Development and validation of methods of quantitative determination of biologically active compound n-(2-[4-oxo-3(4h)-quinazolinyl]propionyl)guanidine

Cover Page

Abstract


This paper presents the results of the selection and justification of the conditions for determination of a new biologically active compound (BAC) VMA-13-15, which is N-(2-[4-oxo-3(4H)-quinazolinyl]propionyl)guanidine bymeans of the spectrophotometry. By using the calculated values of BAC ionization constants, it was proposed to use purified water as a solvent. The maximum light absorption at 266 nm was chosen as the analytical wavelength. This was justified by the fact that in aqueous solutions 99% BAC are in the molecular form, which allows to determine it with the error limit of 1.29%, and with the least amount of dilutions. The study showed that the proposed method is specific and linear in the analytical concentration of 0.001–0.004%, as well as it is precise and correct, which confirms the possibility of its use for quantitative determination.


Full Text

Введение

При создании новых лекарственных препаратов особое внимание уделяют вопросам стандартизации, которая подразумевает разработку нормативной документации, регламентирующей показатели качества и методики их определения на всех этапах жизненного цикла препарата. Объектом нашего исследования стало впервые синтезированное в ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России биологически активное соединение (БАС) — N-(2-[4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]пропионил)-гуанидин (VMA-13-15) (см. рисунок), проявляющее кардиопротекторную и нейропротекторную активность, перспективное для создания эффективных лекарственных препаратов [3].

Одним из этапов создания нормативной документации на новое лекарственное средство является разработка методик количественного определения действующего вещества в фармацевтической субстанции. Доступным и надежным методом анализа качества лекарственных средств признана УФ-спектрофотометрия в видимой и ультрафиолетовой областях спектра [4].

Цель исследования — выбор и обоснование условий определения содержания биологически активного соединения VMA-13-15 спектрофотометрическим методом.

Материалы и методы исследования

Исследования проведены на 3 сериях лабораторных образцов БАС VMA-10-15. В работе использовали мерную посуду класса А, аналитические весы Госметр ВЛ-124. Измерение электронных спектров в УФ-области проводили на спектрофотометре СФ-2000. В качестве стандартного образца (СО) использовали дважды перекристаллизованный и высушенный до постоянной массы порошок N-(2-[4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]пропионил)гуанидина.

Для измерения УФ-спектров нами были приготовлены растворы по следующей методике: около 0,05 г (точная навеска) СО БАС помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 30 мл соответствующего растворителя, взбалтывают до полного растворения и доводят этим же растворителем до метки (раствор А). При измерении спектра в области 250–280 нм 2 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки соответствующим растворителем. При измерении оптической плотности в области 220–240 нм 10 мл раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят соответствующим растворителем до метки (раствор Б), затем 2 мл раствора Б помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и далее поступают, как описано выше. В качестве раствора сравнения используют соответствующий растворитель.

 

Структурная формула VMA-13-15

Structural formula VMA-13-15

 

Методика количественного определения БАС: около 0,05 г (точная навеска) субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и далее готовят растворы А и Б, как указано выше, используя в качестве растворителя воду очищенную. 2 мл раствора А или 3 мл раствора Б помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой очищенной до метки. Оптическую плотность полученных растворов измеряют при длинах волн 266 и 226 нм соответственно. Параллельно измеряют оптическую плотность растворов стандартного образца БАС.

Приготовление раствора стандартного: около 0,05 г (точная навеска) СО БАС помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 30 мл воды очищенной, взбалтывают до полного растворения и доводят этим же растворителем до метки (раствор В). Далее готовят разведения согласно методике количественного определения субстанции, описанной выше.

Расчет содержания БАС в анализируемых образцах проводили с учетом оптической плотности стандартного образца

x%=Ax·C·50·100·100ACT·V·a(100-W)

Для построения градуировочных графиков готовили серию растворов, используя исходные растворы А или Б. С этой целью 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 мл этих растворов переносили в мерные колбы вместимостью 100 мл и доводили до метки соответствующим растворителем.

Валидационную характеристику «линейность» проверяли экспериментально измерением аналитического сигнала для проб с различным содержанием исследуемой субстанции в пределах аналитической области методики — от 70 до 130 % номинального содержания [2].

Проверку прецизионности (на уровне сходимости) проводили по 6 параллельным определениям и рассчитывали величины стандартного отклонения (RS) и относительного стандартного отклонения (RSD) (см. табл. 2).

