INVESTIGATION OF THE MORPHOLOGIOAL STATE OF THE OEREBELLAR OORTEX IN WHITE RATS AND THEIR BEHAVIORAL REACTIONS AFTER CRANIOCEREBRAL INJURY

Full Text

Введение Известно, что при черепно-мозговой травме (ЧМТ) в результате повреждения мозга в его паренхиме запускаются необратимые морфофункциональные дистрофические и некротические процессы, которые затем и определяют выраженность моторных и когнитивных нарушений в посттравматическом периоде [1-4, ■■ 6, 11]. Несмотря на работы многих исследователей в этой области, актуальность данной проблемы не снижается, поскольку нейродестабилизирующие патологии центральной нервной системы занимают одно из ведущих мест в структуре инвалидизации и смертности населения. Цель исследования - изучение состояния нервных клеток коры мозжечка головного мозга у половозрелых белых крыс-самцов после нанесения черепно-мозговой травмы, а также особенностей поведения крыс в тесте «Открытое поле». Материал и методы исследования В качестве биологического объекта использовали половозрелых белых беспородных крыс-самцов массой 200-250 г. Выбор белых крыс для проведения исследования объясняется тем, что они обладают сходным с человеком строением отделов и коры головного мозга. В эксперимент были включены 20 животных, содержащихся на общем режиме вивария. Контрольную группу составили 10 интактных животных. Опытную группу - 10 животных, которым наносилась черепно-мозговая травма легкой степени. Черепно-мозговую травму наносили путем свободного падения груза на голову (модель падающего груза). Травму наносили под общей анестезией. Масса груза составляла 50 г, высота падения - 100 см. До начала эксперимента животные содержались в пластиковых клетках размером 490 х 370 х 215 мм в стандартных условиях вивария. Двигательную активность и психоэмоциональное состояние животных оценивали по результатам изучения их поведения в тесте «Открытое поле». В «Открытом поле» крысы обследовались дважды, в течение 5 минут. «Открытое поле» представляло собой камеру 1 м в длину и 1 м в ширину, с высотой стенок 0,5 м, из белого пластика, дно которой было расчерчено на 25 равных квадратов. Освещение производилось лампой мощностью 100 Вт, подвешенной на высоте 1,5 м от дна камеры. Все процедуры, связанные с тестированием в «Открытом поле», проводились с 16.00 до 19.30. Крыс помещали в центр «Открытого поля» и засекали время выхода из центрального квадрата. Регистрировали следующие параметры: 1) горизонтальная двигательная активность (шт.) - количество пересеченных квадратов; 2) ориентировочная реакция (шт.) - количество вертикальных стоек; 3) исследовательская активность (шт.) - количество заглядываний внутрь отверстий «по глаза»; 4) фризинг - время неподвижности (сек.), рассматривается как симптом страха; 5) дефекация (шт.) - число болюсов помета и актов уринации во время тестирования, количество которых расценивается как показатель эмоциональной тревожности; 6) груминг (шт.) и его длительность (сек.) [5, 6]. Убой контрольных и опытных групп животных производили при помощи декапи-тации, в утренние часы, под наркозом смеси эфира с хлороформом (1 : 1). Опыты проводили в соответствии с приказами МЗ СССР № 755 от 12.08.77 и № 701 от 27.07.78, которые регламентируют обеспечение принципов гуманного обращения с животными. Для получения материала головного мозга с полости черепа ножницами срезали кожно-мышечные покровы, полностью обнажая костную ткань, затем щипцами откусывали шейные позвонки и затылочную кость, срезали ее. Подводя браншу кусачек (щипцов) под крышу черепа сбоку, откусывали теменно-височные кости с обеих сторон и снимали их. Открытый головной мозг приподнимали со стороны лобных долей кверху, перерезали зрительный