METHODS OF SPECIFIC DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS: A MODERN VIEW ON THE PROBLEM

Full Text

ВВЕДЕНИЕ В настоящее время туберкулез остается одной из острейших проблем здравоохранения, являясь лидирующей причиной смертности от инфекционных болезней. Так, в 2015 году, по данным ВОЗ, в мире было зарегистрировано 10,4 млн новых случаев заболевания и 1,4 млн случаев смерти от туберкулеза [1]. Очевидно, что для снижения показателей заболеваемости и смертности необходимо внедрение методов диагностики, направленных на выявление больных на раннем этапе развития заболевания, что позволит не только своевременно начать специфическую терапию, но и изолировать больных, уменьшая распространение микобактерий туберкулеза. ■ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ПРИ АКТИВНОМ ТУБЕРКУЛЕЗЕ Традиционно диагностика активного легочного туберкулеза основана на выделении возбудителя с использованием 1 из 3 методик: непосредственная визуализация Mycobacterium tuberculosis посредством микроскопии, рост и изоляция M. tuberculosis (культуральное исследование) и амплификация и обнаружение нуклеиновых кислот M. tuberculosis (тесты амплификации нуклеиновых кислот - NAAT) [2]. Все эти методики имеют ряд преимуществ и недостатков. В частности, в развивающихся странах основным методом диагностики легочного туберкулеза остается микроскопическое исследование мазков мокроты, которое является простым в выполнении и имеет низкую стоимость, но при этом, по мнению многих авторов, обладает довольно низкой чувствительностью (50-60%), которая зависит как от опыта лаборанта, выполняющего анализ, так и от содержания M. tuberculosis в образце [3-5]. Идентификация возбудителя путем культурального анализа считается золотым стандартом и имеет более высокую чувствительность, однако в литературе отмечается также ряд недостатков данного исследования. В частности, этот метод требует длительного времени выполнения вследствие медленного роста микобактерий (период до начала терапии составляет 4-8 недель) и необходимости привлечения опытных специалистов для его выполнения [6-7]. На протяжении последних двух десятилетий возрос также интерес к разработке новых средств диагностики туберкулеза, включая метод времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF), направленный на ускорение этапа идентификации положительных культур. Данный метод позволяет идентифицировать микроорганизмы путем получения общего масс-спектра белков в диапазоне 1000-10000 дальтон и сравнения полученного спектра с референсными спектрами [8-9]. Кроме того, предложены методы амплификации нуклеиновых кислот (NAAT), такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющие обнаружить M. tuberculosis непосредственно в клинических образцах, однако для использования в странах с низким и слабым уровнем экономического развития ВОЗ были рекомендованы только анализ олигонуклеотидными зондами и система Xpert MTB/RIF, которая предполагает постановку семигнездовой ПЦР в режиме реального времени с последующим тестированием «молекулярными маяками» на наличие мутаций в участке, кодирующем устойчивость к рифампицину [10-12]. Таким образом, данные методы позволяют не только выявить M. tuberculosis в образцах, но и установить наиболее частые мутации, обусловливающие резистентность к противотуберкулезным препаратам. Вместе с этим данные методы обладают рядом недостатков. В частности, все они являются довольно дорогостоящими и требуют наличия специального оборудования и обученного персонала. Кроме того, чувствительность этих методов в ряде случаев может быть недостаточной. Так, чувствительность анализа олигонуклеотидными зондами, по данным различных авторов, составляет 58-80% [13-14], а для Xpert MTB/ RIF этот показатель достигает 99% для легочных форм с положительным мазком мокроты, 68% - при отрицательном мазке мокроты и от 25,0 до 96,6% для вне-легочного туберкулеза [15-18]. Иммунный ответ, вызываемый M. tuberculosis гуморальный иммунный ответ клеточный иммунный ответ (антитела) (т-клетки) Серологические исследования Кожные Тесты Новые методы (ELISA, экспресс-тесты и др.) пробы IGRA (IL-17, IP-10 и др.) ' ' ' 1 Возможность диагностики активного туберкулёза Диагностика латентного туберкулеза Рисунок 1. Методы иммунодиагностики туберкулеза. www.innoscience.ru Учитывая вышеперечисленные недостатки распространенных методов диагностики активного туберкулеза, а также с целью выявления латентной туберкулезной инфекции особое значение приобретает использование иммунологических методов диагностики. При этом иммунодиагностика туберкулеза, исходя из форм иммунного ответа (рисунок 1), может быть разделена на серологические тесты (обнаружение антител различных классов) и исследование специфического клеточного иммунитета (кожные туберкулиновые пробы, анализы, основанные на продукции гамма-интерферона in vitro и т.