичность тромбоцитам венозной крови взрослого донора (рис. 5). Заключение Полученные данные свидетельствуют о возможности получения мегакариоцитов и тромбоцитов человека в экспериментах ex vivo с использованием бессывороточных сред с описанным цитокиновым коктейлем. Несомненно, что полученные таким образом мегакариоцитарные предшественники, мегакариоциты и тромбоциты требуют дальнейшего функционального анализа, а сама технология - еще больших доработок как в плане увеличения эффективности дифференцировки ГСК в мегакариоциты и образования тромбоцитов, так и в плане обеспечения инфекционной безопасности продукта, синхронизации всех процессов и других технологических этапов. При этом, несмотря на многие препятствия на пути к развитию этой технологии, подобные эксперименты представляют живой интерес и позволяют продвинуться еще на один шаг ближе к клиническому применению мегакариоцитов и тромбоцитов, полученных ex vivo.
×

References

  1. Kaushansky K. Thrombopoiesis // Semin Hematol. 2015. Vol.52(1). P.4-11.
  2. Кислякова Л.П. Донорство как компонент национальной безопасности // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 4; url: www.science-education.ru/118-14092.
  3. Stasi R. How to approach thrombocytopenia // Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2012. P.191-197.
  4. Приказ Минздрава России от 25 ноября 2002 г. № 363 “Об утверждении Инструкции по применению компонентов крови”
  5. Чечеткин А.В., Данильченко В.В., Макеев А.Б., Григорьян М.Ш. Новые технологии обеспечения инфекционной и иммунологической безопасности в учреждениях службы крови Российской Федерации // «Трансфузиология». 2014. №15-1. С.70-71.
  6. Гаврилов А.О., Жуковская Е.В., Спичак И.И., Рудакова Г.А. Биологическая безопасность - один из главных критериев качества трансфузионной помощи // Вестник службы крови России. 2009. №2. С.11-17.
  7. Schiffer C.A. Diagnosis and management of refractoriness to platelet transfusion // Blood Rev. 2001. Vol.15(4). P.175-80.
  8. Fujimi A., Matsunaga T., Kobune M., Kawano Y., Nagaya T., Tanaka I., Iyama S., Hayashi T., Sato T., Miyanishi K., Sagawa T., Sato Y., Takimoto R., Takayama T., Kato J., Gasa S., Sakai H., Tsuchida E., Ikebuchi K., Hamada H., Niitsu Y. Ex vivo large-scale generation of human red blood cells from cord blood CD34+ cells by co-culturing with macrophages // Int J Hematol. 2008. Vol.87(4). P.339-50.
  9. Nakamura S., Takayama N., Hirata S., Seo H., Endo H., Ochi K., Fujita K., Koike T., Harimoto K., Dohda T., Watanabe A., Okita K., Takahashi N., Sawaguchi A., Yamanaka S., Nakauchi H., Nishimura S., Eto K. Expandable megakaryocyte cell lines enable clinically applicable generation of platelets from human induced pluripotent stem cells // Cell Stem Cell. 2014. Vol.14(4). P.535-48.
  10. Lu S.J., Li F., Yin H., Feng Q., Kimbrel E.A., Hahm E., Thon J.N., Wang W., Italiano J.E., Cho J., Lanza R. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice // Cell Res. 2011. Vol.21(3). P.530-45.
  11. Hatami J., Andrade P.Z., Alves de Matos A.P., Djokovic D., Lilaia C., Ferreira F.C., Cabral J.M., da Silva C.L. Developing a co-culture system for effective megakaryo/thrombopoiesis from umbilical cord blood hematopoietic stem/progenitor cells // Cytotherapy. 2015. Vol.17(4). P.428-42.
  12. Pallotta I., Lovett M., Kaplan D.L., Balduini A. Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes // Tissue Eng Part C Methods. 2011. Vol.17(12). P.1223-1232.
  13. Di Buduo C.A., Wray L.S., Tozzi L., Malara A., Chen Y., Ghezzi C.E., Smoot D., Sfara C., Antonelli A., Spedden E., Bruni G., Staii C., De Marco L., Magnani M., Kaplan D.L., Balduini A. Programmable 3D silk bone marrow niche for platelet generation ex vivo and modeling of megakaryopoiesis pathologies // Blood. 2015. Vol.125(14). P.2254-2264.
  14. Thon J.N., Mazutis L., Wu S., Sylman J.L., Ehrlicher A., Machlus K.R., Feng Q., Lu S., Lanza R., Neeves K.B., Weitz D.A., Italiano J.E. Jr. Platelet bioreactor-on-a-chip // Blood. 2014. Vol.124(12). P.1857-1867.
  15. Sullenbarger B., Bahng J.H., Gruner R., Kotov N., Lasky L.C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds // Exp Hematol. 2009. Vol.37(1). P.101-110.
  16. Nakagawa Y., Ikeda S., Fukuda T., Arai F., Nakamura S., Eto K. Production system of platelet from iPS cells by two-way flow bioreactor // MHS. 2012. P.178-181.
  17. Schlinker A.C., Radwanski K., Wegener C., Min K., Miller W.M. Separation of in-vitro-derived megakaryocytes and platelets using spinning-membrane filtration // Biotechnol Bioeng. 2015. Vol.112(4). P.788-800.
  18. Avanzi M.P., Mitchell W.B. Ex vivo production of platelets from stem cells // Br J Haematol. 2014. Vol.165(2). P.237-247.
  19. Lambert M.P., Sullivan S.K., Fuentes R., French D.L., Poncz M. Challenges and promises for the development of donor-independent platelet transfusions // Blood. 2013. Vol.121(17). P.3319-3324.

Copyright (c) 2015 KLYUCHNIKOV D.Y., YAZYKOVA M.Y., TYUMINA O.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies