Techniques of quantitative evaluation of verapamil content in whole blood

Full Text

Введение

Верапамил (α-[3-([2-(3,4-диметоксифенил)-этил]метиламино)пропил]-3,4-диметокси-α-(1-метилэтил)бензолацетонитрил) является лекарственным препаратом группы блокаторов кальциевых каналов, имеющим токсикологическое значение [1]. При диагностике острых отравлений и в судебно-химической экспертизе для количественного определения верапамила используют ряд хроматографических методов, в том числе с масс-спектрометрическим детектированием, а также спектрофотомерию в УФ-диапазоне [2–4]. К используемым аналитическим методам определения верапамила в плазме крови предъявляются требования высокой чувствительности, селективности и соответствия рабочих диапазонов методик уровням терапевтической и токсической концентраций анализируемого вещества в плазме крови.

Цель исследования — сравнительная характеристика аналитических возможностей различных методов количественного определения верапамила в крови, используемых в химико-токсикологическом анализе и судебно-химической экспертизе.

Материалы и методы

В работе использовали стандартный образец верапамила (в форме гидрохлорида) (LGC Standards, Великобритания). Модельные образцы крови готовили путем добавления расчетного количества стандартного образца (в виде метанольного раствора концентрации 10,0 мкг/мл в пересчете на основание) к образцам крови, не содержащим наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ. Диапазон концентраций верапамила в пробах крови составлял 100,0–5000,0 нг/мл (для тонкослойной хроматографии (ТСХ) с компьютерной денситометрией) и 5,0–150,0 мкг/мл (для УФ-спектрофотометрии).

Пробоподготовку образцов крови осуществляли жидкость-жидкостной экстракцией. Объем пробы крови составлял 10 мл. Условия экстракции: хлороформ при рН 9–11; полученные экстракты упаривали до сухого остатка в токе теплого воздуха при температуре не более 40 °С. Сухой остаток растворяли в 50 мкл смеси хлороформ – этанол (1 : 1). При исследовании методом УФ-спектрофотометрии при жидкость-жидкостной экстракции увеличивали объем пробы крови до 50 мл, далее из аликвоты полученного хлороформного экстракта объемом 20 мл проводили реэкстракцию раствором кислоты хлористоводородной концентрации 0,1 моль/л.

Для идентификации верапамила в пробах крови использовали метод хромато-масс-спектрометрии. Исследование осуществляли на газовом хроматографе Agilent Technologies 6890 с масс-селективным детектором Agilent Technologies 5973N с использованием кварцевой капиллярной колонки HP5-MS (5 % фенилдиметилсилоксан) длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Режим программирования температуры колонки: начальная температура 170 °С (выдержка в течение 1 мин), повышение температуры со скоростью 15 °С/мин до 280 °С с выдержкой при конечной температуре 5 мин. В качестве газа-носителя использовали гелий; скорость газа-носителя — 1 мл/мин в режиме постоянного потока. Температура инжектора — 280 °С, температура аналитического интерфейса — 285 °С. Ввод пробы осуществляли с помощью автосамплера в режиме без деления потока со сбросом избытка через 1 мин в отношении потоков 1 : 15 (split/splitless); объем пробы — 1 мкл. Анализ исследуемых образцов проводили в режиме сканирования в диапазоне масс 39–550 а. е. м.

Условия анализа методом ТСХ: пробу объемом 50 мкл наносили микрошприцем на пластины для ТСХ «Сорбфил-ПТСХ-П-А-УФ» размером 10 × 15 см в виде полосы толщиной не более 1 мм и шириной не более 0,5 см, при нанесении зону первичной адсорбции высушивалии теплым воздухом. В качестве систем растворителей (подвижных фаз) использовали смеси этилацетат – метанол – аммиак 25 % (17 : 2 : 1), а также метанол – аммиак 25 % (100 : 1,5). Насыщение камеры парами растворителей проводили в течение 30 мин. Детектирование хроматограмм — обработкой реактивом Драгендорфа, а также в УФ-свете при длине волны 254 нм.

При денситометрическом определении полученные хроматограммы фиксировали путем сканирования с оптическим разрешением 900 dpi в True Color режиме на планшетном сканере, сохраняли в виде файлов с расширением jpeg и обрабатывали с использованием программы «ТСХ-менеджер 4.0» [5].

