Comparative assessment of bone tissue condition under the use of calcium hydroxyapatite and calcium Sandoz in experimental osteoporosis

Abstract

This study demonstrates a comparative analysis of the bone tissue condition using calcium hydroxyapatite and calcium Sandoz in experimental osteoporosis.

Full Text

Остеопороз - заболевание, характеризующееся потерей костной ткани с ухудшением ее микроархитектоники. Данные изменения приводят к хрупкости костной ткани и являются причиной переломов у больных при сравнительно незначительных нагрузках на костную ткань. Регенерационные потенции костной ткани при явлениях остеопороза резко снижены1. В настоящее время продолжается изучение патогенеза этого заболевания, а также поиск эффективных веществ для его коррекции. В ИЭМБ разработан и запатентован способ получения биологически активного вещества - кальция гидроксиаппатита (ГАП) из аллогенных костных тканей, который в свой состав включает кроме кальция и фосфора, ряд микроэлементов и органический компонент - в виде коллагеновых и неколлагеновых белков - регуляторов метаболизма костной ткани2. Моделирование остеопороза на животных является распространенным методом его изучения3. Для этой цели используют как мелких грызунов, так и крупных животных (собаки и овцы). Крысы с двусторонней овариоэктомией широко используются в качестве модели для имитации потери костной массы у женщин в постменопаузе4,5, что открывает возможность для изучения лечебного потенциала ГАП. Цель исследования: оценить возможности аллогенного гидроксиаппатита в сравнении с кальцием Сандоз для коррекции остеопороза, вызванного гипоэстрогенным состоянием в эксперименте. Материалы и методы исследования. Исследование выполнено на базе ИЭМБ (директор д.м.н., профессор Л.Т. Волова) СамГМУ (ректор академик РАН, профессор Г.П. Котельников) с соблюдением требований биоэтики. Эксперименты проведены с использованием самок крыс (n=50) стока Sprague Dawley SPF категории массой 180-200 г., которых содержали в условиях сертифицированного вивария. Все животные были разделены на 4 группы: первая - ложнооперированные (ЛО), у них (n=10) под общей анестезией (золетил+рометар) произведен стандартный доступ к яичникам с их иммобилизацией без овариоэктомии с последующим ушиванием операционной раны. Вторая (ОЭ) - группа животных, у которых произведена овариоэктомия (n=10), но на протяжении всего эксперимента не проводилось никакой медикаментозной коррекции состояния. В третьей группе (ОЭ+С) у животных (n=10) была произведена овариоэктомия и через 180 суток начато ежедневное введение препарата кальций Сандоз per os из расчета 200 мг/кг в течение 90 суток. В четвертой группе (ОЭ+ГАП) крыс (n=10) также была произведена овариоэктомия, а через 180 суток начато введение аллогенного гидроксиаппатита «Лиопласт» в/м в наружную поверхность бедра из расчета 200 мг/кг в течение 90 суток. С целью создания эктопического депо исследуемого вещества кратность введения составила 1 раз в 2 недели. Методика получения лабораторных образцов гидроксиаппатита (ГАП) заключалась в нейтрализации гидроокисью натрия образующихся после деминерализации костной ткани солянокислых растворов. Эвтаназию животных производили на 270 сутки от начала эксперимента путем внутрисердечного введения летальной дозы тиопентала натрия. После чего производили взвешивание животных (весы OHAUS NVL 2101). Во время секционного исследования производили осмотр и выделение матки с последующим ее взвешиванием (весы лабораторные ВЛ - 224В). У животных всех групп были выделены бедренные кости с обеих сторон, которые также подвергали взвешиванию с определением абсолютной и относительной массы кости. Каждую левую бедренную кость фиксировали в нейтральном 12% растворе формалина, декальцинировали по стандартной схеме с использованием раствора трилона Б и заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 7 мкм получали с использованием микротома (МС-2) и окрашивали их гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по Ван Гизон. Анализ полученных гистологических препаратов