Assessment of the applicability of primarily identified natural luminescent bacteria, isolated from the azov and the black seas, to determine the antimicrobial activity of antibiotics

Sergey L. Safronyuk; Сафронюк Сергей Леонидович; Vlada V. Samolyuk; Самолюк Влада Владимировна; Alena M. Milova; Милова Алена Михайловна; Yuliia Yu. Havrichenko; Гавриченко Юлия Юрьевна; Andrey M. Katsev; Кацев Андрей Моисеевич

doi:10.17816/2072-2354.2020.20.3.175-183

Assessment of the applicability of primarily identified natural luminescent bacteria, isolated from the azov and the black seas, to determine the antimicrobial activity of antibiotics

Authors: Safronyuk S.L.¹, Samolyuk V.V.¹, Milova A.M.¹, Havrichenko Y.Y.¹, Katsev A.M.¹
Affiliations:
1. Medical Academy named after S.I. Georgievsky of V.I. Vernadsky Crimean Federal University
Issue: Vol 20, No 5-6 (2020)
Pages: 175-183
Section: Pharmacy
URL: https://aspvestnik.ru/2410-3764/article/view/84541
DOI: https://doi.org/10.17816/2072-2354.2020.20.3.175-183
ID: 84541

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Five isolates of luminous bacteria from aquatic organisms of the Azov and the Black Seas were isolated. The study of morphological, cultural, physiological and biochemical properties showed that isolates M1 and M4 were the representatives of the species harveyi, and isolates Fb, Sh1, and B were the representatives of the species P. leiognathi. It was found that the strain P. leiognathi Sh1 was the most sensitive to zinc sulfate when studying its effect on allocated luminescent bacteria. The effective concentration that reduced the bioluminescent index (BLI) by 50% (EC₅₀) for zinc sulfate, when exposed to the test strain, was 4,0 ± 0,1 μg/ml. Experimental data allowed to consider the strain P. leiognathi Sh1 to be the test-object for determining the antimicrobial activity of benzylpenicillin, gentamicin, streptomycin, tetracycline and ceftriaxone. The results of evaluating the effect of antibiotics on the test object, revealed that after 15 minutes of incubation, the BLI values decreased by 50% only in samples containing benzylpenicillin, gentamicin, and tetracycline. Their EC₅₀ were 500.0, 283.0 and 28.5 μg/ml respectively. It was found that the exposure of test-strain to all antibacterial agents demonstrated resulted in decrease in BLI by 100% as compared to the control values. Strain P. leiognathi Sh1 can be used as a test-object for determining the antimicrobial activity of antibiotics.

Keywords

antibiotics, luminescent bacteria, Photobacterium leiognathi, Vibrio harveyi

Full Text

Введение

Биолюминесценция — одно из самых захватывающих и уникальных явлений живой природы. Способность живых организмов излучать видимый свет появилась в процессе эволюции [1]. Биолюминесценция широко распространена в морской среде, ее можно наблюдать у бактерий, беспозвоночных, рыб и пр. У бактерий данное явление проявляется в виде непрерывного свечения в присутствии кислорода при концентрации клеток, превышающих кворум-чувствительный уровень [2]. Интенсивность люминесценции зависит от большого количества внешних факторов, в частности, температуры, рН, степени аэрации, гидростатического давления, состава среды, воздействующих на метаболизм клеток и в целом на их структуру. Светящиеся бактерии — это самые маленькие источники биолюминесценции, способные излучать 10³–10⁴ квант/с · клетку [3–5]. Спектр эмиссии большинства люминесцентных бактерий характеризуется отдельной широкой полосой с пиком 490–495 нм. Благодаря таким особенностям биолюминесцентные бактерии являются перспективными тест-объектами в современных аналитических технологиях.