 

Таблица 1 / Table 1

Спектрофотометрические характеристики N-(2-[4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]пропионил)гуанидина (VMA-13-15)

Spectrophotometric characteristics of N-(2-[4-oxo-3(4H)-quinazolinyl]propionyl)guanidine (VMA-13-15)

Растворитель

Длина волны,

нм

Уравнение регрессии

R

Аналитическая область, С%

 

ε

Вода

226

у = 1028х + 0,007

0,9992

0,0002–0,0008

1050

1,61

266

у = 228,1х – 0,022

0,9979

0,001–0,004

218

1,34

302

у = 124,7х – 0,038

0,9993

0,003–0,006

116

1,21

0,1 М раствор натрия гидроксида

226

у = 1135х – 0,058

0,9988

0,0003–0,0009

1025

2,20

266

у = 225,5х – 0,010

0,9973

0,001–0,004

221

1,46

302

у = 137,7х – 0,075

0,9994

0,003–0,006

120

2,13

0,1 М раствор кислоты хлористоводородной

227

у = 903,9х – 0,046

0,9954

0,0003–0,0009

819

2,25

273

у = 214,5х – 0,020

0,9986

0,001–0,004

205

1,34

 

Таблица 2 / Table 2

Результаты количественного определения N-(2-[4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]пропионил)гуанидина (VMA-13-15)

Results of quantitative determination of N-(2-[4-oxo-3(4H)-quinazolinyl]propionyl)guanidine (VMA-13-15)

1-я серия

2-я серия

3-я серия

Навеска

Ах

Найдено

Навеска

Ах

Найдено

Навеска

Ах

Найдено

1

0,0550

0,426

99,88

0,0560

0,425

99,64

0,0499

0,422

98, 94

2

0,0501

0,423

99,17

0,0481

0,421

98,70

0,0520

0,431

101,05

3

0,0490

0,429

100,58

0,0552

0,427

100,11

0,0502

0,428

100,35

4

0,0511

0,431

101.52

0,0571

0,432

101,28

0,0565

0,423

99,17

5

0,0523

0,422

98,94

0,0510

0,422

98,94

0,0513

0,437

102,4

6

0,0552

0,436

102,52

0,0501

0,435

101,99

0,0563

0,426

99,88

Метрологические характеристики

1-я серия: хср = 100,43 %, SD = 1,30, RSD = ±1,30 %

2-я серия: хср = 100,11 %, SD = 1,29, RSD = ±1,29 %

3-я серия: хср = 100,29 %, SD = 1,28, RSD = ±1,28 %

 

Внутрилабораторная прецизионность

Исследователь 1

Исследователь 2

Навеска

Ах

Найдено

Навеска

Ах

Найдено

1

0,0550

0,426

99,88

0,0515

0,431

101,35

2

0,0501

0,423

99,17

0,0489

0,429

100,58

3

0,0490

0,429

100,58

0,0553

0,423

99,17

4

0,0511

0,431

101.52

0,0507

0,427

100,11

5

0,0523

0,422

98,94

0,0499

0,425

99,64

6

0,0552

0,436

102,52

0,0541

0,438

102,56

Метрологические характеристики

Исследователь 1: хср = 100,43 %, SD = 1,3, RSD = ±1,3 %

Исследователь 2: хср = 100,56 %, SD = 1,18, RSD = ±1,18 %

 

Межлабораторная прецизионность

Спектрофотометр 1

Спектрофотометр 2

Спектрофотометр 3

Навеска

Ах

Найдено

Навеска

Ах

Найдено

Навеска

Ах

Найдено

1

0,0560

0,425

99,64

0,0550

0,427

100,1

0,0567

0,426

99,88

2

0,0481

0,421

98,70

0,0501

0,431

101,05

0,0511

0,423

99,17

3

0,0552

0,427

100,11

0,0490

0,426

99,88

0,0545

0,425

99,64

4

0,0571

0,432

101,28

0,0511

0,432

101,28

0,0499

0,424

99,41

5

0,0510

0,422

98,94

0,0523

0,439

102,78

0,0503

0,422

98,94

6

0,0501

0,435

101,99

0,0554

0,428

100,35

0,0506

0,435

101,99

Метрологические характеристики

Спекрофотометр 1: хср = 100,11 %, SD = 1,29, RSD = ±1,29 %

Спекрофотометр 2: хср = 100,90 %, SD = 1,06, RSD = ±1,06 %

Спекрофотометр 3: хср = 99,83 %, SD = 1,10, RSD = ±1,10 %

 

При исследовании внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности анализ проводили два сотрудника в разные дни. Межлабораторную прецизионность подтверждали путем проведения измерений на трех разных приборах на одной серии БАС.

Результаты исследования и их обсуждение

Электронные спектры поглощения водных растворов органических веществ, имеющие заместители как кислотного, так и основного характера, могут иметь различный характер в зависимости от значений рН используемого раствора. На смещение спектров поглощения, а также интенсивность поглощения, большое влияние может оказывать содержание ионной или молекулярной формы исследуемого вещества. Известно, что влияние рН раствора практически исключается в том случае, если значение рН = рК ± 3, поскольку в данных условиях исследуемое вещество находится на 99,9 % в одной из своих форм.

