The development of approaches to the standardization of the syringa vulgaris leaves

Full Text

Введение

Сирень обыкновенная (Syringa vulgaris L.) является одним из лекарственных видов растений, не включенных в Государственную фармакопею Российской Федерации XIV издания: в качестве лекарственного растительного сырья (ЛРС) зарегистрирована кора (ВФС 42-2106-92). Препараты на основе коры сирени обладают широким спектром фармакологической активности: иммуномодулирующим, адаптогенным, анксиолитическим и антидепрессивным действием. Кора сирени обыкновенной является источником получения ГСО cирингина (ВФС 42-2088-92 «Cирингин-стандартный образец»), который находит применение в стандартизации сырья и препаратов элеутерококка колючего (Eleutherococcus senticosus Rupr. et Maxim) — элеутерозид В [3–5]. Также в коре сирени обыкновенной были обнаружены и выделены другие фенилпропаноиды (кониферин, актеозид, форзитиазид), фенольные соединения (тирозол, гидрокситирозол, салидрозид) и иридоид (олеуропеин) [3, 5]. Разработаны методики качественного и количественного анализа сырья «Сирени обыкновенной кора» и препаратов «Сирени настойка» и «Сирени сироп» с использованием ГСО сирингина методами тонкослойной хроматографии, прямой спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии [3–7]. На наш взгляд, не менее интересными с точки зрения источника биологически активных соединений (БАС) являются и другие части растения, в том числе листья сирени обыкновенной, в которых среди потенциальных биологически активных соединений являются флавоноиды [8]. Известен опыт народного применения листьев сирени в качестве средства, обладающего противовоспалительными и антибактериальными свойствами, однако в настоящее время степень изученности химического состава данного вида сырья является недостаточной.

С целью введения листьев сирени обыкновенной в Государственную фармакопею Российской Федерации необходимо проведение комплекса фармакогностических исследований, включая разработку нормативной документации, подтверждающей качество ЛРС [2].

Цель настоящего исследования — разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной.

В задачи исследования входило:

• разработка методики количественного анализа суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной;
• определение содержания суммы флавоноидов для изучаемого вида сырья;
• определение нижнего предела содержания действующих веществ для листьев сирени обыкновенной.

Результаты и их обсуждение

Сирень обыкновенная — Syringa vulgaris L. — быстро растущее, широко распространенное растение на территории Российской Федерации [5].

Особый интерес, наряду с фармакопейным сырьем — корой, представляют листья данного растения, содержащие флавоноиды. Так, ранее из листьев были выделены производные кверцетина и кемпферола — рутин, изокверцетрин, кверцетрин и афзелин [8].

Объектом исследования служили листья сирени обыкновенной, заготовленные в мае и октябре 2015–2018 гг. в ботаническом саду Самарcкого университета, в г. Уральск, г. Тольятти и в Пензенской области.

В ходе разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной изучены ультрафиолетовые (УФ) спектры растворов водно-спиртовых извлечений из данного сырья (рис. 1 и 2). Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения сирени обыкновенной наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов (рис. 1), как и в случае рутина (рис. 2). Изучение УФ-спектров Государственного стандартного образца (ГСО) рутина показало, что раствор данного стандарта в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм (рис. 2). В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из листьев сирени обыкновенной в дифференциальном варианте максимум поглощения обнаруживается также при длине волны 412 нм максимум поглощения (рис. 3), который соответствует максимуму поглощения раствора рутина.

 

Рис. 1. Электронные спектры растворов водно-спиртового извлечения из листьев сирени обыкновенной: 1 — раствор извлечения; 2 — раствор извлечения с добавлением алюминия хлорида

Fig. 1. Electronic spectra of solutions of water-alcohol extraction from Syringa vulgaris leaves: 1 — solution of extraction; 2 — solution of extraction with aluminium chloride

 

Рис. 2. Электронные спектры спиртовых растворов рутина: 1 — исходный раствор; 2 — раствор с добавлением алюминия хлорида

Fig. 2. Electronic spectra of alcohol solutions of rutin: 1 — original solution; 2 — solution with aluminium chloride

 

Рис. 3. Электронный спектр раствора водно-спиртового извлечения из листьев сирени обыкновенной (дифференциальный вариант)

Fig. 3. The electronic spectrum of the solution of the water-alcohol extraction from the leaves of Syringa vulgaris (differential version)

 

Таким образом, рутин может быть использован в методике анализа в качестве ГСО.

С целью разработки методики количественного определения суммы флавоноидов нами определены оптимальные условия экстракции флавоноидов в листьях сирени обыкновенной: экстрагент 70 % этиловый спирт; соотношение «сырье – экстрагент» — 1 : 50; время экстракции — извлечение на кипящей водяной бане в течение 45 мин; степень измельчения — 1 мм (табл. 1).

 

Таблица 1 / Table 1

Зависимость полноты извлечения суммы флавоноидов из листьев сирени обыкновенной

Dependence of the recovery rate of total flavonoids from the leaves of Syringa vulgaris

Экстрагент	Соотношение сырье : экстрагент	Время экстракции, мин	Степень измельчения, мм	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье, %
40 % этиловый спирт	1:30	60 мин	2	2,65 ± 0,16
60 % этиловый спирт	1:30	60 мин	2	3,10 ± 0,19
70 % этиловый спирт	1:30	60 мин	2	3,36 ± 0,21
80 % этиловый спирт	1:30	60 мин	2	3,27 ± 0,20
90 % этиловый спирт	1:30	60 мин	2	3,01 ± 0,18
70 % этиловый спирт	1:30	30 мин	2	2,64 ± 0,16
70 % этиловый спирт	1:30	45 мин	2	3,63 ± 0,22
70 % этиловый спирт	1:30	90 мин	2	3,11 ± 0,19
70 % этиловый спирт	1:30	120 мин	2	3,04 ± 0,19
70 % этиловый спирт	1:30	45 мин	2	3,26 ± 0,20
70 % этиловый спирт	1:20	45 мин	2	2,78 ± 0,17
70 % этиловый спирт	1:50	45 мин	2	3,38 ± 0,21
70 % этиловый спирт	1:50	45 мин	1	3,31 ± 0,20
70 % этиловый спирт	1:50	45 мин	2	2,79 ± 0,17
70 % этиловый спирт	1:50	45 мин	3	2,41 ± 0,15

 

Методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70 % этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 45 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса). Испытуемый раствор готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 3 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 96 % этиловым спиртом (испытуемый раствор А). Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 412 нм через 40 мин после приготовления. В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный следующим образом: 1 мл извлечения (1 : 50) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора 96 % этиловым спиртом до метки.

Примечание: Приготовление раствора рутина-стандартного образца. Около 0,020 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70 % этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70 % этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 3 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 96 % этиловым спиртом (испытуемый раствор Б рутина). Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 412 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, который готовят следующим образом: 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки 96 % этиловым спиртом (раствор сравнения Б рутина).

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (x) вычисляют по формуле:

$x=\frac{D·m_{\circ }·50·25·1·100·100}{D_{\circ }·m·50·25·(100-W)}$

где D — оптическая плотность испытуемого раствора; D_o — оптическая плотность раствора ГСО рутина; m — масса сырья, г; m_o — масса ГСО рутина, г; W — потеря в массе при высушивании, %.

В случае отсутствия стандартного образца рутина целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения — 240.

$x=\frac{D·50·25·100}{m·240·(100-W)}$

где D — оптическая плотность испытуемого раствора; m — масса сырья, г; m_o — масса ГСО рутина, г; 240 — удельный показатель поглощения () ГСО рутина при 412 нм; W — потеря в массе при высушивании, %.

Метрологические характеристики методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной представлены в табл. 2. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют, что ошибка единичного определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной с доверительной вероятностью 95 % составляет ±6,12 %.

 

Таблица 2 / Table 2

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной

Metrological characteristics of the method of quantitative determination of total flavonoids in the leaves of Syringa vulgaris

f	X, %	S	P, %	t (P, f)	±X	E, %
15	3,05	0,3367	95	2,13	±0,19	±6,12

 

Валидационная оценка разработанной методики проводилась по показателям: специфичность, линейность, правильность и воспроизводимость. Специфичность методики определялась по соответствию максимумов поглощения комплекса флавоноидов листьев сирени обыкновенной и рутина с алюминием хлоридом. Линейность методики определяли для серии растворов рутина (с концентрациями в диапазоне от 0,00880 до 0,03520 мг/мл). Коэффициент корреляции составил 0,98953.

Правильность методики определяли методом добавок раствора рутина с известной концентрацией (25, 50 и 75 %) к испытуемому раствору. При этом средний процент восстановления составил 98 %.

С использованием разработанной методики нами проанализирован ряд образцов листьев сирени обыкновенной (табл. 3) и при этом определено, что содержание суммы флавоноидов варьирует от 2,76 до 3,89 %, что позволяет рекомендовать в качестве нижнего предела для сырья данного растения содержание суммы флавоноидов не менее 2,5 %.

 

Таблица 3 / Table 3

Содержание суммы флавоноидов в образцах листьев сирени обыкновенной

The content of total flavonoids in samples of Syringa vulgaris leaves

№ образца	Характеристика образца сырья	Содержание суммы флавоноидов в абсолютно сухом сырье (%) в пересчете на рутин
1	Ботанический сад Самарского университета, г. Самара (май 2015 г.)	3,79 ± 0,23
2	г. Уральск (октябрь 2016 г.)	2,94 ± 0,18
3	Ботанический сад Самарского университета, г. Самара (май 2016 г.)	3,89 ± 0,24
4	г. Тольятти (май 2018 г.)	2,76 ± 0,17
5	Пензенская обл., Никольский р-н (май 2019 г.)	3,12 ± 0,19

 

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о целесообразности стандартизации листьев сирени обыкновенной путем определения суммы флавоноидов методом спектрофотометрии при аналитической длине волы 412 нм в пересчете на рутин.

Выводы

1. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях сирени обыкновенной методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием ГСО рутина при аналитической длине волны 412 нм.
2. Содержание суммы флавоноидов для листьев сирени обыкновенной варьирует от 2,76 до 3,89 %. Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95 % составляет ±6,12 %.
3. Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать для листьев сирени обыкновенной нижний предел содержания суммы флавоноидов не менее 2,5 %.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Anastasiya D. Serebryakova

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: lazymoon93@mail.ru

Postgraduate student, Department of Pharmacognosy with Botany and Bases of Phytotherapy

Russian Federation, Samara

Vladimir A. Kurkin

Samara State Medical University

Email: kurkinvladimir@yandex.ru

доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files