Development of the method for spectrophotometric quantitative determination of the total flavonoids in Bupleurum multinerve herb

Full Text

Введение

Володушка многожилковая (в. многожильчатая) — Bupleurum multinerve DC. семейства сельдерейных Apiaceae — многолетнее травянистое растение высотой 15–90 см. Листья прикорневые удлиненно ланцетные, стеблевые сидячие яйцевидные, у основания расширенные, стеблеобъемлющие. Цветки пятимерные с желтым венчиком мелкие, собраны в сложные зонтики, у зонтичков обертки крупные лимонно-желтого цвета с заостренной верхушкой, плоды — вислоплодники [1].

B. multinerve имеет дизъюнктивный ареал. Встречается на опушках лесов, в степных и высокогорных лугах в Европейской части России, южных районах Сибири, Монголии [1, 5].

В надземных органах B. multinerve, произрастающей в Западной Сибири и Бурятии, установлено содержание флавоноидов изорамнетина, кверцетина, рутина, нарциссина, кемпферола, изокверцитрина, изорамнетин-3-О-глюкозида [3, 5]. В надземных органах B. multinerve флоры Бурятии исследовались фенилпропаноиды. Установлено содержание 3-О-кофеилхинной кислоты 0,97 мг/г, 1,3-ди-О-кофеилглицерина 0,08 мг/г 5-О-кофеилхинной кислоты 0,57 мг/г, в стеблях содержалась 4-О-кофеилхинная кислота 0,41 мг/г и 1,3-ди-О-кофеилхинная кислота 0,17 мг/г [6].

Биологически активные вещества, преимущественно флавоноиды, B. multinerve обладают P-витаминной активностью и растение применяется при отеках сосудистого происхождения, капилляротоксикозах, а также как желчегонное, противовоспалительное [4].

Качество сырья B. multinervis herba регламентируется нормативным документом ВФС 42-580-76. Документ не соответствует современным требованиям к фармакопейным статьям. Во вводной части статьи указывается, что сырье предназначено для получения препарата Буплерина (в настоящее время препарат не выпускается). В раздел «Количественное определение» включен хроматоспектрофотометрический метод, предусматривающий экстракцию сырья 95 % этиловым спиртом при настаивании в течении 24 ч с последующей исчерпывающей экстракцией этим же растворителем. Далее после концентрирования извлечения проводят количественно разделение флавоноидов методом бумажной хроматографии в системе уксусная кислота 85 % – муравьиная кислота – вода (10 : 2 : 3) (время разделения 24 ч). Хроматограмма после высушивания обрабатывается 10 % спиртовым раствором алюминия хлорида. Пятна флавоноидов вырезают и элюируют 95 % этиловым спиртом, измеряют оптическую плотность при 420 нм. Расчет процентного содержания проводят по калибровочному графику, построенному по рутину. Недостатки методики: длительность исполнения, измерение оптической плотности при 420 нм флавоноидов в комплексе с хлоридом алюминия. Расчет процентного содержания проводят по рутину без добавления хлорида алюминия.

Приведенные данные указывают на необходимость совершенствования методики количественного определения флавоноидов в сырье B. multinerve для включения в фармакопейную статью.

Целью работы является разработка и валидация методики количественного анализа суммы флавоноидов в сырье Bupleurum multinerve herba.

Материалы и методы

Исследования проведены на образцах сырья B. multinerve, собранных в период массового цветения в южных районах Прибайкалья в 2018–2019 гг. Надземные органы B. multinerve срезали и сушили воздушно-теневым способом. Абсолютная влажность сырья составляла 9,8 %. Спектральные исследования проводили на спектрофотометрах LEKI SS 1207 и СФ-2000 в кварцевых кюветах (1 см). Стандартный образец рутина соответствовал ФС 42-2508-87. Статистический анализ проводили при доверительной вероятности p = 95 % по ГФ XIV [2].

Результаты и обсуждение

Спиртовое извлечение из B. multinerve травы имеет в электронном спектре основные максимумы поглощения при 350 и 264 нм. В дифференциальном спектре спиртового извлечения в присутствии алюминия хлорида максимум поглощения длинноволновой части спектра смещается до 412 нм. Дифференциальный спектр извлечения B. multinerve совпадает с дифференциальным спектром рутина, который выбран нами в качестве стандартного образца (СО).

Экспериментальные данные показали, что оптимальным экстрагентом является 40–60 % этиловый спирт. Для полноты экстракции достаточно использование 40 % этилового спирта (табл. 1).

 

Таблица 1. Содержание суммы флавоноидов в зависимости от условий экстракции сырья B. multinerve / Table 1. The content of the total flavonoids depending on the conditions of extraction of raw material of B. multinerve

Условия эксперимента	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье, %
Экстрагент
Спирт этиловый 20 %	2,25 ± 0,05
» » 30 %	3,23 ± 0,08
» » 40 %	3,37 ± 0,09
» » 50 %	3,36 ± 0,05
» » 60 %	3,37 ± 0,03
» » 70 %	3,10 ± 0,05
» » 80 %	2,84 ± 0,03
» » 90 %	1,53 ± 0,01
» » 96 %	1,24 ± 0,01
Размер частиц сырья, мм
5	1,34 ± 0,03
3	2,88 ± 0,04
2	3,37 ± 0,05
1	3,38 ± 0,08
0,5	3,25 ± 0,05
Соотношение сырье : экстрагент
1 : 25	1,77 ± 0,02
1 : 30	1,92 ± 0,02
1 : 50	2,74 ± 0,06
1 : 100	3,38 ± 0,05
1 : 150	3,36 ± 0,09
Время экстракции (однократная экстракция), мин
45	2,64 ± 0,03
60	3,35 ± 0,06
90	3,36 ± 0,05
Кратность экстракции
2 раза 1 : 50	3,25 ± 0,08
3 раза 1 : 50	3,35 ± 0,06

Примечание. Жирным шрифтом выделена максимальная экстракция флаваноидов при соответствующих условиях экстракции.

Note. The maximum extraction of flavanoids under the appropriate extraction conditions is highlighted in bold.

 

Степень измельченности сырья влияет на процесс экстракции биологически активных веществ, максимальное количество флавоноидов B. multinerve извлекается при размере частиц 1–2 мм. Однократная экстракция в течение 60 мин на кипящей водяной бане при соотношении сырье – экстрагент 1 : 100 соответствует исчерпывающей экстракции.

При аликвоте извлечения в количестве 2 мл оптимальное количество 2 % хлорида алюминия, необходимое для образования комплекса 1 мл. Стабилизация комплекса наблюдается через 45 мин и сохраняется до 1,5 ч.

Методика количественного определения суммы флавоноидов. Точную навеску сырья около 1,0000 г, измельченного до частиц размером 1 мм, помещают в колбу объемом 250 мл и прибавляют 100 мл 40 % этилового спирта, колбу присоединяют к обратному холодильнику. Экстракцию проводят на кипящей водяной бане в течение 1 ч, извлечение охлаждают и фильтруют через бумажный фильтр, при этом отбрасывают первые 10 мл фильтрата.

В 2 мерные колбы объемом 25 мл помещают по 2 мл фильтрата. В первую колбу добавляют 1 мл 2 % спиртового раствора хлорида алюминия и доводят до метки 96 % этиловым спиртом. Во вторую колбу (раствор сравнения) добавляют 0,1 мл 30 % раствора уксусной кислоты и доводят до метки 96 % этиловым спиртом. Измерение оптической плотности проводят через 45 мин на спектрофотометре при длине волны 412 нм.

Приготовление раствора СО рутина. Испытуемый раствор: 1 мл СО рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 2 % спиртового раствора хлорида алюминия и доводят колбу до метки 96 % этиловым спиртом. Раствор сравнения: 1 мл СО рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 0,1 мл 30 % раствора уксусной кислоты и доводят до метки 96 % этиловым спиртом. Оптическую плотность измеряют через 45 мин при длине волны 412 нм.

Содержание суммы флавоноидов рассчитывают по формуле (1):

$X=\frac{D·m_0·V_1·V_2·V_3·100·100}{D_0·m·V_4·V_5·V_6·(100-W)}=\frac{D·m_0·100·100}{D_0·m·(100-W)},$ (1)

где V₁ — объем извлечения, 100 мл; V₂ — объем разведения извлечения, 25 мл; V₃ — аликвота раствора СО рутина, 1 мл; V₄ — аликвота извлечения, 2 мл; V₅ — объем разведения СО рутина, 25 мл; V₆ — объем СО рутина, 50 мл; m — масса сырья, г; m₀ — масса рутина, г; W — абсолютная влажность сырья, %.

Примечание. Приготовление СО рутина. Около 0,0250 г рутина помещают в мерную колбу объемом 50 мл и добавляют 30 мл 96 % этилового спирта, нагревают на водяной бане до растворения и охлаждают. Далее раствор доводят до метки 96 % этиловым спиртом.

Допускается в расчетах использование удельного показателя поглощения комплекса рутина с хлоридом алюминия по формуле (2):

$X=\frac{D·100·25·100}{E_{1см}^{1\%}·m·2·(100-W)},$ (2)

где D — оптическая плотность извлечения; $E_{1см}^{1\%}$— удельный показатель поглощения рутина с AlCl₃ при λ = 412 нм в 96 % этиловом спирте, равный 258; m — навеска сырья, г; W — абсолютная влажность сырья, %.

Статистический анализ результатов количественного определения показал, что относительная ошибка среднего результата составляет ±3,20 % (табл. 2).

 

Таблица 2. Метрологические характеристики метода анализа флавоноидов в сырье B. multinerve / Table 2. Metrological characteristics of the method of analysis of flavonoids in raw material of B. multinerve

f	$\overline{X}$, %	S	S$\overline{X}$	P, %	t (P, f)	$∆\overline{X}$	$\overline{E}$, %
8	3,39	0,14111	0,04704	95	2,31	±0,11	±3,20

 

Опыты с добавками СО рутина в трех концентрациях показали, что относительная ошибка находится в пределах относительной ошибки методики, что указывает на отсутствие систематической ошибки предлагаемой методики (табл. 3).

 

Таблица 3. Результаты опытов с добавками рутина к извлечению из B. multinerve / Table 3. Results of experiments with the addition of rutin to the extraction from B. multinerve

Содержание суммы флавоноидов в аликвоте, мкг	Количество стандартных образцов рутина, добавленных к аликвоте, мкг	Рассчитанное количество суммы флавоноидов, мкг	Найдено суммы флавоноидов, мкг	Ошибка
				абс., мкг	отн., %
339,11 339,11 339,11	20 20 20	359,11 359,11 359,11	362,70 348,12 364,85	+3,59 –10,99 +5,74	1,00 3,06 1,60
339,11 339,11 339,11	40 40 40	379,11 379,11 379,11	384,10 386,15 375,28	+4,99 +7,04 –3,83	1,32 1,86 1,01
339,11 339,11 339,11	80 80 80	419,11 419,11 419,11	425,80 402,44 402,15	+6,69 –12,67 +6,96	1,60 3,02 1,66

 

Разработанной методикой проанализировано 5 партий сырья B. multinerve, содержание суммы флавоноидов составляло от 2,65 ± 0,08 до 3,38 ± 0,05 %. Предложена норма содержания суммы флавоноидов «не менее 2 %».

Исследование линейности методики проводили с использованием СО рутина в концентрациях от нормируемого значения 100 %, а также 50, 75, 125, 150, 175 %.

Аналитическая область методики находится в переделах концентрации рутина (в измеряемом объеме) 8,67–26,08 мкг/мл.

Линейность методики подтверждается графиком зависимости оптической плотности от концентрации рутина (см. рисунок). Коэффициент корреляции составляет 0,99988 (допускается | r | ≥ 0,98) [2], график описывается уравнением y = 0,0230 ∙ x + 0,0002.

 

Рисунок. График линейной зависимости оптической плотности рутина от его концентрации в измеряемом растворе / Figure. Graph of the linear dependence of the optical density of rutin on its concentration in the measured solution

 

Правильность методики подтверждена в опытах с рутином в концентрациях 75, 100, 125 и 150 % нормируемого значения. Средний процент восстановления при 3-кратной повторности для каждой концентрации составил 102,39 %.

Прецизионность методики оценивали по величине RSD (относительное стандартное отклонение) и критерию Стьюдента (t). Величина RSD в опытах в разные дни не превышала 2,32 %, в двух разных лабораториях была не более 2,76 %. При этом экспериментально найденный коэффициент Стьюдента меньше табличного. Изучение электронного спектра измеряемого раствора B. multinerve и СО рутина показало их совпадение при длине волны 412 нм, что свидетельствовало о специфичности методики.

Заключение

Разработана методика спектрофотометрического количественного определения суммы флавоноидов в сырье Bupleuri multinervis herba для включения в новую редакцию фармакопейной статьи на данный вид сырья. Валидационная оценка показала соответствие предлагаемой методики критериям: правильность, линейность, прецизионность, специфичность. Рекомендуемая норма содержания суммы флавоноидов — не менее 2 %.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Svetlana A. Petukhova

Irkutsk State Medical University

Author for correspondence.
Email: lanapetukhova@gmail.com

Candidate of Pharmaceutical Sciences, Senior Lecturer, Department of Pharmacognosy and Pharmaceutical Technology

Russian Federation, Irkutsk

Alina A. Posokhina

Irkutsk State Medical University

Email: alinapos@yandex.ru

Applicant of the Department of Pharmacognosy and Pharmaceutical Technology

Russian Federation, Irkutsk

Vera M. Mirovich

Irkutsk State Medical University

Email: mirko02@yandex.ru

Doctor of Pharmaceutical Sciences, Head of the Department of Pharmacognosy and Pharmaceutical Technology

Russian Federation, Irkutsk

References

Supplementary files