Высокая чувствительность и быстрая реакция на действие различных агентов делают биолюминесценцию бактерий эффективным инструментом для определения микроколичеств различных ингибиторов биологической активности [1]. В настоящее время, люминесцентные бактерии уже выступают во многих исследованиях в качестве биотестов, например, в токсикологии при мониторинге окружающей среды и в фармации для определения биологической активности и оценки антибиотических эффектов различных лекарственных препаратов [6–11]. Известно о различных биосенсорах на основе целых клеток, где в качестве биоматериала для сенсора применяют бактерии. Такой вид биосенсоров может предоставлять информацию, связанную с физиологией клеток, биологической и токсикологической активностью образца, что не позволяют определить биосенсоры на основе молекул. В целом, бактериальное тестирование обладает рядом преимуществ: простота использования, высокая чувствительность, быстрота реакции, относительная стабильность при изменении температур, низкие материальные затраты [12].

Цель исследования — провести первичную идентификацию и оценить применимость люминесцентных изолятов, выделенных из акваторий Азовского и Черного морей, в качестве биотестов для определения антимикробной активности антибиотиков.

Материалы и методы

В качестве объектов для выделения люминесцентных бактерий выступали гидробионты Азовского и Черного морей: европейский сарган (Belone belone), креветка обыкновенная (Crangon crangon), черноморская мидия (Mytilus galloprovincialis), каменный краб (Eriphia verrucosa), которые измельчали механическим путем. Образовавшиеся частицы, размером около 1 см³, помещали на поверхность плотных питательных сред (Nutrientagar, HiMedia M001, India) с 3 % натрия хлоридом (НПФ «Невский химик», Россия). Полученные системы термостатировали при 25 °C в термостате (ТСО-1/80 СПУ, Россия). Наблюдения за ростом посева проводили в темной комнате, через каждый час, до выявления сияющих зон в сине-зеленой области видимого спектра. Очистку светящихся микроорганизмов осуществляли с применением стандартных микробиологических методов [13]. Выделение чистых колоний люминесцентных изолятов проводили на основании однородности цвета, формы и размеров колоний, а также интенсивности их свечения.

Первичную идентификацию изолятов проводили по морфологическим и физиолого-биохимическим признакам. Морфологические признаки оценивали макроскопическими и микроскопическими методами. При этом изучали размер, цвет, форму, консистенцию, характер поверхности колоний, подвижность и окраску клеток по методу Грама, а также интенсивность их свечения.

Физиологические характеристики, такие как люминесценция, определяли, культивируя изоляты при 4, 25 и 37 °C в 1 мл жидкой питательной среды (Nutrientbroth, HiMedia M001, Индия), содержащей 3 % хлорида натрия, в течение 24 ч. Интенсивность люминесценции (I) измеряли на портативном люминометре Lumishot⁺ (ООО «НПП «Прикладные биосистемы», Красноярск, Россия).

Определение бактериальной цитохромоксидазы проводили при помощи готового коммерческого теста MICROLATEST Oxitest (Erba Lachema s.r.o., Чехия). Каталазную активность изолятов оценивали путем нанесения на чистую колонию, культивированную в течение суток, раствора 3 % перекиси водорода (ЮжФарм, Россия). Способность бактерий ферментировать различные субстраты, такие как глицерин, маннит, сахарозу, D-(+)-глюкозу, D-(+)-мальтозу, D-(+)-маннозу, D-(+)-лактозу (AppliChem, Германия) проводили с использованием рядов Гисса, где в качестве индикатора выступал бромтимоловый синий (АО «ЛенРеактив», Россия). Методика проведения исследований и интерпретации результатов описана в работе [14].

В качестве дополнительного параметра, при идентификации выделенных изолятов, использовали тип кинетики люциферазной реакции, характерный дифференциальный признак люминесцентных бактерий [15, 16]. Для этого проводили накопление биомассы клеток изолятов путем их культивирования в жидкой питательной среде в течение 24 ч. Полученную через сутки суспензию, центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин с применением высокоскоростной центрифуги (Microspin-12, Biosan, Латвия). Далее удаляли супернатант, а осадок суспендировали с 5 мл натрий-фосфатного буфера с pH 7,2 ± 0,1. После этого проводили разрушение клеток на ультразвуковом дезинтеграторе (Ultrasonic disintegrator, type UD-11, automatic, Techpan, Польша) и получали ферментный препарат, содержащий люциферазу выделенных изолятов. Оценку активности люцифераз проводили путем регистрации изменения светового сигнала системы, состоящей из 440 мкл натрий-фосфатного буфера с нейтральным значением pH, 10 мкл 0,1 % водно-спиртового раствора додеканаля (Fluka, Швейцария), 50 мкл полученного ферментного препарата и 500 мкл фотовостановленного флавинмононуклеотида (AppliChem, Германия), в кювете люминометра LumiShot⁺ [17].

