THE DEVELOPMENT OF APPROACHES TO STANDARDIZATION OF THE POPULUS NIGRA LEAVES

Abstract


The article studiesthe problems of phytochemical research of Populus nigra L. leaves, which are considered perspective raw material containing flavonoids. The investigation resulted in the determination of the optimal conditions for the extraction of flavonoids in the leaves of Populus nigra: 70% ethyl alcohol as extragent; ratio between raw material and extragent is 1 : 30; extraction time equals 60 min. The method of quantitative determination of the total flavonoids in the leaves of Populus nigra by differential spectrophotometry using the state standard sample of rutin at a wave length of 414 nm was developed. The content of the total flavonoids for Populus nigra leaves varies from 2.04% to 2.99%. The error of a single determination with a 95% confidence probability is 3.21%.

Full Text

Введение Тополь черный (Populus nigra L.) является одним из фармакопейных видов растений, включенных в Государственную фармакопею Российской Федерации XIII издания: в качестве лекарственного растительного сырья (ЛРС) зарегистрированы почки (ФС.2.5.0042.15) [2]. Препараты на основе почек тополя обладают широким спектром фармакологической активности: противогрибковым, антисептическим, ранозаживляющим и противовоспалительным действием [1, 3-5]. На наш взгляд, не менее интересными с точки зрения источника биологически активных соединений (БАС) являются и другие части растения, в том числе листья тополя черного. Известен опыт народного применения листьев тополя в качестве средства, обладающего противовоспалительными и антибактериальными свойствами, однако в настоящее время степень изученности химического состава данного вида сырья является недостаточной. С целью введения листьев тополя черного в Государственную фармакопею Российской Федерации необходимо проведение комплекса фармакогностических исследований, включая разработку нормативной документации, подтверждающей качество ЛРС [7]. Цель настоящего исследования - разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного. В задачи исследования входило: - разработка методики количественного анализа суммы флавоноидов в листьях тополя черного; - определение содержания суммы флавоноидов для изучаемого вида сырья; - определение нижнего предела содержания действующих веществ для листьев тополя черного. Результаты и их обсуждение Тополь черный - Populus nigra L., быстро растущее, широко распространенное растение на территории Российской Федерации [5]. Особый интерес наряду с фармакопейным сырьем - почками представляют листья данного растения. Так, в листьях тополя черного содержатся фенольные соединения, витамины, органические кислоты, дубильные вещества [6]. Объектом исследования служили листья тополя черного, заготовленные в июне и сентябре 2012-2018 гг. в п. Алексеевка и с. Гаврилова Поляна Самарской области. В ходе разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного изучены УФ-спектры растворов водно-спиртовых извлечений из данного сырья (рис. 1 и 2). Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения тополя черного наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов (рис. 1), как и в случае рутина (рис. 3). Изучение УФ-спектров Государственного стандартного образца (ГСО) рутина показало, что раствор данного стандарта в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 414 нм (рис. 3). В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из листьев тополя черного в дифференциальном варианте обнаруживается при длине волны 414 нм максимум поглощения (рис. 4), который соответствует максимуму поглощения раствора рутина. Таким образом, рутин может быть использован в методике анализа в качестве ГСО. С целью разработки методики количественного определения суммы флавоноидов нами подобраны оптимальные условия экстракции флавоноидов в листьях тополя черного: экстрагент 70 % этиловый спирт; соотношение «сырье - экстрагент» - 1 : 30; время экстракции - извлечение на кипящей водяной бане в течение 60 мин (табл. 1). Методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 70 % этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса). Испытуемый раствор готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор А). Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 414 нм через 40 минут после приготовления. В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный следующим образом: 1 мл извлечения (1 : 30) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора спиртом этиловым 96 % до метки. Примечание: Приготовление раствора рутина - стандартного образца. Около 0,025 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70 % этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70 % этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 2 мл 3 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор Б рутина). Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 414 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, который готовят следующим образом: 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (раствор сравнения Б рутина). Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: , где D - оптическая плотность испытуемого раствора; Do - оптическая плотность раствора ГСО рутина; m - масса сырья, г; mo - масса ГСО рутина, г; W - потеря в массе при высушивании в процентах. В случае отсутствия стандартного образца рутина целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения - 240. , где D - оптическая плотность испытуемого раствора; m - масса сырья, г; 240 - удельный показатель поглощения () ГСО рутина при 414 нм; W - потеря в массе при высушивании в процентах. Метрологические характеристики методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в листьях тополя черного представлены в табл. 2. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного с доверительной вероятностью 95 % составляет ±3,21 %. Валидационная оценка разработанной методики проводилась по показателям: специфичность, линейность, правильность и воспроизводимость. Специфичность методики определялась по соответствию максимумов поглощения комплекса флавоноидов листьев тополя черного и рутина с алюминия хлоридом. Линейность методики определяли для серии растворов рутина (с концентрациями в диапазоне от 0,00880 до 0,03520 мг/мл). Коэффициент корреляции составил 0,98953. Правильность методики определяли методом добавок путем добавления раствора рутина с известной концентрацией (25, 50 и 75 %) к испытуемому раствору. При этом средний процент восстановления составил 98 %. С использованием разработанной методики нами проанализирован ряд образцов листьев тополя черного (табл. 3) и при этом определено, что содержание суммы флавоноидов варьирует от 2,04 до 2,99 %, что позволяет рекомендовать в качестве нижнего предела для сырья данного растения содержание суммы флавоноидов не менее 2,0 %. Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о целесообразности стандартизации листьев тополя черного путем определения суммы флавоноидов методом спектрофотометрии при аналитической длине волны 414 нм в пересчете на рутин. Выводы 1. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием ГСО рутина при аналитической длине волны 414 нм. 2. Содержание суммы флавоноидов для листьев тополя черного варьирует от 2,04 до 2,99 %. Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95 % составляет ±3,21 %. 3. Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать для листьев тополя черного нижний предел содержания суммы флавоноидов не менее 2,0 %. Конфликт интересов отсутствует. [A] 2,75 2,5 2,25 2 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0,25 Aбсорбция / Absorption 200 250 300 350 1 400 2 450 [nm] Рис. 1. Электронные спектры растворов водно-спиртового извлечения из листьев тополя черного: 1 - раствор извлечения; 2 - раствор извлечения с добавлением алюминия хлорида Fig. 1. Electronic spectra of solutions of water-alcohol extraction from Populus nigra leaves: 1 - extraction solution; 2 - extraction solution with aluminium chloride [A] 2,75 2,5 2,25 2 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0,25 Aбсорбция / Absorption 200 250 300 1 350 400 2 450 [nm] Рис. 2. Электронные спектры растворов водно-спиртового извлечения из листьев тополя черного: 1 - раствор извлечения с добавлением алюминия хлорида; 2 - раствор рутина с добавлением алюминия хлорида Fig. 2. Electronic spectra of solutions of water-alcohol extraction from Populus nigra leaves: 1 - extraction solution with aluminium chloride; 2 - rutin solution with aluminium chloride [A] 2,75 2,5 2,25 2 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0,25 Aбсорбция / Absorption 200 250 300 350 1 400 2 450 [nm] Рис. 3. Электронные спектры спиртовых растворов рутина: 1 - исходный раствор; 2 - раствор с добавлением алюминия хлорида Fig. 3. Electronic spectra of alcohol solutions of rutin: 1 - primary solution; 2 - solution with aluminium chloride Таблица 1 / Table 1 Зависимость полноты извлечения суммы флавоноидов из листьев тополя черного The dependence of the efficiency of extraction of the total flavonoids from the leaves of the Populus nigra № п/п Экстрагент Соотношение сырье : экстрагент Время экстракции, мин Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье (в %) 1 40 % этиловый спирт 1 : 30 60 2,71 ± 0,11 2 50 % этиловый спирт 1 : 30 60 2,79 ± 0,08 3 60 % этиловый спирт 1 : 30 60 2,92 ± 0,09 4 70 % этиловый спирт 1 : 30 60 2,99 ± 0,08 5 80 % этиловый спирт 1 : 30 60 2,89 ± 0,12 6 96 % этиловый спирт 1 : 30 60 0,85 ± 0,10 7 70 % этиловый спирт 1 : 30 30 2,52 ± 0,07 9 70 % этиловый спирт 1 : 30 45 2,62 ± 0,08 12 70 % этиловый спирт 1 : 30 90 2,69 ± 0,09 14 70 % этиловый спирт 1 : 30 120 2,88 ± 0,09 15 70 % этиловый спирт 1 : 30 60 2,74 ± 0,08 16 70 % этиловый спирт 1 : 20 60 2,68 ± 0,07 17 70 % этиловый спирт 1 : 50 60 2,47 ± 0,08 [A] 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0,25 Aбсорбция / Absorption 200 250 300 350 400 450 [nm] Рис. 4. Электронный спектр раствора водно-спиртового извлечения из листьев тополя черного (дифференциальный вариант) Fig. 4. The electronic spectrum of a solution of water-alcohol extraction of the leaves of Populus nigra (differential version) Таблица 2 / Table 2 Mетрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного Metrological characteristics of methods for the quantitative determination of the total flavonoids in the leaves of the Populus nigra f ‾X S P, % t (P, f) ±X E, % 10 2,83 0,4472 95 2,23 ±0,091 ±3,21 Таблица 3 / Table 3 Cодержание суммы флавоноидов в образцах листьев тополя черного The content of the total flavonoids in samples of Populus nigra leaves № п/п Характеристика образца сырья Содержание суммы флавоноидов в абсолютно сухом сырье (в %) в пересчете на рутин 1 Самарская область, п. Алексеевка (июнь 2012 г.) 2,99 ± 0,11 2 Самарская область, п. Алексеевка (июнь 2017 г.) 2,87 ± 0,08 3 Самарская область, с. Гаврилова Поляна (сентябрь 2018 г.) 2,04 ± 0,09