производили при помощи системы визуализации на базе микроскопа Olympus ВХ 41. Морфометрию структур выполняли после получения изображений с использованием программы «Морфология 5.2» (ВидеоТесТ г. Санкт-Петербург, Россия). При морфометрическом анализе оценивали: высоту суставного хряща, толщину трабекул, относительную плотность костной ткани, относительную плотность остеоцитов. Относительное содержание кальция в костной ткани определяли путем вычисления соотношения массы нативной бедренной кости к массе кости после полной декальцинации. Правые бедренные кости экспериментальных животных всех групп подвергали механическим испытаниям на четырехточечный изгиб и сдавливание на универсальной испытательной машине (Instron). При этом была изготовлена специальная оснастка, представляющая собой неподвижную опору вверху с регулируемым расстоянием между пластинами и нагружающее устройство с «качающимся» коромыслом. Нагружающее устройство закрепляли в подвижном траверсе испытательной машины. Загружение осуществляли в «жестком» режиме, т.е. с фиксированным шагом перемещений подвижной (верхней) опоры со скоростью 1 мм/мин. Все полученные экспериментальные данные были проанализированы с помощью описательной статистики с применением программы Статистика 10.0. Для групповых значений определяли средние значения (M) показателей и ошибку среднего (m). Оценка статистической значимости различий при межгрупповых сравнениях производили по двухвыборочному t-тесту Стьюдента. Полученные результаты считали достоверными при р<0,05. Результаты исследований и их обсуждение. На 270 сутки эксперимента масса тела животных в группе ОЭ увеличилась на 142% (р<0,05) по сравнению с группой ЛО. При лечении животных препаратом «кальций Сандоз» увеличение массы составило 136% (р<0,05), а в группе ОЭ+ГАП - 130% (р<0,05). Изменения со стороны матки были различными и определялись группой наблюдения. Так у ЛО матка представляла собой типичное строение с четким разделением на два рога и нормальным анатомическим положением. Яичники без изменений. В группах ОЭ; ОЭ+С; ОЭ+ГАП матку определяли в виде нитчатой двурогой структуры с признаками выраженной атрофии. В месте ранее выполненной овариоэктомии - выраженное разрастание жировой ткани6. Так в группе ЛО средний вес матки составил - 0,907г (р<0,05); у ОЭ - 0,135г (р<0,05); у ОЭ+С - 0,131г (р<0,05); ОЭ+ГАП - 0,119г (р<0,05). Изменения абсолютной и относительной масс бедренной костей крыс в группах представлено в таблице 1. При гистологическом исследовании микропрепаратов, полученных из головки бедренной кости ЛО животных отмечали ее нормальную гистологическую структуру. Суставной хрящ не изменен и имел типичное трехслойное строение. Высота суставного хряща 275,6+39,7.Трабекулы эпифиза хорошо выражены, не истончены. Средняя толщина трабекул составила 129+9,4 мкм. Относительная плотность костной ткани - 1059,7+174. Относительная плотность остеоцитов - 206+18. Эпифизарная пластинка не изменена (рис. 1). В группе ОЭ животных суставной гиалиновый хрящ истончен, толщина его 142+21,3 мкм. Хондроциты, формирующие его структуру с явлениями выраженной дистрофии. Трабекулы деформированы, утолщены. Средняя толщина трабекул составила 151+23 мкм. Остеоциты в их структуре различные по величине с базофильными ядрами и цитоплазмой. Относительная плотность их составила 481+26 мкм. Гаверсовы каналы резко расширены. Преобладают признаки выраженного остеоцитарного остеолиза. Остеокласты единичные. Межтрабекулярное пространство заполнено костным мозгом, встречаются очаги жировой дегенерации. Относительная плотность костной ткани 850,3+33,3 (рис. 2). Гистологическое исследование костной ткани в группе ОЭ+С показало, что гиалиновый хрящ с выраженными признаками дегенеративных изменений, высота его составила 139+18 мкм. Толщина трабекул - 135+24 мкм. Остеоциты с признаками дистрофии. Относительная плотность остеоцитов - 436+27. Большая часть Гаверсовых каналов по-прежнему остается расширенной. Межтрабекулярные пространства широкие, содержимое их костный мозг с явлениями жировой дегенерации. Относительная