SYNTHESIS, PROPERTIES, ANTIMICROBIAL ACTIVITY AND MOLECULAR DOCKING ON THE ENZYME of THE HYDROLASE OF S. AUREUS OF N-ACYLSUBSTITUTED DERIVATIVES OF 5-BROMO (3,5-DIBROM) ANTHRANILIC ACIDS

Full Text

Введение Быстрый рост количества бактериальных штаммов, устойчивых к антибактериальным лекарственным препаратам, создает угрозу для мирового здравоохранения, например, стафилококк золотистый (S. aureus) производит метициллин-устойчивые штаммы [9]. Команда исследователей, включающая микробиологов и химиков, недавно обнаружила, что ингибирование фермента дегидросквален синтазы вызывает снижение размножения бактерий S. aureus во время инфекции [11]. Антраниловая кислота принимает участие в биохимических процессах на различных уровнях организации живой материи, начиная с вирусов и бактерий, обеспечивает широкий спектр биохимических реакций, является одним из ключевых реагентов в полусинтетическом методе получения ряда антибиотиков, как, например, кальцимицина, проявляющего противомикробную активность [12]. N-ацилантраниловые кислоты обладают широким спектром фармакологического действия: противовоспалительным [5, 8], анальгетическим [7] и противомикробным [10]. Создание моделей «структура - противомикробная активность» для производных антраниловой кислоты является актуальным при проведении целенаправленного поиска веществ с выраженной противомикробной активностью [13]. Молекулярный докинг позволяет повысить качество и достоверность проводимых исследований, как, например, модель «структура - противовоспалительная активность» [3]. Целью работы является синтез восьми N-ацил-5-бром (3,5-дибром) антраниловых кислот, изучение свойств полученных веществ и противостафилококковой активности и проведение исследований «структура - активность» с использованием молекулярного докинга по ферменту гидролаза S. aureus. Материалы и методы Спектры 1Н-ЯМР соединений I-VIII записаны на спектрометре Mercury-300BB (рабочая частота прибора 300 МГц) в ДМСО-d6, внутренний стандарт - ГМДС. ИК-спектры соединений выполнены на спектрометре Specord M-80 в вазелиновом масле. Результаты и их обсуждение Реакцией ацилирования 5-бром- и 3,5-дибром-замещенных антраниловых кислот соответствующими хлорангидридами кислот синтезированы N-ацил-5-бром (3,5-дибром) антраниловые кислоты (I-VIII). При проведении синтеза N-ацил-5-бром (3,5-дибром) антраниловых кислот в качестве исходных соединений использовали 5-бром- и 3,5-дибром-замещенные антраниловые кислоты. Синтез осуществляли реакцией ацилирования исходных соединений хлорангидридами кислот при кипячении на водяной бане в бензоле в течение 30 минут. N-фенилацетил-3,5-дибромантраниловая кислота (III). К суспензии 1,47 г (0,005 моль) 3,5-дибромантраниловой кислоты в 10 мл бензола добавляют 0,93 г (0,006 моль) хлорангидрида фенилуксусной кислоты и кипятят на водяной бане 30 минут. Избыток бензола отгоняют, реакционную массу после охлаждения выливают в 50 мл воды и нейтрализуют карбонатом натрия. Полученный осадок отфильтровывают, высушивают и перекристаллизовывают из ацетона. Выход: 1,40 г (79 %). Тпл = 210-212 °C. ИК-спектр, νmax, см-1: 3320 (COOH), 3348 (NHCO), 1680 (COOH), 1660 (NHCO), 1518 (NHCO). Получены N-ацильные производные (I-VIII), изучены их физико-химические свойства и спектральные характеристики (табл. 1). Строение синтезированных N-ацил-5-бром (3,5-дибром) антраниловых кислот подтверждено данными 1Н-ЯМР- и ИК-спектров. Изучена противомикробная активность в отношении тест-штамма S. aureus ATCC 6538-P методом двух кратных серийных разведений в жидкой питательной среде [6]. Результаты экспериментального определения противостафилококковой активности восьми N-ацил-5-бром (3,5-дибром) антраниловых кислот приведены в табл. 2. Наибольшую противостафилококковую активность проявило соединение VIII (N-бензоил-5-бромантраниловая кислота) - 62 мкг/мл. Введение в NH-ацильную группу заместителя 2-фурил- и хлорметил- снижает активность до 125 и 250 мкг/мл соответственно. Наряду с этим 3,5-дибромзамещенные производные показали слабый уровень противостафилококковой активности. Ранее была найдена сильная взаимосвязь между энергией связывания, полученной в результате молекулярного докинга по ферменту циклооксигеназа 1, и противовоспалительным действием, в результате составлена модель «структура - противовоспалительная активность» [3]. Предложенный подход был использован для прогнозирования противомикробной активности по отношению к кишечной палочке в ряду замещенных амидов и гидразидов N-ароил-5-бром (5-хлор) антраниловых кислот [1], где в качестве рецептора использовали фермент, участвующий в образовании клеточной стенки бактерий, - уридиндифосфат-N-ацетил-пирувилглюкозамин редуктазу (MurB). По результатам проведенных исследований ранее нами была предложена корреляционная модель для проведения поиска соединений с противомикробной активностью [1]. С целью проведения исследования зависимости «структура - противостафилококковая активность» в ряду N-ацил-5-бром (3,5-дибром) антраниловых кислот был проведен молекулярный докинг по ферменту гидролаза стафилококка золотистого (S. aureus). Структуры всех лигандов были построены и оптимизированы полуэмпирическим методом РМ3 с использованием программы Gaussian 03, и затем были конвертированы в 3D-формат (.pdb) с помощью программы ChemBio3D Ultra 12,0. Методом молекулярной стыковки программой AutoDock 4, с использованием Ламарковского генетического алгоритма, который позволяет воспроизводить строение комплексов более точно, проведен расчет скоринговой функции - энергия связывания (Be) (табл. 2). В качестве мишени использовали кристаллографическую копию фермента, полученную рентгеноструктурным анализом и представленную в виде pdb-файла, взятого из базы данных Brookhaven Protein Data Bank: гидролаза S. aureus (PDB ID code: 1Q1Y [14]). В результате проведенного исследования «структура - противомикробная активность» составлены две диаграммы линейной зависимости противостафилококковой активности от Be с использованием программы Microsoft Excel. Полученные диаграммы отражают тесноту связи выбранного параметра с противостафилококковой активностью. В качестве дескриптора противостафилококковой активности использовали минимальную подавляющую концентрацию (МПК (S. aureus)) и логарифм 1/МПК (log 1/МПК (S. aureus)). Полученные результаты представлены графически в виде диаграмм линейной зависимости (рис. 1). Анализ диаграмм (рис. 1) показал наличие сильной связи с коэффициентами корреляции (R) 0,89 и 0,77 для МПК (S. Aureus) и логарифма 1/МПК (log 1/МПК (S. aureus)). В результате наибольший коэффициент корреляции найден для зависимости энергии связывания от МПК (S. aureus) и равен 0,89. Полученный результат мы использовали в качестве основы для проведения исследования зависимости в ряду «структура - активность» с использованием рассчитанных физико-химических дескрипторов: констант липофильности и ионизации. Проведен расчет констант ионизации (pKaрассч и pKврассч) [2] и липофильности (log Pрассч) [4] с использованием ранее полученных теоретических моделей «структура - свойство» (табл. 3). Для прогнозирования значений log Pрассч, pKaрассч и pKврассч построены структуры и проведены квантово-химические расчеты восьми соединений из ряда N-ацил-5-бром (3,5-дибром) антраниловых кислот с использованием программы Gaussian 03 полуэмпирическим методом РМ3. В результате получены квантово-химические дескрипторы: суммарные значения напряженности электрического поля Σ (Е) на атомах углерода C (E), азота N (E); суммарные значения потенциала на атомах углерода C (φ), кислорода O (φ) и азота CN (φ); суммарные значения заряда в модуле на атомах кислорода O (| q |) всей молекулы (табл. 3). Значения констант липофильности лежат в интервале от 0,97 у соединения II до 2,79 (соединение VI). Рассчитаны константы кислотности и основности, характеризующие ионизацию. Значения констант кислотности (pKaрассч) находятся в пределах от 5,37 (соединение VII) до 6,64 (IV); константы основности (pKврассч) находятся в интервале от 12,69 у соединения V до 13,22, для соединения VIII. Проведен множественный линейный регрессионный анализ с использованием программы Statistica 6, зависимости МПК (S. aureus) от Be, log Pрассч, pKaрассч и pKврассч. В результате было получено 12 уравнений, из которых наиболее значимыми оказались четыре уравнения (табл. 4). Проведена оценка составленных уравнений (табл. 4) методом перекрестного контроля с исключением по одному (Leave-one-out Cross-validation, LOO) (Q2LOO), с использованием программы Statographics. Определен коэффициент детерминации предсказаний Q2LOO, значения, которого находятся в интервале 0,70-0,81. По результатам проверки можно утверждать, что составленная расчетная модель на основе уравнения 2 является наиболее значимой (Q2LOO = 0,81), так как значение Q2 по LOO для надежных предсказательных моделей должно быть не менее 0,5. Выводы Осуществлен синтез восьми N-ацилзамещенных производных 5-бром (3,5-дибром) антраниловых кислот. Исследована противомикробная активность в отношении S. aureus. Установлено, что большинство изученных кислот обладает слабой бактериостатической активностью (табл. 2). Наиболее высокую бактериостатическую активность проявляют N-(2-фураноил)- (VI) и N-бензоил- (VIII) 5-бромантраниловые кислоты. Введение в структуру второго атома брома в положение 3 снижает противостафилококковую активность. Получены линейные диаграммы, которые показали высокий коэффициент корреляции энергии связывания (Be), определенной методом молекулярного докинга по ферменту гидролаза S. aureus, с активностью. Выполнен множественный линейный регрессионный анализ, составлено уравнение зависимости МПК (S. aureus) от энергии связывания по ферменту гидролаза (Be) и физико-химических дескрипторов: log Pрассч, pKaрассч и pKврассч. Предложено корреляционное уравнение № 2 для проведения дальнейших исследований «структура - противомикробная активность», которое позволяет производить достоверный и экономически выгодный прогноз уровня противомикробной активности (ПМА), выявляя соединения с высокой ПМА до проведения их синтеза и биологических испытаний. Конфликт интересов отсутствует. X = Br, Y = H, R = CH2Cl (I); X = Br, Y = Br, R = CH2Cl (II); X = Br, Y = Br, R = CH2C6H5 (III); X = Br, Y = H, R = CH2CH2CH2Cl (IV); X = Br, Y = Br, R = CH2CH2CH2Cl (V); X = Br, Y = H, R = 2-фурил (VI); X = Br, Y = Br, R = 2-фурил (VII); X = Br, Y = H, R = C6H5 (VIII) Таблица 1 / Table 1 Физико-химические и спектральные характеристики N-ацилзамещенных производных 5-бром (3,5-дибром) антраниловых кислот Physico-chemical and spectral characteristics of N-acylsubstituted derivatives of 5-bromo (3,5-dibromo) anthranilic acids Соединение Выход, % Тпл, °С Спектры ПМР (ДМСО-d6), δ, м. д. I 80 226-228 4,15 (c, 2H, CH2); 7,45-8,40 (м, 3H, C6H3); 11,82 (c, 1H, NHCO) II 63 218-220 4,10 (c, 2H, CH2Cl); 7,70-7,90 (м, 2H, C6H2); 9,85 (c, 1H, NHCO) III 79 210-212 3,60 (c, 2H, CH2); 7,15-7,98 (м, 7H, C6H2, C6H5); 9,85 (c, 1H, NHCO); 13,00 (уш. c. 1H, OH) IV 34 124-126 2,10 (м, 2H, CH2); 2,50 (т, 2H, CH2Cl); 3,55 (т, 2H, COCH2); 7,30-8,50 (м, 3H, C6H3); 11,10 (c, 1H, NHCO) V 68 179-181 2,00 (м, 2H, CH2); 2,50 (т, 2H, CH2Cl); 3,65 (т, 2H, NCH2); 7,80-8,00 (м, 2H, C6H2); 9,70 (c, 1H, NHCO); 13,00 (уш. c, 1H, OH) VI 87 257-258 6,62-8,78 (м, 6H, C6H3, C4H3О), 12,08 (с, 1H, NH) VII 45 202-204 6,54-8,04 (м, 5H, C6H2, C4H3О), 9,95 (с, 1H, NH) VIII 46 255-256 6,65-7,98 (м, 8H, C6H3, C6H5), 11,05 (с, 1H, NH) Таблица 2 / Table 2 Противостафилококковая активность и энергия связывания (Be) N-ацил-5-бром (3,5-дибром) антраниловых кислот Anti-staphylococcal activity and binding energy (Be) N-acyl-5-bromo (3,5-dibromo) anthranilic acids № S. aureus Be МПК, мкг/мл log (1/МПК) I 250 -2,398 -4,49 II 1000 -3,000 -6,28 III 1500 -3,176 -6,55 IV 1000 -3,000 -5,61 V 1000 -3,000 -5,38 VI 125 -2,097 -4,88 VII 1500 -3,176 -6,71 VIII 62 -1,792 -5,07 Рис. 1. Диаграммы линейной зависимости Be от МПК (S. aureus) (№ 1) и зависимости Be от log 1/МПК (S. aureus) (№ 2) Fig. 1. Diagrams of the linear dependence of Be on the MIC (S. aureus) (No. 1) and the dependence of Be on log 1/MIC (S. aureus) (No. 2) Be 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 МПК (S. Aureus) / МIC (S. Aureus) 0 500 № 1 1000 R = 0,89 1500 2000 -4 log 1/МПК (S. Aureus) / log 1/МIC (S. Aureus) R = 0,77 -3 № 2 -2 -1 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 0 Be Таблица 3 / Table 3 Квантово-химические параметры, log Pрассч, pKaрассч и pKврассч N-ацил-5-бром (3,5-дибром) антраниловых кислот Quantum-chemical parameters, log Pcalc, pKacalc and pKвcalc of N-acyl-5-bromo (3,5-dibromo) anthranilic acids № C (E) N (E) C (φ) O (φ) N (φ) O (| q |) log Pрассч pKaрассч pKврассч I 4,47 0,50 88,60 39,68 11,86 0,91 1,02 5,81 12,87 II 4,21 0,48 81,19 39,37 10,02 0,91 0,97 5,69 12,79 III 9,27 0,39 201,73 41,72 12,85 0,97 1,69 5,73 13,09 IV 6,97 0,47 158,01 40,92 16,95 1,02 1,46 6,64 12,77 V 6,70 0,45 150,60 40,62 15,11 1,03 1,41 6,52 12,69 VI 6,39 0,48 129,16 52,92 12,85 1,15 2,79 5,49 13,20 VII 6,12 0,46 121,76 52,61 11,02 1,15 2,77 5,37 13,13 VIII 7,68 0,40 163,11 40,98 12,94 0,92 2,66 5,61 13,22 Таблица 4 / Table 4 Уравнения регрессии зависимости МПК (S. aureus) от дескрипторов (log Pрассч, pKaрассч, pKврассч, Be) The equations of regression dependence of the MIC (S. aureus) from descriptors (log Pcalc, pKacalc, pKвcalc, Be) № Уравнение регрессии R F S Q2LOO N 1 МПК (S. aureus) = -2387,03 - 628,38 · Be - 192,99 · log Pрассч 0,934 17,34 246,05 0,70 8 2 МПК (S. aureus) = -5432,26 - 661,47 · Be + 427,16 · pKaрассч 0,959 28,99 195,29 0,81 8 3 МПК (S. aureus) = 8215,19 - 844,23 · Be - 626,80 · pKврассч 0,949 23,13 216,48 0,77 8 4 МПК (S. aureus) = -6045,72 + 85,34 · pKврассч - 660,93 · Be - - 93,53 · log Pрассч + 372,92 · pKaрассч 0,963 9,74 239,26 0,78 8

About the authors

K V Andryukov

Perm State Pharmaceutical Academy

Email: k_andrukov@mail.ru
Candidate of Pharmacy, PhD Student, Department of Pharmaceutical Chemistry of Full-time Faculty

L M Korkodinova

Perm State Pharmaceutical Academy

Email: perm@pfa.ru
Doctor of Pharmacy, Professor, Head of Department of Pharmaceutical Chemistry of Full-time Faculty

References

Supplementary files