Константы ионизации определяли с помощью электронного ресурса chemicalize.com, при этом оказалось, что вещество имеет константу как кислота (рК1 = 11,3) и две константы как основание (рК3 = 4,71 и рК2 = 8,77).

Полученные значения рК позволили рассчитать количества молекулярной и ионизированной формы субстанции (%) в зависимости от рН среды водного раствора.

Значения рК = 4,71 и рК = 8,77 свидетельствуют, что молекула БАС в растворе может проявлять основные свойства и быть полностью ионизированной как основание только при рН ≤ 1,7. Так как водные растворы субстанции, приготовленные для измерения оптической плотности, имеют значения pH в области 5,5–5,7, можно считать, что в растворе содержится смесь молекулярной и ионизированной форм БАС как основания, так и молекулярной формы как кислоты (рК = 11,77) [1].

В полностью ионизированной форме как кислоты БАС находится в растворах при рН более 14. При рН более 12 (0,1 М раствор гидроксида натрия) можно считать, что ионизированная форма в растворе содержится на 99 % (рН = рК ± 2).

Таким образом, для анализа нами были использованы вода очищенная, а также щелочные и кислые растворы.

Как следует из табл. 1, спектры поглощения БАС как в воде, так и в растворе 0,1 М гидроксида натрия имеют три максимума поглощения при 226,266 и 302 нм. Однако при использовании щелочного раствора значительно увеличивается интенсивность поглощения по сравнению с поглощением водных растворов. В кислом растворе спектр поглощения имел только два максимума.

Полоса поглощения в области 225–230 нм обусловлена π → π* переходом в насыщенных связях хиназолинового кольца. Характер поглощения в длинноволновой части спектра, вероятно, обусловлен электронными переходами, включающими всю сопряженную систему хиназолинового кольца и пропионилгуанидиновой группы как акцептора электронов.

В соответствии с требованиями Общей фармакопейной статьи ГФ ХIII «Спектрофотомерия в ультрафиолетовой и видимой областях», выбор концентрации измеряемого раствора при разработке методики количественного определения проводится с учетом минимальной систематической ошибки, которая получается при значении оптической плотности 0,4343. Поэтому подбор концентраций для построения градуировочного графика и расчет навески проводили исходя из данного значения [2].

При изучении влияния растворителя на точность результатов спектрофотометрического анализа измеряли оптическую плотность растворов, приготовленных для построения градуировочных графиков в максимумах поглощения как в коротковолновой (225–230 нм), так и в длинноволновой области (265–270 нм). Были установлены границы концентраций, в которых соблюдается основной закон светопоглощения, рассчитаны уравнения регрессии градуировочных графиков, коэффициенты корреляции и значения удельных показателей поглощения в максимумах поглощения в различных растворителях (табл. 1).

Как следует из табл. 1, аналитическая область во всех растворителях при длине волны 226–227 нм находится в границах от 0,0002–0,0009 % вещества в пробе, при длине волны 266 и 273 нм — от 0,001–0,004 % и для 302 нм — 0,002–0,008 %. При этом уравнения градуировочных графиков имеют незначительную величину свободного члена, то есть прямые градуировочных графиков проходят через начало координат. Коэффициент корреляции (r) находится в пределах 0,9942–0,9999, следовательно, не превышает значения r ≤ 0,999, установленные ГФ, то есть результаты оценки линейности свидетельствуют о пригодности выбранной методики количественного определения БАС в исследованном диапазоне концентраций.

Специфичность методики подтверждали соответствием положениям максимумов исследуемого БАС и СО.

Выбор оптимальной длины волны производили на основании ошибки расчета удельного показателя для каждой длины волны и соответствующего растворителя. При использовании воды очищенной ошибка не превышает 1,6 % при всех аналитических длинах волн. В растворе щелочи минимальная ошибка наблюдалась при 266 нм — 1,46 %, а при 226 и 302 нм — 2,2 %. Для раствора кислоты минимальная ошибка наблюдалась в коротковолновой области — 1,34 %.

В табл. 2 приведены данные, позволяющие предложить для разрабатываемой методики получения растворов использовать воду и измерять оптическую плотность при 266 нм.

Важным этапом оценки аналитической методики служит подтверждение ее валидности, по следующим валидационным характеристикам: специфичность, линейность, прецизионность и правильность.

В приемлемых условиях по методике, приведенной выше, были проанализированы три образца БАС. Как следует из табл. 2, содержание БАС в исследуемых образцах находится в пределах 98–102 % и относительная погрешность измерения составляет 1,29 %, то есть методика прецизионна по сходимости результатов и приемлема для анализа исследуемого соединения [5].