тракт, поднимали мозг еще выше, подрезали с обеих сторон твердую мозговую оболочку, покрывающую мозжечок, нервы, и вынимали головной мозг, перерезая спинной мозг в шейном отделе. Разрезая оболочки, освобождали из ложа орган [7]. Для гистологического исследования мозжечок животных фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина на фосфатном буфере (фирма «Биовитрум», Санкт-Петербург), затем его подвергали промывке в проточной воде, обезвоживанию путем помещения исследуемого материала в спирты возрастающей концентрации и заливали в парафин по общепринятой методике. Изготавливали фронтальные срезы толщиной 5-7 мкм. Срезы помещали на предметные стекла и окрашивали крезиловым фиолетовым по методу Ниссля. Морфометрическое исследование проводилось на сериях срезов гистологических препаратов коры полушарий мозжечка в соответствии с его характеристикой. С помощью цифрового микроскопа Ахю Imаgеr. М2 с программным обеспечением для анализа изображений Ахю Vision SE64 Rel. 4.8.3 и ZEN 2011 проводилось измерение толщины слоев полушарий коры мозжечка (п = 100, об. 40; ок. 10). В этих же слоях, в четырех полях зрения, измерялись морфометрические параметры нейронов: площадь клетки, диаметры клетки, площадь ядра, диаметры ядра, с видимым ядрышком (п = 240, об. 100; ок. 10). Индекс удлиненности ядер клеток (Е) - частное от деления максимального диаметра ядра на минимальный диаметр ядра. Объемы тел нейронов и их ядер вычислялись по формуле объема эллипсоида вращения [8]. Концентрация нейронов вычислялась по формуле: К = х х 106/41 500 х п, где х - количество клеток (не менее 100), п - количество полей зрения (не менее 4), 41 500 - площадь каждого поля зрения, мкм2. Ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) рассчитывали по следующей формуле: ЯЦО = V ядра/V перикариона - V ядра, где V ядра - объем ядра, V перикариона - объем перикариона [9]. Полученные количественные данные обработаны с помощью общепринятых в медико-биологических исследованиях методов системного анализа, согласно современным требованиям к проведению анализа медицинских данных. Для статистической обработки полученных результатов применялся параметрический критерий КСтьюдента. Результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение (5). Критический уровень значимости р < 0,05 [10]. Результаты и обсуждение Морфологическое исследование показало, что у крыс, перенесших черепно-мозговую травму, отмечено отслоение мягких мозговых оболочек с признаками набухания за счет скопления массы эритроцитов. В перикари-онах коры мозжечка животных преобладали гидропические изменения. В осветленной нейроплазме таких нейронов обнаруживались губчатая пенистость и отдельные вакуоли, ядра обычно были измененной формы, осветленные. Также встречались гиперхромные нейроны с признаками пикноморфного набухания, либо сморщивающиеся, с плохо различимыми ядром и ядрышком. Обнаруживались нейроны с практически утратившимся ядром, «клетки-тени». Признаки гидропического набухания выявляли также в цитоплазме астро-цитов и олигодендроцитов. Увеличилось число нейронов с сателлитной глией. В результате черепно-мозговой травмы происходило уменьшение концентрации нейронов во всех слоях коры мозжечка, а именно: в молекулярном слое корзинчатых нейронов - на 42 %, звездчатых - на 26 %, клеток Пуркинье в слое клеток грушевидных - на 15 %, клеток зернистого слоя - на 23 % меньше по сравнению с контролем. Ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) корзинчатых нейронов уменьшилось на 26 %, звездчатых увеличилось на 200 %, клеток Пуркинье уменьшилось на 25 %, нейронов зернистого слоя также уменьшилось на 16 %. Толщина слоя коры мозжечка у опытных групп животных претерпевает следующие изменения: в молекулярном слое уменьшилась на 21 %, в слое клеток грушевидных нейроцитов увеличилась на 15 %, зернистого слоя уменьшилась на 62 % по сравнению с контролем (таблица 1). Коэффициент удлиненности ядра у корзинчатых нейронов составил 1,31, у звездчатых нейронов - 1,21, у клеток Пуркинье - 1,76, а у клеток-зерен составил 1,22. Морфофункциональные изменения у звездчатых нейронов претерпевал минимальный диаметр ядра, он увеличился на 23 %, средняя площадь ядра уменьшилась на 16 %, средний объем ядра увеличился в два раза. У корзинчатых нейронов минимальный диаметр уменьшился на 20,3 %. Средняя площадь клеток уменьшилась на 43 %, в 1,5 раза уменьшился средний объем клеток. Максимальный и минимальный диаметры ядра уменьшились соответственно на 22 и 21 %. Площадь ядра увеличилась на 21 %, объем ядра уменьшился почти в два раза (таблица 2). В слое клеток грушевидных нейроци-тов минимальный диаметр нейрона и ядра уменьшились на 15 %, площадь нейрона уменьшилась на 44,2 %, объем уменьшился в два раза. Площадь и объем ядра уменьшились на 25 и 19 % соответственно. Плотность клеток Пуркинье уменьшилась на 15 % и составила 145,93 ± 7,29 мкм2. Число нейронов с сателлитной глией увеличилось по сравнению с контролем на 16 %. В основном нейрон контактировал с одним глиоцитом, реже - с двумя-тремя. Общее количество глиальных клеток после черепно-мозговой травмы превышало контроль в 0,5 раза. Нейроглиальный индекс равен 3,08 ± 0,15. При исследовании зернистого слоя в опытной группе животных отмечено перемещение клеток-зерен в молекулярный слой. В нейронах преобладали гидропические изменения (таблица 3). Изучение поведения животных при нанесении черепно-мозговой травмы показало, что в посттравматический период они впадали в легкое бессознательное состояние. В течение нескольких минут животные оставались заторможенными, дезориентированными, вялыми. Затем в течение первого часа их состояние улучшалось. После посттравматического стресса горизонтальная двигательная активность экспериментальных животных по сравнению Количественные показатели молекулярного слоя коры полушарий мозжечка в норме и при черепно-мозговой травме (x ± sx) Quantitative indices of the molecular layer of the cortex of the cerebellar hemispheres in the norm and in craniocerebral trauma (x ± sx) Показатель, усл. ед. Корзинчатые нейроны молекулярного слоя Звездчатые нейроны молекулярного слоя К О К О Минимальный диаметр ядра, мкм 9,1 ± 0,04 7,2 ± 0,10* 5,9 ± 0,07 7,3 ± 0,11* Максимальный диаметр ядра, мкм 10,8 ± 0,09 8,4 ± 0,14* 8,3 ± 0,08 8,9 ± 0,14 Площадь ядра, мкм2 64,3 ± 3,21 78,0 ± 1,73* 50,6 ± 2,53 42,7 ± 0,55* Объем ядра, мкм3 469,3 ± 23,15 255,0 ± 12,8* 152,3 ± 7,64 248,2 ± 12,41* Минимальный диаметр клетки, мкм 12,1 ± 0,1 9,5 ± 0,16* 8,5 ± 0,08 8,3 ± 0,12 Максимальный диаметр клетки, мкм 14,5 ± 0,10 15,4 ± 0,16 10,8 ± 0,11 10,1 ± 0,11 Площадь клетки, мкм2 199,9 ± 9,95 114,83 ± 1,84* 69,9 ± 3,49 52,9 ± 1,00* Объем клетки, мкм3 1115,2 ± 55,75 727,4 ± 36,36* 408,9 ± 20,41 324,1 ± 18,21* Толщина слоя, мкм 320,3 ± 7,17 251,5 ± 5,97* Примечание: * различия в сравнении с контролем статистически значимы приp < 0,05. Таблица 2 / Table 2 количественные показатели слоя клеток грушевидных нейроцитов коры полушарий мозжечка в норме и при черепно-мозговой травме (x ± sx) Quantitative indices of a layer of cells of pear-shaped neurocytes of the cortex of the cerebellar hemispheres in the norm and in craniocerebral trauma (x ± sx) показатель, усл. ед. Клетки Пуркинье слоя клеток грушевидных нейроцитов Контроль Опыт Минимальный диаметр ядра, мкм 14,6 ± 0,43 12,3 ± 3,18* Максимальный диаметр ядра, мкм 22,4 ± 0,35 21,6 ± 4,37 Площадь ядра, мкм2 337,9 ± 7,63 188,5 ± 6,39* Объем ядра, мкм3 2493,3 ± 23,89 1710,2 ± 85,51* Минимальный диаметр клетки, мкм 21,9 ± 0,39 18,5 ± 5,99* Максимальный диаметр клетки, мкм 32,7 ± 0,32 36,8 ± 6,12 Площадь клетки, мкм2 732,9 ± 12,95 547,4 ± 16,85* Объем клетки, мкм3 8190,1 ± 81,89 6591,3 ± 65,91* Толщина слоя, мкм 40,1 ± 0,60 46,9 ± 0,59* Примечание: * различия в сравнении с контролем статистически значимы приp < 0,05. с контрольными снизилась на 33 % (р < 0,05). О снижении исследовательского компонента поведенческой активности свидетельствует уменьшение по сравнению с контролем исследований «норок», меньшее количество заходов в центральную зону теста соответ ственно на 17 % (р < 0,05) и 18 % (р < 0,05). Изменение эмоциогенного напряжения в ходе эксперимента нашло отражение в изменении количества стоек, продолжительности и частоты груминга, числа фекальных болюсов. Так, интенсивность кратковременного гру- Количественные показатели зернистого слоя коры полушарий мозжечка в норме и при черепно-мозговой травме (x ± sx) Quantitative indices of the granular layer of the cortex of the cerebellar hemispheres in the norm and in craniocerebral trauma (x ± sx) показатель, усл. ед. клетки-зерна зернистого слоя контроль опыт Минимальный диаметр ядра, мкм 7,6 ± 0,08 7,2 ± 0,08 Максимальный диаметр ядра, мкм 8,2 ± 0,08 8,8 ± 0,05 Площадь ядра, мкм2 43,9 ± 0,60 42,5 ± 0,98 Объем ядра, мкм3 247,4 ± 12,37 237,8 ± 11,93 Минимальный диаметр клетки, мкм 9,2 ± 0,07 9,3 ± 0,07 Максимальный диаметр клетки, мкм 10,9 ± 0,05 10,9 ± 0,07 Площадь клетки, мкм2 73,7 ± 0,71 73,4 ± 1,02 Объем клетки, мкм3 483,7 ± 24,19 493,4 ± 24,67 Толщина слоя, мкм 620,2 ± 29,66 236,4 ± 8,68* Примечание: * различия в сравнении с контролем статистически значимы приp < 0,05. Таблица 4 / Table 4 влияние черепно-мозговой травмы на поведение крыс-самцов в тесте «открытое поле» influence of craniocerebral trauma on the behavior of male rats in the “open field” test Экспериментальные группы (л = 10) поведенческие показатели, (M ± т) контроль черепно-мозговая травма Горизонтальная двигательная активность, шт. 18,0 ± 1,2 12,6 ± 0,63* Вертикальная двигательная активность, шт. 10,7 ± 1,4 7,5 ± 0,4* Исследование «норок», шт. 4,7 ± 0,7 3,9 ± 0,3* Кратковременный груминг, шт. 2,4 ± 0,1 3,0 ± 0,15* Кратковременный груминг, длительность (сек.) 54,63±3,2 72,75±7,82* Фекальные болюсы, шт. 0,6 ± 0,2 0,8 ± 0,2* Уринации, шт. 3,48 ± 0,6 3,95 ± 0,6* Фризинг, сек. 0 33* Примечание: * различия в сравнении с контролем статистически значимы приp < 0,05. ■■ минга возросла на 58 % (р < 0,05), количество фекальных болюсов увеличилось в 1,5 раза. Кроме того, были зафиксированы периоды «замирания» (фризинг) (таблица 4). заключение Анализ морфологического состояния нейронов слоев коры полушарий мозжечка головного мозга половозрелых белых крыс свидетельствует о том, что в условиях экспериментальной черепно-мозговой травмы (ЧМТ) в посттравматический период развиваются стойкие морфологические изменения нейронов коры полушарий мозжечка, что может быть причиной отклонения поведенческих реакций животных. Конфликт интересов отсутствует.

About the authors

O S Shubina

Mordovian State Pedagogical Institute n.a. M.E. Evsevev, Department of Biology, Geography and Teaching methods

Email: o.shubina@mail.ru
Doctor of Biological Sciences, Professor, Department of Biology, Geography and Teaching Methods Saransk

M V Egorova

Mordovian State Pedagogical Institute n.a. M.E. Evsevev, Department of Biology, Geography and Teaching methods

Email: egorowa.marina@mail.ru
Postgraduate student of Biological Sciences, Department of Biology, Geography and Teaching Methods Saransk

References

Supplementary files