п.). Ряд авторов считает, что в настоящее время серологические методы лучше применять для диагностики активных форм туберкулеза, в то время как туберкулиновые пробы и IGRA (IGRA - interferon-gamma release assays) могут использоваться для выявления латентных форм заболевания [2]. ■ серологические исследования Разработка серологических методов исследования рассматривается как одно из наиболее перспективных направлений в диагностике активного туберкулеза, что обусловлено рядом преимуществ: эти методы просты в использовании, быстро выполнимы, не требуют больших затрат и сложного оборудования. Однако стоит отметить, что ВОЗ не рекомендует использование вышеуказанных тестов в связи с противоречивыми данными относительно их точности и ограниченной диагностической значимостью даже при активных формах заболевания [19]. Серологические методы диагностики в настоящее время доступны преимущественно в двух формах: лабораторные исследования, основанные на принципе ELISA, и быстрые в выполнении иммунохроматогра-фические тесты, предназначенные для использования в качестве экспресс-тестов. Было проведено большое количество исследований, посвященных оценке таких анализов, которые в последующих были обобщены в нескольких систематических обзорах [20-21]. Кроме того, в рамках Специальной программы исследований и подготовки специалистов по тропическим болезням Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)/UNICEF/ UNDP/Мирового банка было опубликовано исследование, в котором представлена оценка 19 коммерческих серологических экспресс-тестов для диагностики туберкулеза [22]. Проведенные обзоры показали, что в исследованиях различных авторов регистрируются значительные различия в показателях чувствительности и специфичности, что может свидетельствовать о неточности данных методов исследования (таблица 1). Несмотря на это, на сегодняшний день различные серологические тесты реализуются в странах со слабо развитой системой нормативно-правового регулирования, включая такие страны, как Индия, Китай, Бразилия, Пакистан, Бангладеш и Индонезия [2]. Интересно отметить, что данные системы были разработаны в высокоразвитых странах (Великобритания, Франция и др.), однако не были утверждены для клинического использования в этих странах и в настоящее время производятся только для экспорта [23]. Что касается официальной позиции ВОЗ, следует еще раз подчеркнуть, что в 2011 году был опубликован документ, согласно которому не рекомендуется использование серологических тестов для диагностики туберкулеза в связи со значительной вариабельностью данных об их чувствительности и специфичности [19]. Вместе с тем ВОЗ приветствует проведение исследований по усовершенствованию серологических тестов с целью создания систем экспресс-диагностики [23]. Тип анализа Форма туберкулеза Чувствительность Специфичность Ссылка ELISA Легочная 10-90% 47-100% [21] ELISA Внелегочная 0-100% 59-100% [20] Экспресс-тест Легочная 1-60% 53-99% [22] Таблица 1. Характеристики серологических исследований (по данным систематических обзоров) туберкулин содержит смесь антигенов, в том числе и не специфичных для M. tuberculosis, эта реакция может быть ложноположительной в условиях предшествующей вакцинации БЦЖ или на фоне инфекций, вызванных нетуберкулезными микобактериями. Кроме того, возможно развитие ложноотрицательных реакций у пациентов с иммунодефицитом с недостаточным Т-клеточным ответом, включая ВИЧ-инфицированных лиц, пациентов с иммунодефицитом, вызванным приемом различных лекарственных средств, включая глюкокортикостероиды, и др. (рисунок 2). Ложноотрицательные реакции могут регистрироваться также при тяжелом течении туберкулеза (менингит, милиарный туберкулез, казеозная пневмония и др.), сопровождающимся выраженным угнетением реактивности организма, и других состояниях [29-31]. В связи с вышеизложенным при анализе литературы отмечена существенная вариабельность показателей специфичности туберкулиновой пробы, которые в различных исследованиях составили соответственно: по данным А.