При сравнении результатов, полученных двумя сотрудниками (внутрилабораторная прецизионность), следует, что различия между их результатами незначительны (табл. 2). При проведении межлабораторной прецизионности значения RSD составили 1,29, 1,06 и 1,10 % соответственно. Это показывает, что различия между результатами также незначительны. Полученные результаты определения прецизионности по трем вариантам свидетельствуют о валидности методики по показателю прецизионности.

Правильность методики подтверждали анализом на трех уровнях анализируемых концентраций соответствующих 80, 100, 120 % номинального содержания. На каждом уровне проводили по три определения. Как известно, приемлемыми критериями правильности спектрофотометрической методики определения субстанции являются результаты открываемости на уровне 98–102 % и отсутствие значимой систематической ошибки. Полученные результаты свидетельствуют, что значения открываемости R, равные 100,11, находятся в пределах 98–102 % при значении RDS равном 1,3 %, что является признаком валидности по данному показателю [5].

Заключение

С использованием полученных расчетным путем значений констант ионизации обоснован выбор растворителя и разработана спектрофотометрическая методика количественного определения БАС N-(2-[4-оксо-3(4H)-хиназолинил]пропионил)гуанидина.Показано, что предложенная методика специфична, линейна в области аналитических концентраций, а также прецизионна и правильна, что подтверждает возможность ее использования для количественного определения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Evgenia V. Kompantseva

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute, a Branch of Volgograd State Medical University

Author for correspondence.
Email: pharmachemistry@mail.ru

Russian Federation, Pyatigorsk

Doctor of Pharmaceutical Sciences, Professor, Department of Pharmaceutical and Toxicological Chemistry

Daria N. Lutsenko

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute, a Branch of Volgograd State Medical University

Email: Lucenkodasha95@mail.ru

Russian Federation, Pyatigorsk

Postgraduate student, Department of Pharmaceutical and Toxicological Chemistry

Alexander A. Glushko

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute, a Branch of Volgograd State Medical University

Email: pharmachemistry@mail.ru

Russian Federation, Pyatigorsk

Candidate of Pharmaceutical Sciences, Senior Lecturer, Department of Inorganic, Physical, and Dispersoidology

References

  1. Альберт А., Сержент Е. Константы ионизации кислот и оснований / Пер. с англ. Е.Ю. Беляева, В.И. Зайонца, И.Я. Квитко, Б.В. Пассета, под ред. Б.А. Порай-Кошица. – Москва, Ленинград: Химия, 1964. – 380 c. [Albert A, Sergeant E. Konstanty ionizatsii kislot i osnovaniy. Transl. from Engl. E.Yu. Belyaev, V.I. Zajonts, I.Ya. Kvitko, B.V. Passet, ed. by B.A. Poray-Koshits. Moscow, Leningrad: Khimiya; 1964. 380 р. (In Russ.)]
  2. Федеральная электронная медицинская библиотека. Государственная фармакопея РФ. XIV издание. Т. IV. – М., 2018. – 1832 с. [Federal electronic medical library. The State Pharmacopoeia of the Russian Federation. XIV edition. Vol. IV. Moscow; 2018. 1832 р. (In Russ.)]. Доступно по: http://www.femb.ru/femb/pharmacopea.php. Ссылка активна на 09.09.2019.
  3. Патент РФ на изобретение RU № 2622638 C1. Петров В.И., Тюренков И.Н., Озеров А.А., и др. Производные хиназолин-4(3H)-она, обладающие нейро- и кардиопротекторной активностью. [Patent RUS No. 2622638 C1. Petrov VI, Tyurenkov IN, Ozerov AA, et al. Proizvodnye khinazolin-4(3H)-ona, obladayushchie neyro- i kardioprotektornoy aktivnost’yu. (In Russ.)]. Доступно по: https://yandex.ru/patents/doc/RU2622638C1_20170619. Ссылка активна на 14.09.2019.
  4. Шпрах З.С., Игнатьева Е.В., Ярцева И.В., и др. Разработка и валидация методики количественного определения цифетрилина в таблетках // Российский биотерапевтический журнал. – 2016. – Т. 15. – № 3. – С. 55–61. [Shprakh ZS, Ignat’yeva YeV, Yartseva IV, et al. Development and validation of cyphetrylin assay in tablets. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal. 2016;15(3):55-61. (In Russ.)]
  5. Ravichandran V, Shalini S, Sundram KM, Harish R. Validation of analytical methods strategies and importance. Int J Pharm Pharm Sci. 2010;2:18-22.

Supplementary files

Supplementary Files Action
1.
Structural formula VMA-13-15

Download (16KB) Indexing metadata

Statistics

Views

Abstract - 20

PDF (Russian) - 10

Cited-By


PlumX

Dimensions

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2020 Kompantseva E.V., Lutsenko D.N., Glushko A.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies