FOUNDATION FOR APPROACHES TO THE PHARMACEUTICAL ANALYSIS OF HERBAL MATERIALS AND PHYTOCHEMICALS OF CALENDULA OFFICINALIS

Full Text

Одним из интересных с точки зрения научных исследований и перспективных для фармацевтического производства лекарственных растений является календула лекарственная (ноготки) (Calendula officinalis L.). Цветки ноготков являются официнальным лекарственным растительным сырьем (ЛРС) для получения широко используемых в медицине противовоспалительных лекарственных средств. В отечественной и европейской медицине цветки календулы применяются также в качестве лекарственных средств («Настойка календулы», «Ротокан», «Фитогепатол», мазь «Календула», «Свечи с календулой), обладающих регенерирующей, желчегонной, отхаркивающей активностью, что обусловлено содержанием каротиноидов, флавоноидов и сапонинов как важнейших групп биологически активных веществ (БАВ) [3]. Нормативная документация на сырье календулы представлена в Государственной фармакопее СССР XI издания, Государственной фармакопее Республики Казахстан, Европейской фармакопее, Британской фармакопее [1, 2, 9, 10]. Кроме того, растение входит в Немецкую гомеопатическую фармакопею и во Французскую гомеопатическую фармакопею [11, 12]. Однако, несмотря на имеющийся мировой опыт применения сырья и фитопрепаратов ноготков, проблема стандартизации остается одним из самых острых вопросов [6, 7]. В этой связи необходимо совершенствовать методики анализа на сырье и фитопрепараты календулы лекарственной с учетом современных требований к фармацевтическому анализу. На наш взгляд, объективный подход к стандартизации цветков календулы должен включать в себя анализ сырья и фитопрепаратов на содержание основных групп биологически активных веществ (БАВ). Цель исследования: научное обоснование подходов к стандартизации цветков календулы лекарственной и препаратов на основе данного сырья методом ТСХ, спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Материалы и методы Объектами исследования являлись цветки календулы лекарственной, предоставленные Средне-Волжским филиалом ФГБНУ ВИЛАР (урожай 2015 г.), а также препараты, разработанные на базе кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии: настойка календулы (1:5) на 70-процентном этиловом спирте, жидкий экстракт календулы (1:2) на 70-процентном этиловом спирте, жидкий экстракт календулы (1:2) на 40-процентном этиловом спирте. В работе были использованы тонкослойная хроматография (ТСХ), спектрофотометрия и высокоэффективная жидкостная хроматография. Регистрацию УФ-спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena). Воздушно-сухое растительное сырье подвергали исчерпывающему экстрагированию 40- и 70-процентным спиртом этиловым. Настойка календулы (1:5) получена методом модифицированной ремацерации. Жидкий экстракт календулы (1:2) получен методом реперколяцией по Чулкову. Анализ полученных водно-спиртовых извлечений осуществляли с помощью ТСХ на пластинках «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системе хлороформ-метанол-вода (26:14:3). Использовались стандартные образцы нарциссина (3-O-рутинозид изорамнетина), рутина (3-О-рутинозид кверцетина), кверцетина, изокверцитрина и астрагалина. ВЭЖХ-анализ проводили на жидкостном хроматографе «Biotronic». Результаты исследования В рамках исследования цветков календулы методом ТСХ обнаруживается доминирующее и диагностическое вещество - нарциссин (3-O-рутинозид изорамнетина) с Rf около 0,45, а также вещество с Rf около 0,6, соответствующий изокверцитрину. Нарциссин как диагностическое вещество было впервые выделено отечественными учеными, его химическое строение было установлено с помощью методов 1Н-ЯМР и масс-спектрометрии [5, 8]. В нормативной документации Европы и других стран используется ошибочный подход к анализу календулы лекарственной [9, 10]. Возможная причина заключается в том, что нарциссин и рутин имеют сопоставимую подвижность и близкие значения Rf - около 0,45 и около 0,4 соответственно. В этой связи для большей достоверности нами предложено использовать показатель соотношения стандартов - показатель Rs (Ration of standards). Нарциссин по отношению к пятну ГСО рутина имеет значение Rs около 1,1. Результаты сравнительного исследования электронных спектров водно-спиртовых извлечений образцов цветков календулы лекарственной свидетельствуют о том, что для всех образцов сырья характерны максимумы поглощения при λmax 260 ± 2 нм (флавоноиды) и области 330-350 нм (флавоноиды и гидроксикоричные кислоты). Кроме того, для раствора извлечения в присутствии AlClз наблюдается батохромный сдвиг в области 408 нм ± 2 нм, характерный для флавонолов с гликозилированной 3-ОН-группой. Важно отметить, что нарциссин и рутин, являющиеся 3-О-рутинозидами изорамнетина и кверцетина соответственно, близки по своим спектральным характеристикам - по коротковолновому и длинноволновому максимуму поглощения (около 258 нм и 360 нм). Это нашло подтверждение в условиях дифференциальной спектрофотометрии: максимум поглощения в области 408-412 нм, что позволяет рекомендовать в качестве аналитической длины волны значение 412 нм. Данное обстоятельство позволило использовать спектрофотометрию для количественного определения флавоноидов в пересчете на ГСО рутин. Также нами была усовершенствована методика количественного определения суммы флавоноидов в сырье календулы, а также обосновано использование данного показателя в таких препаратах, как настойка (1:5) и жидкий экстракт (1:2). При разработке методик количественного анализа за основу была взята ранее предложенная методика количественного определения суммы флавоноидов в цветках календулы лекарственной [4]. Нами была оптимизирована методика получения раствора рутина стандартного образца с использованием 70-процентного этилового спирта и навески оптимальной массы. В случае отсутствия стандарта, а также для упрощения расчетов предлагается использовать рассчитанный удельный показатель поглощения. Определено, что для рутина значение удельного показателя поглощения составляет 240. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 мин после приготовления всех растворов. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле (1): a1f.jpg где D - оптическая плотность испытуемого раствора; m - навеска сырья, г; W - потеря в массе при высушивании сырья, %; 240 - удельный показатель поглощения Е1%1см рутина при длине волны 412 нм. Важно отметить, что в проекте ФС на цветки календулы формулируется некорректный подход в отношении приготовления раствора ГСО рутина, а именно использование 96-процентного спирта этилового для растворения навески вещества. Считаем целесообразным применение 70-процентного спирта этилового при нагревании для получения раствора рутина стандартного образца. В результате было определено, что содержание суммы флавоноидов в цветках календулы лекарственной составило 1,82%; содержание суммы флавоноидов в настойке (1:5) - 0,22%; в жидком экстракте (1:2) на этиловом спирте 40 % - 0,27%; в жидком экстракте (1:2) на этиловом спирте 70% - 0, 42%. Современный фармакопейный анализ предполагает использование метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), который позволяет одновременно осуществлять качественный и количественный анализ ЛРС. На наш взгляд, в условиях ВЭЖХ в качестве маркера может выступать доминирующий флавоноид нарциссин. Результаты ВЭЖХ-анализа свидетельствуют о том, что в исследуемых условиях хроматографирования нарциссин хорошо отделяется от других компонентов цветков календулы лекарственной, что позволяет рекомендовать данный метод как для целей идентификации сырья ноготков, так и для целей стандартизации препаратов на основе сырья данного растения. Было определено, что содержание доминирующего соединения (нарциссина) в извлечении цветков календулы лекарственной, установленное методом ВЭЖХ, варьируется от 0,57 ± 0,02% до 0,72 ± 0,03%. В данных условиях в анализируемом извлечении также отмечается наличие флавоноида рутина в достаточном количестве (его содержание составляет 0,21% ± 0,01%). Кроме того, в минорных количествах обнаруживается изокверцитрин (0,06% ± 0,002%) и кверцетин (0,04% ± 0,001%). Таким образом, в ходе исследования разработана методика количественного определения доминирующего флавоноида нарциссина методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Содержание нарциссина в цветках календулы, установленное с использованием данной методики, варьируется от 0,57 ± 0,02% до 0,72 ± 0,03%. Учитывая специфичность нарциссина для цветков календулы лекарственной, считаем целесообразным использование метода ВЭЖХ для определения подлинности сырья и препаратов данного растения по обнаружению данного флавоноида, имеющего диагностическое значение. Заключение Таким образом, разработаны новые подходы к стандартизации цветков календулы лекарственной, заключающиеся в комплексном использовании спектрофотометрии, ТСХ и ВЭЖХ. По результатам проведенного исследования цветков календулы лекарственной были оптимизированы методики количественного анализа по содержанию суммы флавоноидов в цветках ноготков, а также в лекарственных препаратах, полученных из данного сырья. Учитывая специфичность нарциссина для цветков календулы лекарственной, представляется целесообразным использование метода ВЭЖХ для определения подлинности сырья и препаратов данного растения по обнаружению данного флавоноида, имеющего диагностическое значение.

About the authors

P V AFANASYEVA

Email: appolinarija03@mail.ru

A V KURKINA

Email: kurkina-av@yandex.ru

References

Supplementary files