А. Старшиновой и соавт. (2013) - 19,6%; JR Starke et al. (2014) - 56%; E De Keyser et al. (2014) - 57% [32-34]. Чувствительность же туберкулиновой пробы достигает по данным E De Keyser et al. (2014) - 64%; JR Starke et al. (2014) - 71%; А.А. Старшиновой и соавт. (2013) - 84,1% [32-34]. ■ ИММУНОДИАГНОСТИКА ЛАТЕНТНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА Как отмечалось выше, диагностика латентного туберкулеза в настоящее время основывается на методах оценки клеточного иммунного ответа. Данные методы можно разделить на несколько групп: кожные пробы с туберкулином или набором специфических антигенов, методы, основанные на продукции гамма-интерферона (IGRA), исследовании других цитокинов. Причины ложноотрицательного результата туберкулиновой пробы ' ' Связанные с качеством антигена-препарата Связанные с введением препарата Связанные с реактивностью организма тестируемого ч ч 1 • Нарушение производства • Неправильное хранение • Загрязнение балластными веществами и др. • Нарушение методики проведения пробы (недостаточная доза, подкожное введение) • Неправильная интерпретация результатов (погрешность измерения) • Возраст (<6 месяцев, >65 лет) • Особенности питания (недоедание) • Прививки, выполненные в течение 6 месяцев до туберкулиновой пробы • Острые инфекции (вирусные, грибковые, бактериальные и др.) • Хронические заболевания (саркоидоз, гипотиреоз, хроническая почечная недостаточность, гипопротеинемия и др.) • Болезни системы кроветворения (лейкозы, лимфомы и др.) • Иммунодефициты (врожденные и приобретенные, в том числе ВИЧ, ятрогенные вследствие терапии стероидами и другими иммуносупрессорами) Рисунок 2. Причины ложноотрицательного результата туберкулиновой пробы. Кожные пробы Первой разработанной кожной пробой, которая использовалась в здравоохранении на протяжении многих лет и до сих пор представлена в руководствах ВОЗ и национальных рекомендациях многих стран мира, является туберкулиновая проба (проба Манту, TST) [24-27]. Данная проба выполняется путем внутрикожного введения очищенного белка туберкулина, полученного при фильтрации культуры микобактерий туберкулеза. При условии инфицирования M. tuberculosis туберкулин вызывает реакцию гиперчувствительности замедленного типа, опосредованную Т-лимфоцитами, которая оценивается по наличию и размерам гиперемии и инфильтрата в месте введения через 72 ч [28]. Поскольку Из недостатков туберкулиновой пробы отмечают также плохую стандартизацию теста, его травматич-ность и болезненность, необходимость введения чужеродного белка при его проведении, субъективную оценку результатов и необходимость повторного визита для интерпретации результата [35]. Для устранения ряда представленных выше недостатков Е.А. Бородулина и соавт. предлагают альтернативный метод введения туберкулина [36-37]. Авторы показывают, что прик-тест с туберкулином является не менее информативным, чем проба Манту, предполагающая внутрикожное введение, но при этом он обладает рядом преимуществ: проба стандартизирована (задается одинаковая глубина повреждения кожи, менее зависима от квалификации среднего медицинского персонала), менее травматична и болезненна. В связи с последним этот метод более физиологически и психологически комфортен для детей, вследствие чего он более приемлем для проведения скрининга [37]. Указывается, что для прик-теста также требуется меньшая поверхность кожи, а оценка пробы носит более объективный характер [36]. Следует отметить, что в последнее десятилетие в Российской Федерации начала активно применяться новая внутрикожная проба отечественного производства - диаскин-тест. Он позволяет существенно уменьшить важные из вышеперечисленных недостатков стандартной туберкулиновой пробы: недостаточную чувствительность и специфичность. Принцип данного теста аналогичен пробе Манту, однако вместо туберкулина вводится так называемый «аллерген туберкулезный рекомбинантный», включающий в себя набор специфических белковых молекул, уникальных для M. tuberculosis: ESAT-6 (early secreted antigenic target 6, молекулярной массой 6 кДа) и протеин 10 (CFP10 - culture filtrate protein 10, МВ 10 кДа). Проведенные исследования показали, что использование вышеуказанных антигенов, специфичных для M. tuberculosis, обусловило более высокую специфичность, достигающую в исследованиях: А.