Кинетические характеристики реакции окисления восстановленного флавинмононуклеотида при участии длинноцепочечного альдегида и полученных ферментных препаратов оценивали по константе скорости полузатухания люциферазной реакции (K_LR) (1).

K_LR = (ln (I_max) – ln (I_1/2)) / (T_max – T_1/2), (1)

где I_max — максимальное значение интенсивности люминесценции, I_1/2 — снижение интенсивности люминесценции в 2 раза от максимального ее значения, T_max — время достижения максимального значение интенсивности люминесценции, T_1/2 — время достижения снижения интенсивности люминесценции в 2 раза.

Выбор наиболее перспективного штамма для дальнейших исследований проводили по оценке их чувствительности к цинку сернокислому (АО «ЛенРеактив», Россия). Изучение действия цинка сульфата на тест-объекты проводили по методике ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.11-04. Для этого готовили исходный раствор, содержащий 0,175 мг/мл цинка сернокислого в дистиллированной воде. После, в кювету люминометра вносили от 850 до 899 мкл 3 % натрия хлорида, 50 мкл натрий-фосфатного буфера и от 1 до 50 мкл исходного раствора сульфата цинка. Далее систему выдерживали, в течение 15 мин при постоянном перемешивании, для оптимального распределения всех компонентов смеси. Затем вносили по 50 мкл бактериальной суспензии с концентрацией 1 · 10⁷ клеток/мл. Контрольный образец состоял из тех же компонентов, кроме раствора сульфата цинка, который заменили соответствующими объемами 3 % натрия хлорида. Результаты измерений выражали в виде биолюминесцентного индекса (БЛИ) в процентах, рассчитанного по формуле (2) [15]:

БЛИ = I_о/I_к · 100 %, (2)

где I_о — интенсивность люминесценции образца, содержащего антибиотик, I_к — интенсивность люминесценции контрольного образца.

Изучение применимости отобранного тест-штамма люминесцентных бактерий для определения антимикробной активности антибиотиков определяли путем оценки его чувствительности к бензилпенициллину (порошок для приготовления раствора для инъекций, ОАО «Киевмедпрепарат», Украина), гентамицину (раствор для инъекций, 40 мг/мл, ООО «Фармацевтическая компания «Здоровье», Украина), стрептомицину (порошок для приготовления раствора для инъекций, ОАО «Киевмедпрепарат», Украина), тетрациклину (порошок для приготовления раствора для инъекций, ЗАО «Агрофарм Научно-производственное предприятие», Россия) и цефтриаксону (порошок для приготовления раствора для инъекций, «Алембик Лимитед», Индия). Изучение действия антибиотиков на тест-объекты проводили по модифицированной методике ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.11-04. Для этого в кювету люминометра вносили 3 % раствор хлорида натрия в объеме от 750 до 845 мкл, 50 мкл натрий-фосфатного буфера (pH = 7,2 ± 0,1), 50 мкл жидкой питательной среды и от 5 до 100 мкл раствора антибиотика. Препараты бензилпенициллина, стрептомицина, тетрациклина гидрохлорида и цефтриаксона заранее разводили в дистиллированной воде для приготовления раствора с концентрацией 10 мг/мл. Гентамицин вносили без предварительного разведения дистиллированной водой. После чего полученную систему перемешивали на орбитальном шейкере OS-20 (Biosan, Латвия) в течение 10 мин. Затем к системе добавляли по 50 мкл бактериальной суспензии, которую готовили путем разведения ночной культуры 3 % раствором натрия хлорида до концентрации 1 · 10⁷ клеток/мл. Контрольный образец состоял из тех же компонентов, кроме растворов антибиотиков, которые заменили соответствующими объемами 3 % натрия хлорида. В качестве положительного контроля, ответственного за подтверждение нормального функционирования тест-объекта, выступала система, содержащая вместо антибиотика — цинк сернокислый 7-водный. Регистрацию светового потока проводили с применением биохемилюминометра БХЛ-06 (Нижний Новгород, Россия). Значение БЛИ рассчитывали по формуле (2).