При спектрофотометрическом определении верапамила исследовали реэкстракт из хлороформного извлечения, полученный раствором кислоты хлористоводородной концентрации 0,1 моль/л. Регистрировали спектр поглощения полученного реэкстракта в интервале длин волн 200–400 нм. Условия измерения: регистрирующий спектрофотометр СФ-56; шаг измерения — 1 нм; толщина рабочего слоя — 1 см; раствор сравнения — реэкстракт из «холостой» пробы крови, полученный в аналогичных условиях пробоподготовки.

Определение пределов обнаружения и количественного определения, диапазона определяемых концентраций, правильности и прецизионности проводили в соответствии с рекомендациями «Руководства по валидации аналитических методик, используемых в судебно-химическом и химико-токсикологическом анализе биологического материала» [6].

Результаты и обсуждение

Определение верапамила в образцах крови включало два этапа: хромато-масс-спектрометрический скрининг (в режиме полного ионного тока) и последующее количественное определение методами с более низким уровнем селективности — ТСХ с компьютерной денситометрией или УФ-спектрофотометрией. Применение вышеуказанных методов позволяет уменьшить нагрузку на хромато-масс-спектрометрическое оборудование, а также снизить временные и экономические затраты на данное исследование.

При хромато-масс-спектрометрическом скрининге на хроматограммах образцов крови обнаруживался пик неметаболизированного верапамила (рис. 1).

Рис. 1. Хроматограмма образца крови с содержанием верапамила 300,0 нг/мл

Fig. 1. Chromatogram of the whole blood sample with Verapamil concentration of 300,0 ng/ml

Масс-спектр, соответствующий данному хроматографическому пику, позволял идентифицировать анализируемое вещество с вероятностью не менее 80 %, самым интенсивным ионом в масс-спектре является ион с массой 303 а. е. м. (рис. 2).

Рис. 2. Масс-спектр верапамила, выделенного из образца крови

Fig. 2. Mass-spectrum of Verapamil, isolated from the whole blood sample

Для анализа верапамила методом ТСХ были использованы подвижные фазы и вариант детектирования на пластинке, наиболее часто используемые в практике судебно-химической экспертизы (табл. 1).

Таблица 1 / Table 1

Параметры методики идентификации верапамила в крови методом тонкослойной хроматографии

Parameters for the identification of Verapamil content in whole blood by means of thin-layer chromatography method

Для определения предела обнаружения верапамила были проанализированы модельные образцы крови в диапазоне концентраций 100,0–5000,0 нг/мл.

Для пробоподготовки использовали образцы крови объемом 10 мл, а объем пробы, наносимой на хроматографическую пластину, составлял 50 мкл. При определении величины предела обнаружения использовали визуальную регистрацию обработанного изображения хроматограммы, для обработки изображения применяли программные средства «ТСХ-менеджер 4.0». Предел обнаружения верапамила в образцах крови — 150,0 нг/мл (1,0 мкг в пробе).

Влияние балластных веществ крови на результаты анализа учитывали путем исследования «холостых» проб крови в вышеуказанных условиях. При этом на пластинках в диапазоне значений R_f 0,2–0,8 хроматографических зон не детектировали.

Определение характера зависимости аналитического сигнала — площади хроматографической зоны (S) от концентрации определяемого вещества (С) — показало, что при количестве верапамила свыше 5,0 мкг в пробе наблюдается отклонение от линейной зависимости.

Для изучаемого лекарственного вещества была рассчитана градуировочная зависимость, которая описывается уравнением полиномиальной (квадратичной) регрессии: S = 0,081 · C² + 36,2 · X – 501,3. Предел количественного определения составил 300,0 нг/мл, диапазон концентраций в крови, в которых возможно проводить количественное определение (рабочий диапазон методики) — 300,0–5000,0 нг/мл.

При спектрофотометрическом анализе выраженные максимумы в спектре поглощения регистрировали для экстракта с концентрацией верапамила 5,0 мкг/мл, в качестве аналитической использовали длину волны 277 нм (рис. 3).

