PROLIFERATIVE ACTIVITY OF CHONDROBLASTS ON 3D CARRIER IN DIFFERENT CULTIVATION CONDITIONS

Full Text

Выращивание хондробластов на 3D-матрицах представляет особый интерес для регенеративной медицины. Создаваемые таким образом клеточноинженерные конструкции (КИК) могут быть использованы для лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний и посттравматических повреждений суставного хряща [4-6]. Чаще всего в процессе создания КИК хрящевой ткани используют CO2-инкубаторы, либо биореакторные системы, поддерживающие заданные параметры среды. Общепринятыми условиями культивирования клеток хрящевой ткани являются: температура 37°С, постоянная влажность, содержание в газовой среде CO2 - 5% и O2 - 21% [1, 2]. Проведённое ранее исследование хондробластов на 3D-носителе «Лиопласт®» в рамках космического и синхронного наземного экспериментов показало жизнеспособность и пролиферацию клеток в герметичных флаконах без воздушной прослойки в течение 3-х недель [3]. В настоящем исследовании оценивается возможность получения КИК хрящевой ткани на основе хондробластов человека и 3D-носителя «Лиопласт®» с помощью менее ресурсозатратной технологии, без использования CO2-инкубатора. Цель исследования: сравнить пролиферативную активность хондробластов человека на 3D-бионосителе «Лиопласт®» при культивировании в разных условиях: в вентилируемой пробирке при 5% CO2 и 37°C; в герметично закрытой пробирке при 37°C. Материалы и методы Посев культуры хондробластов на 3D-бионоситель. Культуру хондробластов из гиалинового хряща человека (патент РФ № 2627817 от 11.08.2017 г.) высевали на пористый 3D-носитель - аллогенную деминерализованную лиофилизированную спонгиозу «Лиопласт®» (патент РФ № 2366173 от 15.05.2008 г.). Согласно ТУ-9398-001-01963143-2004, данный носитель зарегистрирован как изделие медицинского назначения. Посевная доза: 5×104 клеток на носитель размером 3×3×3 мм. Клетки на носителе помещали в культуральную ёмкость объёмом 10 мл (по 2 КИК в каждую ёмкость). Для первого варианта культивации флакон заполняли 7 мл ростовой среды 199 (ООО «Биолот», Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Закрывали ёмкость крышкой с фильтром и ставили в CO2-инкубатор при 37°C, 5% CO2 и постоянной влажности. Для второго варианта полностью заполняли флакон полной ростовой средой, герметизировали и ставили в термостат при 37°C. Всего было подготовлено 30 флаконов с КИК (по 15 для каждого варианта культивирования). Флаконы с носителем без клеток служили контролем, для исключения фона от самого матрикса. Количество клеток на носителе через 2 часа после посева было принято за начальную точку, относительно которой наблюдали изменения через 1 и 7 суток эксперимента. Уровень пролиферации хондробластов определяли по количеству ДНК, выделенного из клеточных ядер. Определение ДНК. К опытному образцу добавляли 0,05%-й раствор азида натрия и протеиназу К для полного растворения материала. Центрифугировали с хлоридом натрия, отбирали супернатант, добавляли 96%-й этанол и ставили в морозильник на ночь. Процедуру промывки повторяли ещё 2 раза с использованием 70%-го этанола. К супернатанту добавляли 1хTNE и тщательно перемешивали. Все растворы от исходной пробы объединяли. В стеклянной химической пробирке смешивали 1хTNE и экстракт ДНК. Добавляли равный объём приготовленного флюорогена и производили регистрацию флюоресценции на микропланшетном ридере (Paul J.H. et al., 1982) [7]. Морфологическое исследование. Образцы фиксировали в 10%-м формалине, обезвоживали в спиртах восходящей крепости, затем заливали в парафин и изготавливали серийные срезы толщиной 7-10 мкм. Препараты окрашивали пикросириусом красным (Puchtler H. et al., 1973) [8]. Результаты исследования Через 2 часа после посева (необходимое время для прикрепления клеток) на 3D-носителе обнаружили 37,5 тыс. клеток, что составляет 37,5 % от посевной дозы. Далее измерения проводили в 2-х опытных группах (выращенные в СО2-инкубаторе и термостате) через 1 и 7 суток культивирования. Для статистического анализа полученных данных был применён U-критерий Манна-Уитни. Изменение считали статистически значимым при p≤0.05 (рис. 1). Через 1 сутки наблюдалась тенденция увеличения числа клеток относительно начального срока. Прирост клеток в СО2-инкубаторе составил 33%, а в термостате - 25,5%. Статистически значимое изменение количества клеток относительно контроля было зафиксировано на 7-е сутки культивирования. Прирост клеток составил 29,5% - в СО2-инкубаторе и 34% - в термостате, т.е. в СО2-инкубаторе прирост был меньше, чем в термостате, на 4,5%. При исследовании гистологических препаратов КИК во всех опытных группах выявлен локальный рост клеток на поверхности носителя в виде плотного монослоя (рис. 2). Б Рис. 2. Клетки, растущие монослоем на балках 3D-носителя: А - в CO2-инкубаторе, Б - в герметичном флаконе. 7 суток. Пикросириус красный. Ув. 400 Кроме того, как через 1, так и через 7 суток культивирования в обеих опытных группах имеются участки роста хондробластов в несколько слоёв (рис. 3). Клетки в монослойных участках, как правило, фибробластоподобные, встречаются клетки полигонной формы. Цитоплазма гомогенная. В ней можно выделить две зоны: центральную, оптически более плотную (эндоплазма), и периферическую, оптически менее плотную (эктоплазма). Ядро крупное, расположено в центре клетки и обычно имеет 1-2 ядрышка. В стратифицированных участках клеток полигональной формы становится больше. Такие клетки имеют 3-5 коротких отростков. Выводы Через 7 суток культивирования прирост в СО2-инкубаторе составил 29,5%, что на 4,5% меньше, чем в термостате (34%). Морфологические характеристики клеток, выращенных в разных условиях, не отличаются ни через сутки, ни через неделю культивирования. Таким образом, выращивание хондробластов на пористом 3D-матриксе «Лиопласт®» в течение 7 суток возможно в менее ресурсозатратных условиях - в термостате при 37°С.

About the authors

E I PUGACHEV

Samara State Medical University

Email: csrl.sam@mail.ru

References

Supplementary files