Действие антибактериальных препаратов на люминесценцию бактерий оценивали путем определения эффективной концентрации антибиотика, снижающей БЛИ на 50 % (ЭК₅₀) через 15 мин и через 18 ч инкубации.

Обработка данных проводилась с помощью программы Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

В результате полевых испытаний, из акваторий Азовского и Черного морей, удалось выделить пять изолятов со стабильным свечением, которым присвоили кодовые названия (табл. 1).

Таблица 1. Данные о выделенных изолятах бактерий / Table 1. Data on isolated bacterial isolates

Кодировка штамма	Объект и место выделения	Размер колоний, мм
Fb	Belone belone, Черное море	1
Sh1	Crangon crangon, Азовское море	1,3
M1	Mytilus galloprovincialis, Черное море	2
M4	Mytilus galloprovincialis, Черное море	0,5
B	Eriphia verrucosa, Азовское море	0,7

В результате изучения морфологических свойств изолятов, установили, что их колонии характеризуются круглой формой, белым цветом, слизистой консистенцией, гладкой и выпуклой поверхностью с ровными краями. Изоляты М4 и В, в отличие от остальных выделенных бактерий, образовывали более мелкие (точечные) колонии с диаметром 0,5–0,7 мм (табл. 1) [18].

Микроскопия препаратов «висячая капля» показала, что все изоляты являются подвижными палочками. Изучение фиксированных мазков, окрашенных по Граму, позволило определить их принадлежность к грамотрицательным бактериям.

На основании критериев дифференцировки микроорганизмов семейства Vibrionaceae, удалось исключить принадлежность изолятов к видам Aliivibriofischeri, Aliivibriologei и Photobacterium phosphoreum, поскольку ни один из них не светился при +4 °C и не обладал желтым пигментом [19].

По результатам изучения биохимических свойств, которые представлены в табл. 2, установили, что только изолят M1 характеризовался наличием каталазной активности. Оксидазную активностью проявляли изоляты M1 и M4. Изолят M1 ферментировал все субстраты, кроме сахарозы и D-(+)-лактозы, а М4 не ферментировал только D-(+)-лактозу. Изолят B окислял четыре субстрата — глицерин, D-(+)-глюкозу, D-(+)-мальтозу и D-(+)-маннозу. Fb ферментировал три субстрата — глицерин, D-(+)-глюкозу и D-(+)-маннозу, а Sh1 —два сахара — D-(+)-глюкозу и D-(+)-маннозу.

Таблица 2. Физиологические и биохимические характеристики люминесцентных изолятов / Table 2. Physiological and biochemical characteristics of luminescent isolates

Штамм		Fb	Sh1	M1	M4	B
Каталазная активность		–	–	+	–	–
Оксидазная активность		–	–	+	+	–
Глицерин		+	–	+	+	+
Маннит		–	–	+	+	–
Сахароза		–	–	–	+	–
D-(+)-глюкоза		+	+	+	+	+
D-(+)-мальтоза		–	–	+	+	+
D-(+)-манноза		+	+	+	+	+
D-(+)-лактоза		–	–	–	–	–
Свечение при	4 °C	–	–	–	–	–
	25 °C	+	+	+	+	+
	37 °C	–	–	–	–	–
Интенсивность люминесценции (I) клеток, RLU		6,2 · 10⁴	1,1 · 10⁶	5,7 · 10⁴	2,5 · 10⁵	1,0 · 10⁶
Скорость полузатухания люциферазной реакции (K_LR), c^–1		0,55 ± 0,03	0,53 ± 0,05	0,06 ± 0,01	0,03 ± 0,01	0,34 ± 0,03

Примечание. «+» — наличие признака или ферментов, окисляющих субстрат; «–» — отсутствие признака или ферментов, позволяющих окислять субстрат.