About the authors

E A Kupriyanova

Samara State Medical University

Email: lenoka-09@mail.ru
Postgraduate student, Department of Pharmacognosy with Botany and the Basics of Phytotherapy

V A Kurkin

Samara State Medical University

Email: kurkinvladimir@yandex.ru
Doctor of Pharmacy, Professor, Head of the Department of Pharmacognosy with Botany and the Basics of Phytotherapy

References

  1. Браславский В.Б., Куркин В.А., Жданов И.П. Антимикробная активность экстрактов и эфирных масел почек некоторых видов Populus L. // Растительные ресурсы. - 1991. - Т. 27. - № 2. - С. 77-81
  2. pharmacopoeia.ru [интернет]. Государственная фармакопея Российской Федерации. 13-е издание. [доступ от 18.11.2018]. Доступ по ссылке http://pharmacopoeia.ru/gosudarstvennaya-farmakopeya-xiii-online-gf-13-online/
  3. Куркин В.А., Браславский В.Б., Запесочная Г.Г. Почки тополя - перспективный источник антимикробных и противогрибковых лекарственных средств // Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты: материалы Первого Международного научного конгресса. - М., 1994. - С. 172
  4. Куркин В.А., Варина Н.Р., Авдеева Е.В., и др. Разработка комбинированных лекарственных фитопрепаратов для стоматологии и лор-практики // Наука и инновации в медицине. - 2016. - № 4. - С. 51-57
  5. Фармакогнозия: Учебник для студентов фарм. вузов / Под ред. В.А. Куркина. - Самара, 2016
  6. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Paeoniaceae - Thymelaeaceae / Под ред. О.Д. Барнаулова. - Л.: Наука, 1986
  7. Шагалиева Н.Р. Экспериментальное обоснование методик качественного и количественного анализа нового комплексного лекарственного фитопрепарата для челюстно-лицевой хирургии и стоматологии // Аспирантский вестник Поволжья. - 2011. - № 5-6. - С. 276-279

Statistics

Views

Abstract - 10

PDF (Russian) - 10

Cited-By


PlumX

Dimensions

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2018 Kupriyanova E.A., Kurkin V.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies