THE STUDY OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF THE HERB ASTRAGALUS GLYCYPHYLLUS L

Full Text

Введение Среди всех известных современной медицине недугов, которым с момента своего существования подвержено человечество, самыми пугающими на сегодняшний день являются онкологические заболевания. Несмотря на высокий уровень развития современной науки и медицины, до сих пор в точности не установлены причины их возникновения и нет единой концепции профилактики злокачественных новообразований в организме. Многочисленные исследования указывают на тот факт, что причиной возникновения и развития многих заболеваний, в том числе и онкологических, зачастую становятся свободные радикалы, которые запускают цепные реакции, приводящие к повреждению клеток и тканей, их преждевременному старению. Все живые организмы обеспечивают клетки энергией и кислородом за счет постоянно протекающих реакций окисления и восстановления. В нормальных условиях эти процессы находятся под жестким контролем различных регуляторных систем, что позволяет поддерживать равновесие между скоростью образования продуктов окисления и активностью антиокислительных факторов [9]. При нарушении этого хрупкого равновесия ускоряется протекание свободно-радикальных процессов, и, как следствие, в клетках накапливаются продукты перекисного окисления. Предупредить это разрушающее действие свободных радикалов на организм могут антиоксиданты, действующие на клеточном уровне. Эти биологически активные соединения снижают интенсивность перекисного окисления липидов и первыми вступают в реакции со свободными радикалами, образующимися в процессе жизнедеятельности организма, если естественные механизмы их нейтрализации не справляются с этой задачей [8]. При этом наиболее активными и безопасными для человека являются антиоксиданты природного происхождения, поэтому в настоящее время способность инактивировать свободные радикалы можно назвать одной из важнейших характеристик фармакологической активности лекарственных растений. Как правило, данный показатель связан с присутствием в растениях таких соединений, как флаво-ноиды, гидроксикоричные кислоты, дубильные вещества, витамины. Присутствие данных групп биологически активных веществ в траве астрагала солодколистного позволяет предположить наличие у фитокомплексов исследуемого растения антиоксидантной активности [7], тем более что опыт народной медицины свидетельствует об эффективности применения извлечений из травы астрагала солодколистного при заболеваниях сердечнососудистой системы, верхних дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта в качестве противовоспалительных, мочегонных, гастропротекторных и гиполипидемических средств. Комплекс биологически активных веществ растения улучшает работу иммунной системы, повышает резистентность организма, регулирует обменные процессы [7]. Цель нашего исследования - определение антиоксидантной активности извлечений из травы астрагала солодколистного (Astragalus glycyphyllus L.). Материалы и методы В качестве объекта исследования была выбрана трава астрагала солодколистного, которая была заготовлена в период массового цветения растения в Курской области в 2017-2018 гг. Траву предварительно высушивали до воздушно-сухого состояния, после чего измельчали и использовали для получения извлечений. Известно несколько методик определения антиоксидантной активности в растительном сырье: метод добавления содержащих антиоксиданты образцов в модельную реакцию окисления, хемилюминесцентный, спектрофотометрический, амперометрический и др. [2, 3, 5, 10]. Для получения наиболее достоверных результатов изучение антиоксидантной активности извлечений из травы астрагала солодколистного проводили двумя методами: по методике, основанной на химической реакции между калия перманганатом и биологически активными веществами восстанавливающего характера, содержащимися в извлечениях из исследуемого растения [2, 5], и путем спектрофотометрии свободных радикалов, основанной на реакции взаимодействия ДФПГ (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (С18Н12^О6, М = 394,33)), растворенного в спирте, с антиоксидантами, содержащимися в растительном сырье [3, 10]. Для изучения антиоксидантной активности первым методом готовили извлечения из травы астрагала солодколистного в соотношении 1 : 10 по фармакопейной методике [4]. Для того чтобы оценить влияние природы экстрагента на антиоксидантную активность получаемого извлечения, в качестве экстрагентов нами были выбраны вода очищенная и спирт этиловый в концентрации: 30, 50, 70 и 96 %. В качестве препаратов сравнения были использованы растворы кверцетина, цинаро-зида и рутина, известные своими антиоксидантными свойствами [5]. Свежепрокипяченную, охлажденную и очищенную воду, в количестве 8 мл, помещали в стакан вместимостью 50 мл, подкисляли 1 мл раствора кислоты серной 20 %, после чего прибавляли 1 мл раствора калия перманганата 0,05 Н. После тщательного перемешивания содержимое стакана титровали из микробюретки предварительно полученными извлечениями из травы астрагала солодколистного. Точку эквивалентности устанавливали по исчезновению розовой окраски титруемого раствора. Значения антиоксидантной активности были рассчитаны как величины, обратно пропорциональные объему извлечения из растительного сырья, пошедшего на титрование, в перерасчете на цинарозид, кверцетин и рутин (мг/мл) с заранее установленной антиоксидантной активностью [5]. Для того чтобы установить зависимость между содержанием в изучаемом растении фенольных соединений и антиоксидантной активностью, было установлено содержание флавоноидов и гидроксикоричных кислот. Для установления количественного содержания флавоноидных соединений в полученных извлечениях был использован метод спектрофотометрии. Оптическую плотность окрашенных комплексов флавоноидов с алюминия хлоридом измеряли при 405 нм, расчет содержания флавоноидов вели в пересчете на ги-перозид [6]. Определение содержания в траве астрагала солодколистного суммы гидрокси-коричных кислот было проведено методом прямой спектрофотометрии при длине волны 328 нм в пересчете на хлорогеновую кислоту [1]. Для исследования антиоксидантной активности методом спектрофотометрии свободных радикалов получали водно-спиртовое извлечение из травы астрагала солодколистного в соотношении 1 : 10, используя в качестве экстрагента спирт этиловый 70 %. Для этого 2,5 г (точная навеска) воздушно-сухого сырья помещали в колбу на 100 мл с притертой пробкой, прибавляли 25 мл спирта этилового 70 %, после чего нагревали в течение 1 часа на кипящей водяной бане с обратным холодильником. По истечении 1 часа колбу с полученным извлечением охлаждали при комнатной температуре, после чего фильтровали содержимое колбы через бумажный фильтр в мерную колбу на 25 мл и доводили объем до номинального соответствующим растворителем. Необходимое условие для расчета антирадикальной активности - установление оптической плотности извлечения, для чего полученный настой из травы астрагала солодколистного в объеме 2 мл разводили спиртом этиловым 96 % до объема 4 мл с последующим определением оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 517 нм на фоне спирта этилового 96 %. Для оценки антирадикальной активности использовали способность свободного стабильного радикала ДФПГ, растворенного в этаноле, реагировать с антиоксидантами, содержащимися в исследуемых образцах, в результате чего снижается интенсивность его пурпурно-синей окраски в растворе, а реакция контролируется по снижению оптической плотности методом спектрофотометрии при длине волны 517 нм [3]. Для протекания реакции к 2 мл исследуемого извлечения из травы астрагала солодколистного прибавляли 2 мл 0,5 мМ раствора 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (Sigma-Aldrich, США) в спирте этиловом 96 % и опреде- PHARMACY ФАРМАЦИЯ ляли оптическую плотность получившегося раствора на спектрофотометре СФ-2000 в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 517 нм через каждые 15 минут в течение 1 часа на фоне спирта этилового 96%. Каждый опыт был повторен 3 раза, доверительный интервал вычисляли статистическими методами с использованием коэффициента Стьюдента (доверительный интервал 0,95). Результаты и обсуждение В результате проведенных исследований было установлено, что все исследуемые извлечения из травы астрагала солодколистного обладают антиоксидантной активностью, однако в зависимости от используемого экстрагента ее значения различны (табл. 1, рис. 1). При этом прослеживается четкая зависимость между содержанием в извлечении фенольных соединений (гидроксикоричных кислот и флавоноидов) и величиной антиоксидантной активности. Максимальная антиоксидантная активность извлечений наблюдается, если в качестве экстрагента использовался спирт этиловый 70 %, им же извлекается и наибольшее количество флавоноидов и гидроксикоричных кислот. Наименьшая антиоксидантная активность установлена для извлечений, полученных с использованием спирта этилового 96 %, при этом содержание фенольных соединений в данных извлечениях также ничтожно мало (см. табл. 1). Известно, что фенольные соединения плохо извлекаются из растительного сырья водой очищенной, поэтому в данном случае более высокие показатели антиоксидантной активности при использовании в качестве экстрагента воды очищенной по сравнению с извлечениями на спирте этиловом 96 %, по-видимому, можно объяснить тем фактом, что водой, очищенной из травы астрагала солодколистного, извлекаются полисахариды и кислота аскорбиновая, ■■ Таблица 1 / Table 1 содержание суммы флавоноидов, % содержание суммы гидроксикоричных " кислот, % Экстрагент в перерасчете на рутин в перерасчете на цинарозид в перерасчете на кверцетин Вода очищенная 23,25 ± 0,55 23,09 ± 0,53 13,80 ± 0,32 0,137 ± 0,003 1,370 ± 0,062 Спирт этиловый 30 % 24,89 ± 0,65 24,71 ± 0,65 14,77 ± 0,38 0,174 ± 0,005 1,532 ± 0,066 Спирт этиловый 50 % 25,84 ± 0,78 25,65 ± 0,79 15,34 ± 0,46 0,183 ± 0,004 1,608 ± 0,071 Спирт этиловый 70 % 26,32 ± 1,18 26,13 ± 1,17 15,62 ± 0,70 0,196 ± 0,007 1,618 ± 0,066 Спирт этиловый 96 % 12,91 ± 0,32 12,82 ± 0,32 7,66 ± 0,19 0,025 ± 0,001 0,304 ± 0,014 30 25 20 15 10 ■ В перерасчете на рутин In terms of rutin Результаты изучения антиоксидантной активности извлечений из травы астрагала солодколистного методом титриметрии The results of the study of antioxidant activity of extracts from the herb Astragalus glycyphyllus L. by the titrimetry method E "2 2. x =c о 5 0 Cn _-o _\\J O4? V S’# A. -OO 3s- O4? V Cs O4? ' 4 >0" Q ■ В перерасчете на цинарозид In terms of cynaroside ■ В перерасчете на кверцетин In terms of quercetin <o <o <o <o- As 'N Q'/.V > J Экстрагент / Extragent рис. 1. Значения антиоксидантной активности извлечений из травы астрагала солодколистного в перерасчете на рутин, цинарозид и кверцетин при использовании различных экстрагентов Fig. 1 . Values of the antioxidant activity of extracts from the herb Astragalus glycyphyllus L. in terms of rutin, cynaroside and quercetin with the use of different extractants Результаты изучения антиоксидантной активности извлечений из травы астрагала солодколистного методом спектрофотометрии свободных радикалов Findings of antioxidant activity of extracts from the herb Astragalus glycyphyllus L. by means of free radical spectrophotometry method - Степень ингибирования радикалов Inhibition rate of radicals - Антиоксидантная активность Antioxidant activity Время протекания реакции, мин Reaction time, min время протекания реакции, мин степень ингибирования радикалов, % Антиоксидантная активность, % 15 50,49 ± 1,12 6,92 ± 0,09 30 62,43 ± 1,56 11,09 ± 0,75 45 66,61 ± 1,95 23,03 ± 1,08 60 67,02 ± 1,87 23,08 ± 1,05 % рис. 2. Антиоксидантная активность извлечений из травы астрагала солодколистного и степень ингибирования свободных радикалов в зависимости от времени протекания реакции fig. 2. Antioxidant activity of extracts from the herb Astragalus glycyphyllus L. and the degree of inhibition of free radicals, depending on the reaction time которые также проявляют антиокисдантные свойства (см. табл. 1, рис. 1). Наличие антиоксидантной активности в водно-спиртовых извлечениях из травы астрагала солодколистного также подтверждается результатами протекания реакции с ДФПГ. При этом прослеживается четкая закономерность между временем протекания реакции и антиоксидантной активностью: в течение 45 минут идет постепенное возрастание степени ингибирования радикалов и антиоксидантной активности, после чего эти показатели уже не изменяются (табл. 2, рис. 2). заключение Двумя методами: титриметрией, основанной на химической реакции между калия перманганатом и биологически активными веществами восстанавливающего характера, содержащимися в извлечениях из растительного сырья, и путем спектрофотометрии свободных радикалов, основанной на реакции взаимодействия антиоксидантов с ДФПГ, - проведено изучение антиоксидантной активности травы астрагала солодколистного. Выявлено, что наибольшей антиоксидантной активностью обладают извлечения, полученные с использованием в качестве экстрагента спирта этилового 70 %. Поскольку этим же экстрагентом извлекается максимальное количество фенольных соединений, можно сделать вывод о положительной корреляционной связи между содержанием в исследуемом растении фенольных соединений и величиной антиоксидантной активности. Также установлено, что для максимального ингибирования свободных радикалов антиоксидантными веществами, содержащимися в извлечениях из травы астарагала солодколистного, достаточно 45 минут. Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования травы астрагала солодколистного в качестве источника природных антиоксидантов. Конфликт интересов отсутствует.

About the authors

T. A Pozdnyakova

Orel State University I.S. Turgenev

Email: pozdnyakova.tatyana.72@mail.ru
Candidate of Pharmaceutical Sciences, Associate Professor, Department of Pharmacology, Clinical Pharmacology and Pharmacy, I.S. Turgenev Orel State University Orel, Russia

R. A Bubenchikov

Kursk State Medical University

Email: fg.ksmu@mail.ru
Doctor of Pharmaceutical Sciences, Associate Professor, Department of Pharmacognosy and Botany, Kursk State Medical University of the Ministry of Health of Russia Kursk, Russia

References

Supplementary files