Рис. 3. Спектр поглощения экстракта из образцов крови (содержание верапамила 5,0 мкг/мл)

Fig. 3. Absorbance spectrum of the whole blood extract (Verapamil concentration was 5,0 mkg/ml)

Был экспериментально установлен линейный диапазон зависимости оптической плотности (D) от концентрации (С), который составил 10,0–160,0 мкг/мл — для фотометрируемых растворов верапамила, полученных из стандартного образца. Уравнение градуировочного графика имеет вид: D = 0,0090 · С + 0,072; величина коэффициента корреляции r составила 0,998.

При исследовании образцов крови предел количественного определения спектрофотометрическим методом составил 6,0 мкг/мл (6000,0 нг/мл), линейный диапазон — 6,0–100,0 мкг/мл (6000,0–100 000,0 нг/мл).

Для оценки правильности и прецизионности (сходимости) методик анализировали образцы крови с известными количествами верапамила трех уровней концентраций в пределах рабочих диапазонов каждой методики. Определяли сходимость результатов измерений (относительное стандартное отклонение), полученных в пяти разных аналитических циклах — между сериями параллельных определений в разные дни (табл. 2).

Таблица 2 / Table 2

Результаты оценки правильности и прецизионности количественного определения верапамила в крови методами тонкослойной хроматографии с компьютерной денситометрией и УФ-спектрофотометрии

The evaluation of accuracy and precision of Verapamil quantification method in whole blood by thin-layer chromatography with the use of videodensitometry and UV-spectrophotometry

Относительные погрешности определения верапамила в крови методом ТСХ с компьютерной денситометрией, используемые для оценки правильности методики, для всех уровней концентраций не превышали значения ±20,0 %. Для спектрофотометрического метода оценка правильности производилась в области более высоких концентраций и погрешность для среднего и высокого уровня составляет соответственно 22,7 и 27,5 %.

Для спектрофотометрического метода анализа отмечается завышение содержания верапамила в образцах крови, связанное с неконтролируемым вкладом поглощения балластных веществ пептидной природы в оптическую плотность при длине волны 277 нм.

Сходимость результатов определений верапамила методом спектрофотометрии на всех уровнях концентраций не превышала 7,4 %. При анализе верапамила методом ТСХ с компьютерной денситометрией разброс результатов уменьшался от 24,3 % для нижнего уровня концентраций до 5,8 % — для верхнего уровня.

Диапазоны определяемых концентраций верапамила в крови при расчете методом ТСХ с компьютерной денситометрией соответствуют уровням токсической и летальной концентраций. Спектрофотометрическая методика позволяет определять верапамил только при летальных отравлениях, связанных с содержанием неметаболизированного верапамила в крови более 6,0 мкг/мл.

Заключение

В условиях модельного эксперимента дана сравнительная характеристика аналитических возможностей методов ТСХ с компьютерной денситометрией и УФ-спектрофотометрии для определения верапамила в крови. Применение денситометрии для обработки хроматограмм в методе ТСХ позволило количественно определять содержание верапамила в пробах крови на более низком уровне концентраций по сравнению с дипазоном определямых концентраций метода УФ-спектрофотометрии. Достоверность идентификации верапамила в образцах крови при использовании обеих методик обеспечивает хромато-масс-спектрометрический скрининг.

Спектрофотометрическая методика позволяет определять верапамил в крови только на уровне летальных концентраций, показатели правильности превышают ±20,0 %. Определение верапамила в крови методом ТСХ с компьютерной денситометрией характеризуется показателями правильности и прецизионности, не превышающими значения ±24,0 %, и может быть рекомендовано для применения в судебно-химической экспертизе и экспресс-диагностике острых отравлений.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Alexander V. Voronin

Author for correspondence.
Email: dimmu2000@mail.ru

Candidate of Pharmaceutical Sciences, Associate Professor, Head of the Department of Chemistry of Pharmaceutical Faculty

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Chromatogram of the whole blood sample with Verapamil concentration of 300,0 ng/ml

Download (206KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Mass-spectrum of Verapamil, isolated from the whole blood sample

Download (108KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Absorbance spectrum of the whole blood extract (Verapamil concentration was 5,0 mkg/ml)

Download (70KB)

Indexing metadata