Note. “+” presence of the feature or the enzyme which oxidize the substrate; “–” lack of the feature or the enzyme which oxidize the substrate.

Оценка активности ферментативных препаратов, содержащих люциферазу показала, что изоляты М1 и М4 имели медленный тип ферментативной кинетики с K_LR равными 0,06 и 0,03 с^–1 соответственно. Изоляты B, Fb и Sh1 обладали быстрым типом люциферазной кинетики с константами 0,34, 0,55 и 0,53 с^–1 соответственно, результаты представлены в табл. 2 и на рис. 1.

Рис. 1. Кинетика люциферазной реакции выделенных изолятов / Fig. 1. Kinetics of the luciferase reaction of isolates

Анализируя все полученные данные, была определена видовая принадлежность каждого изученного изолята. Так, M1 и M4 отнесли к виду Vibrio harveyi, а штаммы Fb, Sh1 и B — к виду Photobacterium leiognathi.

На следующем этапе работы, для оценки чувствительности люминесцентных бактерий к ингибиторам биологической активности, использовали водный раствор сульфата цинка в качестве стандартного токсического агента. Результаты проведенных исследований представлены на рис. 2.

Рис. 2. Влияние различных концентраций цинка сульфата на люминесценцию природных светящихся бактерий / Fig. 2. The effect of various concentrations of zinc sulfate on the luminescence of natural luminous bacteria

При расчете эффективных концентраций цинка сульфата, снижающих интенсивность свечения исследуемых тест-объектов на 50 %, установили, что ЭК₅₀ для штамма V. harveyi M1 составила 4,58 ± 0,1 мкг/мл, P. leiognathi Fb — 5,0 ± 0,3 мкг/мл, P. leiognathi Sh1 — 4,0 ± 0,1 мкг/мл, V. harveyi M4 — 5,1 ± 0,2 мкг/мл и P. leiognathi B — 5,3 ± 0,2 мкг/мл (рис. 2). Таким образом, из пяти изучаемых тест-объектов наиболее чувствительными оказались бактерии штамма P. leiognathi Sh1, это также подтверждают проведенные раннее исследования [10]. На основании вышеизложенных данных, оценку антибактериальных свойств лекарственных препаратов из группы антибиотиков проводили с использованием тест-штамма P. leiognathi Sh1.

В результате исследования действия растворов антибиотиков на P. leiognathi Sh1 через 15 мин установили, что ЭК₅₀ для бензилпенициллина, гентамицина и тетрациклина составили 500, 283,0 и 28,5 мкг/мл соответственно (рис. 3). Для стрептомицина и цефтриаксона, за данный промежуток времени ЭК₅₀ установить не удалось, поскольку они вызывали снижение биолюминесценции на 28,08 и 38,65 % соответственно, при концентрации антибиотика в пробе равной 1000 мкг/мл. В свою очередь, полученные результаты находят свое подтверждение в ранее проведенных исследованиях по оценке влияния антибиотиков на светящиеся бактерии [20].

Рис. 3. Действие растворов антибиотиков на тест-штамм P. leiognathi Sh1 через 15 мин инкубации / Fig. 3. The effect of antibiotic solutions on the test-strain P. leiognathi Sh1 after 15 minutes of incubation

Полученные результаты могут быть опосредованно или напрямую связаны с механизмом действия антибиотиков. Так, бензилпенициллин и цефтриаксон нарушают синтез пептидогликанов клеточной стенки и вызывает лизис микроорганизмов, что проявлялось в виде снижения БЛИ не более чем на 57,69 и 38,65 % соответственно через 15 мин биотестирования [21]. Гентамицин связывается с 30S субъединицей рибосом и нарушает синтез белка, а в бóльших концентрациях способен нарушать барьерную функцию цитоплазматической мембраны клетки, что сопровождалось снижением БЛИ на 96,15 % [21]. Снижение интенсивности биолюминесценции на 100 % при действии тетрациклина на тест-штамм может быть обусловлено механизмом действия, связанным с нарушением образования комплекса между транспортной РНК и рибосомой, что приводит к нарушению синтеза белка, а также высокой токсичностью препарата [21, 22].

Механизм действия стрептомицина заключается в том, что антибиотик проникает внутрь микробной клетки и нарушает образование инициирующего комплекса между матричной РНК и 30S субъединицей рибосомы [21]. В данном исследовании, при действии стрептомицина на бактериальную клетку, наблюдалось снижение значений БЛИ на 28,08 % от контрольных значений.

Затем провели оценку действия выбранных антибиотиков через 18 ч инкубации с тест-штаммом, поскольку такой подход обладает более высокой чувствительностью к биологическим эффектам исследуемых веществ [15]. В результате исследования действия растворов антибиотиков на P. leiognathi Sh1 через 18 ч установили, что все антибиотики снижали значения БЛИ на 100 % контрольных значений, данные представлены на рис. 4.

Рис. 4. Действие растворов антибиотиков на тест-штамм P. leiognathi Sh1 через 18 ч инкубации / Fig. 4. The effect of antibiotic solutions on the test strain P. leiognathid Sh1 after 18 hours of incubation

Таким образом, результаты исследований показывают чувствительность штамма P. leiognathi Sh1 к антибактериальным веществам, что проявляется в виде снижения БЛИ для тест-штамма при контакте со всеми антибактериальными агентами как через 15 мин, так и через 18 ч.

Учитывая низкие действующие концентрации антибиотиков, описанные в Государственной фармакопее РФ XIV издания [23], точные значения ЭК₅₀ рассчитать не удалось. Однако при сравнении аппроксимированных значений ЭК₅₀ для данных антибактериальных субстанций через 18 ч и их ЭК₅₀ через 15 мин установили, что для бензилпенициллина, гентамицина, тетрациклина, стрептомицина и цефтриаксона произошло снижение ЭК₅₀ от 2 до 40 раз.

В свою очередь, результаты проведенных исследований показывают чувствительность штамма P. leiognathi Sh1 к антибактериальным веществам, что проявляется в виде снижения БЛИ для тест-штамма при контакте со всеми антибактериальными агентами как через 15 мин, так и через 18 ч.

По результатам проведенных исследований показано, что морские природные биолюминесцентные бактерии идентифицированного штамма P. leiognathi Sh1 чувствительны к действию антибактериальных веществ и могут быть использованы в качестве биосенсора для оценки антимикробных свойств лекарственных препаратов, содержащих антибиотики.

Выводы

Из гидробионтов Азовского и Черного морей было выделено пять люминесцентных изолятов бактерий. По результатам оценки морфо-культуральных и биохимических свойств изолятов их удалось дифференцировать следующим образом: изоляты M1 и M4 были первично идентифицированы как представители вида V. harveyi, а Fb, Sh1 и B — представители вида P. leiognathi.

По результатам оценки чувствительности первично идентифицированных штаммов люминесцентных бактерий к действию цинка сульфата установили, что минимальное значение ЭК₅₀ = 4,0 ± 0,1 мкг/мл позволяет определить тест-штамм P. leiognathi Sh1 как наиболее чувствительный к действию «эталонного» токсиканта — цинка сернокислого. Полученные значения и анализ литературных данных позволили выбрать данный штамм в качестве тест-объекта для определения антимикробной активности антибиотиков.

При оценке действия антибиотиков на выбранный тест-штамм через 15 мин установили, что ЭК₅₀ для бензилпенициллина, гентамицина и тетрациклина составили 500, 283,0 и 28,5 мкг/мл, соответственно. А через 18 ч установили, что все антибактериальные препараты, при данных концентрациях, снижали значения БЛИ на 100 %.

Полученные данные способствуют расширению знаний в области бактериальной биолюминесценции и возможности использования природных светящихся бактерий в качестве тест-объектов при проведении биологических анализов лекарственных препаратов.

Финансирование. Исследование выполнено в рамках поддержанного программой развития ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского» гранта № ВГ19/2018 и проекта № И/2018/16.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.