плотность костной ткани 892+111. (рис. 3). Морфологическое исследование в группе ОЭ+ГАП позволило выявить дегенеративные изменения гиалинового хряща, при этом высота его составила 210+39 мкм. Толщина трабекул - 135+33. Остеоциты с признаками дистрофии. Относительная плотность остеоцитов - 405+34. Гаверсовы каналы расширены. Межтрабекулярные пространства широкие, содержимое их костный мозг с явлениями очаговой жировой дегенерации. Относительная плотность костной ткани 989+42 (рис. 4). Механические показатели костной ткани у животных в исследуемых группах представлены в таблице 2. Полученные результаты позволили установить, что выполнение овариоэктомии у экспериментальных животных стока Sprague Dawley приводит к развитию остеопороза, способствует увеличению массы тела. Длительное применение препарата кальций Сандоз и аллогенного гидроксиапатита достоверно не влияет на массу тела. Введение кальций содержащий препаратов животным в группах ОЭ+С и ОЭ+ГАП на протяжении 90 суток не способствовало увеличению относительного содержания кальция в костной ткани, в группе ОЭ имело место достоверное увеличение относительного содержания кальция. Данные различия обусловлены тем, что определенное снижение уровня эстрогена вызывает остеоцитарный апоптоз7, что сопровождается гиперминерализацией окружающих тканей8. Морфологичесий анализ эпифизов бедренных костей показал, что развитие остеопороза у животных в эксперименте не сопровождается истончением трабекул и формированием глубоких полостей резорбции, преобладают явления остеоцитарного остеолиза. По данным литературы показано, что данные признаки являются обязательными и необратимыми при верификации остеопороза9. Последние исследования in vivo с применением нового поколения микро-КТ-сканеров показали, что при развитии остеопороза происходит увеличение толщины большинства трабекул10. Морфологический анализ архитектоники костной ткани экспериментальных крыс группы ОЭ показал, что относительная плотность остеоцитов увеличена по сравнению с группой ЛО, а относительная плотность костной ткани на единицу площади снижена. Длительное введение препарата кальций Сандоз несколько снижает показатель относительной плотности остеоцитов (р>0,05) и значительно снижает относительную плотность костной ткани (р<0,05). Аллогенный ГАП также способствует небольшому снижению плотности остеоцитов (р>0,05), но относительная плотность костной ткани при этом увеличивается (р<0,05). Изменения архитектоники костной ткани при остеопорозе происходят за счет увеличения плотности остеоцитов, что свидетельствует о снижении их функциональной активности, что сопровождается снижением доли костного матрикса на единицу площади11. Эти процессы изменяют механические характеристики костной ткани12,13. Так у экспериментальных животных на фоне развившегося остеопороза имело место снижение показателей предельной силы, максимального прогиба и предела прочности кости на изгиб, что подтверждалось характером морфологических изменений в ее структуре. В группе крыс ОЭ+ГАП в отличие от группы ОЭ+С имело место достоверное повышение предельной силы, максимального прогиба и предела прочности кости на изгиб. Такие результаты возможно объяснить наличием органической составляющей в составе ГАП, что требует дальнейшего изучения. Заключение. Овариоэктомия является эффективной моделью гипоэстрогенного остеопороза у экспериментальных животных. Длительная монотерапия препаратом «Кальций-Сандоз» в условиях экспериментального остеопороза способствует ухудшению механических показателей костной ткани, что подтверждается характерными морфологическими изменениями (выраженные дегенеративные изменения гиалинового хряща, дистрофия остеоцитов, высокая относительная плотность остеоцитов, расширение Гаверсовых каналов, снижение относительной плотности костной ткани) Применение аллогенного ГАП у экспериментальных животных путем создания эктопического депо улучшает механические и морфологические показатели костной ткани, что обусловлено, вероятнее всего органической составляющей изучаемого вещества.