IDENTIFICATION OF LUMINOUS BACTERIA ISOLATED FROM THE BLACK AND THE AZOV SEAS

Full Text

Современным аналитическим подходам по обнаружению химических веществ свойственны такие недостатки, как: длительное время обнаружения, высокая стоимость оборудования и реагентов для анализа объектов, а также затрат на обучение и подготовку специализированного персонала [8]. Разработка и внедрение простого и недорогого скрининг-теста для быстрого анализа образца является одним из перспективных и востребованных направлений современных аналитических технологий. Так, методы с использованием биолюминесцентных тест-систем, соответствуют всем этим характеристикам и нашли широкое применение для обнаружения и изучения биологических свойств химических соединений [1]. Широкое использование светящихся организмов и тест-систем на их основе в последние десятилетия связано с тем, что биолюминесценция является общим показателем метаболизма клетки. Большое количество факторов, влияющих на рост, дыхание и биолюминесценцию клетки, может быть измерено посредством её регистрации [5]. Биолюминесценция представляет собой форму хемилюминесценции, генерируемой светящимися организмами, которые представлены большим количеством видов у 800 различных родов [1, 9]. Одни из самых известных представителей светящихся организмов - люминесцентные бактерии, большинство которых являются морскими представителями. Поскольку светящиеся бактерии приобрели разнообразные фенотипические признаки в ходе филогенеза, и как следствие, имеют различную чувствительность к химическим соединениям, поиск новых штаммов для анализа веществ различной природы представляет собой особый интерес. Цель исследования: изучение фенотипических особенностей люминесцентных бактерий, выделенных из Черного и Азовского морей, для их первичной идентификации. Методика исследования Выделение люминесцентных бактерий из акваторий Черного и Азовского морей проводили в летне-осенний период путем забора образцов воды и объектов морской фауны, таких как черноморская мидия (Mytilus galloprovincialis), бычок-кругляк (Neogobius melanostomus), морской двустворчатый моллюск (Cerastoderma lamarcki), бычок-кнут (Mesogobius batrachocephalus), креветка обыкновенная (Crangon crangon) и бычок песочник Neogobius fluviatilis pallasi. Отобранные пробы воды фильтровали через мембранные бактериологические фильтры (мембраны типа МФАС-ОС, диаметр пор = 0,22 мкм, ЗАО НТЦ «Владипор», Россия), а полученный биоматериал механически измельчали до кусочков размером 0,5 см. Подготовленные образцы помещали на плотные питательные среды (HiMedia M002, Индия) с 3% содержанием натрия хлорида (НПФ «Невский химик», Россия) и культивировали при температуре (t) +250C в течение 16-24 часов в термостате (ТСО-1/80 СПУ, Россия) [5]. Выросшую биомассу оценивали на наличие светящихся зон в темной комнате. В случае обнаружения таких областей из них выделяли и очищали светящиеся микроорганизмы при помощи комплекса стандартных микробиологических методов [2]. Изучение морфофизиологических и биохимических свойств микроорганизмов для их последующей дифференцировки проводили по основным фенотипическим признакам семейства Vibrionaceae [4]. Морфо-культуральные характеристики светящихся изолятов изучали визуально и при помощи световой микроскопии. На плотных питательных средах зрительно оценивали величину, форму, цвет, консистенцию, контур края, структуру и характер поверхности колоний. Изучение морфологии бактерий под микроскопом проводили в нативных и окрашенных по Граму препаратах [2]. Физиологические свойства изолятов оценивали температурным оптимумом роста при их культивировании на жидких питательных средах (HiMedia M001, Индия), содержащих 3% натрия хлорида, при +40С, +200С, +250С, +350С и +370С в течение 24 часов. Биохимические свойства бактерий оценивали с использованием сред Гисса по их способности ферментировать такие субстраты, как глицерин, D (+)-маннит, сахарозу, D (+)-глюкозу, D (+)-мальтозу, D (+)-маннозу и D (+)-лактозу (AppliChem, Германия), концентрация которых составила 0,5% в пробе [2]. Каталазную активность изучаемых изолятов оценивали по реакции культивированной в течение ночи колонии клеток на питательном агаре при нанесении на ее поверхность 0,01 мл 3% раствора перекиси водорода (AppliChem, Германия) [7]. Оксидазную активность изучали с помощью коммерческого теста (OXItest Mikrolatest, Erba Lachema s.r.o., Чехия). Тест-полоску смачивали 0,002 мл дистиллированной воды, после чего на индикаторную зону тест-полоски наносили исследуемую культуру клеток и через 0,5-1 мин наблюдали за изменением окраски. Одним из подходов для изучения биохимических свойств изолятов в работе использовали метод, основанный на определении типа кинетики люциферазной реакции [3]. Для этого проводили накопления биомассы бактерий путем их культивирования в 500 мл жидкой питательной среды при постоянном перемешивании в течение 24 часов. Полученную систему центрифугировали при 3000об/мин в течение 15 мин в ОПН-8, удаляя супернатант. Оставшуюся в виде осадка массу клеток суспендировали в 5 мл натрий-фосфатном буфере с pH = 7,2±0,1 и подвергали осмотическому лизису путем поочередного замораживания и оттаивания бактериальной суспензии. После трехкратного повторения данной процедуры вновь центрифугировали систему. Осаждение белков проводили ступенчатым насыщением полученного супернатанта аммонием сульфатом от 20 до 80% (НПФ «Невский химик», Россия). Кинетику затухания люциферазной реакции изучали в присутствии додеканаля (Fluka, Швейцария). Анализируемая система состояла из 0,05 мл 0,01% водно-спиртовой эмульсии альдегида, 0,5 мл натрий-фосфатного буфера с pH=7,2±0,1 и 0,05 мл ферментного препарата с экспериментально подобранной концентрацией. Инициацию реакции проводили быстрым введением 0,5 мл раствора 10-5 моль/л фотовосстановленного ФМНН2 (AppliChem, Германия), содержащего 10- моль/л ЭДТА (AppliChem, Германия). По полученным данным определяли время полузатухания (t1/2), по значениям которого рассчитывали константу скорости люциферазной реакции (KLR=1/t1/2) как? характерный систематический признак для люминесцентных бактерий [6]. Результаты исследования и обсуждение В результате полевых и лабораторных исследований удалось выделить десять образцов культур клеток со стабильным свечением, которым были присвоены кодовые названия. Данные о районах и объектах выделения, присвоенные кодировки десяти люминесцентным изолятам и наличие у них желтого пигмента представлены в таблице 1. Колонии выделенных бактерий на плотных питательных средах у всех изучаемых объектов характеризовались слизистой консистенцией, аморфной структурой, гладкой и выпуклой поверхностью с ровным краем в форме круга. При оценке размеров образующихся колоний после 24-часового культивирования микроорганизмов на питательном агаре все изоляты разделили на три группы: крупные колонии диаметром (d) от 5 мм и более образовывали бактерии с кодами C1, Wsh и Ms3; среднего размера (d = 3-5 мм) колонии характеризовались Sh1, M1, Fsh, F1, W2`, и мелкие и/или точечные колонии, для которых d≤3 мм, обладали изоляты Wy, Fy. При микроскопии нативных препаратов исследуемых бактерий установили, что все они подвижны и имеют палочковидную форму. При окраске изолятов по методу Грама их тинкториальные свойства соответствовали грамотрицательным бактериям. При культивировании выделенных изолятов в жидких питательных средах при t=+40С не удалось зарегистрировать свечения и увеличения биомассы клеток. В то же время в остальном диапазоне изучаемых температур микроорганизмы характеризовались наличием люминесценции и приростом общего числа клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что среди выделенных образцов нет представителей видов Vibrio logei и Photobacterium phosphoreum [1]. При изучении биохимических свойств выделенных чистых культур светящихся бактерий выявили их индивидуальные особенности по способности к ферментации заданных субстратов, а также по наличию каталазной и оксидазной активности, которые представлены в таблице 2. Сравнительный анализ результатов проведенных исследований позволил первично идентифицировать пять изолятов. Бактерий F1, Wsh и Fy в экспериментах по изучению ферментативных свойств окисляли маннит, глюкозу, D (+)-мальтозу и D (+)-маннозу, они обладали желтым пигментом и каталазной активностью, а также характеризовались люминесценцией и увеличением биомассы при температурах от +200С до +370С. Они не образовывали кислот и/или газа при наличии в пробах глицерина, сахарозы и D (+)-лактозы. Наличие всех этих признаков указывает на характерные фенотипические свойства такого вида, как A. fischeri. Изоляты с кодировкой Ms3 и W2` отнесли к виду V. Harveyi, поскольку они ферментировали все субстраты кроме лактозы, а также обладают каталазной и оксидазной активностью. У этих культур клеток не наблюдали желтого пигмента, а увеличение биомассы и люминесценции регистрировали в диапазоне t=+200С - +370С. Для первичной идентификации остальных изолятов провели проверку кинетических характеристик люцифераз, результаты которой представлены в виде графических зависимостей интенсивности свечения от времени на рисунке 1. По времени полузатухания люциферазной реакции рассчитали KLR, по значениям которой определили тип кинетики - характерный систематический признак для люминесцентных бактерий. Изоляты с кодом C1, Sh1, Wy, Fsh характеризовались быстрым типом кинетики, при KLR=0,75 с-, 0,83 с-, 0,51 с-, 0,52 с- соответственно, а изолят M1 - медленной кинетикой с показателем KLR=0,091с- [9]. Таким образом, изоляты с кодировкой Sh1, Wy, Fsh отнесли к виду P. Leiognathi, поскольку они ферментировали только глюкозу и маннозу, не обладали желтым пигментом и каталазной активностью, а также характеризовались KLR больше чем 0,5 с-. Изолят M1 окислял маннит, глюкозу, D (+)-мальтозу, D (+)-маннозу, обладал каталазной и оксидазной активностью, но не ферметировал сахарозу - один из основных субстратов вида V. harveyi [6]. При изучении кинетических свойств люцифераз KLR M1 составила 0,91с-. Совокупность данных показателей позволила предположить принадлежность изолята М1 к виду V. harveyi. Изолят С1 отнесли к виду A. Fischeri, поскольку при изучении ферментативных свойств он окислял только глюкозу, характеризовался KLR = 0,75 с- и положительным ответом в оксидазном тесте, а также содержал желтый пигмент. Заключение В результате отбора проб воды, рыбы, креветок и моллюсков из прибрежных зон Черного и Азовского морей, выделения из них светящихся микроорганизмов удалось получить десять стабильных, чистых образцов люминесцентных бактерий. При изучении морфологических особенностей, выделенных изолятов на плотных и жидких питательных средах выявлены отличия только в размере колоний и наличие желтого пигмента. Бактерии с кодом C1, Wsh и Ms3 образовывали колонии d ≥ 5 мм. Штаммы Sh1, M1, Fsh, F1, W2` характеризовались колониями, для которых d=3-5 мм, а d ≤ 3 мм обладали Wy, Fy. Скопления клеток изолятов C1, Fy, F1, и Wy имели желтый пигмент. Все выделенные изоляты характеризовались оптимумами роста при t от +20 до +370С, что явилось основанием для исключения их принадлежности к психрофильным видам V. logei и P. phosphoreum. Биохимические свойства исследуемых объектов имели следующие особенности: бактерии Ms3, W2`, Fsh, Wsh ферментировали глицерин. M1, F1, Wsh, Fy, Ms3, W2` расщепляли маннит и мальтозу, Ms3, W2` - сахарозу. Только C1 не ферментировал маннозу. Все изоляты окисляли глюкозу. Ms3, W2`, M1, Wsh обладали каталазной активностью, а Sh1, M1, Fsh, C1, F1, Wsh, Fy, Ms3 содержали оксиредуктазы. По результатам изучения скорости затухания люциферазной реакции в присутствии додеканаля быстрым типом кинетики характеризовались изоляты С1, Sh1, Wy, Fsh при KLR, равной 0,75 с-, 0,83 с-, 0,51 с-, 0,52 с- соответственно, а медленным типом - М1 с KLR = 0,091с-. По результатам проведенных исследований удалось первично идентифицировать все выделенные изоляты. Согласно таксономике люминесцентных микроорганизмов, к виду A. fischeri отнесли F1, Wsh, Fy и С1, к V. harveyi - Ms3, W2 и М1, а к P. leiognathi - Fsh, Sh1 и Wy. Конфликт интересов отсутствует.

About the authors

S L SAFRONYUK

V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: pharmalab01@mail.ru

E T SHARIPOV

V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: edemsharipov@gmail.com

A M KATSEV

V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: ketsev@mail.ru

References

Supplementary files