А. Старшиновой и соавт. (2013) - 89,4%, Т.Ю. Салиной и соавт. (2010) - 83,3% [38, 32]. При этом отмечается более высокая чувствительность этого теста в сравнении с пробой Манту, которая составляет по данным различных авторов 77,3-94,4% [32, 38-39]. Важно отметить, что отдельное исследование, проведенное на небольшой выборке, показало, что диаскин-тест может быть отрицательным у больных с тяжелым течением туберкулеза и с сопутствующими заболеваниями [40]. Вышеуказанные достоинства метода показывают, что он имеет более высокую чувствительность и специфичность, однако, учитывая преимущества метода введения препарата посредством прик-теста, предложенного Е.А. Бородулиной, целесообразно апробировать введение специфических антигенов данным способом. Тесты, основанные на продукции гамма-интерферона, и другие лабораторные методы Разработка тестов IGRA является достижением последних десятилетий в диагностике латентного туберкулеза. IGRA представляют собой исследования крови in vitro, позволяющие количественно оценить специфический клеточный иммунитет. Наиболее распространенными тестами IGRA, доступными во многих странах, являются QuantiFERON-TB© Gold In-Tube (QFT-GIT) (Cellestis Ltd., Австралия) и T-SPOT.TB© (Oxford Immunotec, Великобритания). В обоих указанных тестах осуществляется стимуляция Т-клеток специфическими антигенами ESAT-6 и CFP10 (которые используются и в диаскин-тесте), однако в исследовании QFT-GIT проводится измерение уровней IFNy методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), в то время тест T-SPOT.TB основан на методе подсчета количества клеток, продуцирующих IFNy [31]. К настоящему времени было проведено значительное количество исследований по оценке IGRA, и на основании нескольких систематических обзоров можно сделать определенные выводы относительно основных характеристик, преимуществ и недостатков этих тестов [41-46]. Так, среди преимуществ IGRA отмечается отсутствие травматизации и необходимости введения антигена в организм тестируемого; более объективная оценка полученных результатов, не зависящая от кожной чувствительности; отсутствие перекрестной реактивности с БЦЖ и видами микобактерий, не вызывающими туберкулез, за счет использования специфических рекомбинантных антигенов; необходимость осуществления меньшего количества посещений медицинского работника, чем для кожных проб; более быстрое получение результатов [41-46]. Однако стоит отметить, что тесты IGRA, как и туберкулиновые пробы, отражают реакцию клеток иммунной системы при сенсибилизации к M. tuberculosis при различных клинических формах туберкулезной инфекции. Имеются данные, что они не позволяют дифференцировать латентную туберкулезную инфекцию и активную форму туберкулеза [44]. Также в отдельном исследовании отмечается низкая специфичность IGRA у пациентов с активным туберкулезом в условиях высокой распространенности инфекции. Так, по результатам исследований ВОЗ, чувствительность QFT-GIT и T-SPOT.TB в отношении активных форм туберкулеза составила 73% и 83% соответственно. Специфичность - 49% и 58% соответственно [47]. Эти показатели свидетельствуют в пользу низкой применимости IGRA в качестве теста, подтверждающего диагноз активного туберкулеза, в странах, эндемичных по этому заболеванию, с высоким уровнем латентного туберкулеза в популяции [44-45]. По мнению ряда авторов, в целом IGRA и туберкулиновые пробы не показаны для диагностики активного туберкулеза у взрослых [44-45, 48]. Следует подчеркнуть, что при диагностике латентной туберкулезной инфекции IGRA показали чрезвычайно высокую специфичность (>95%) за счет отсутствия перекрестной реакции с антигенами нетуберкулезных микобактерий. При этом стоит отметить, что специфичность в этих исследованиях была рассчитана у лиц с низким риском заражения в странах с низкой частотой встречаемости туберкулеза [45, 49]. Несмотря на важные преимущества, описанные нами ранее, следует отметить также ряд недостатков лабораторных тестов, основанных на продукции гамма-интерферона. Среди них: высокая стоимость методов, сложность их выполнения, необходимость специального технического оснащения лаборатории и обученного персонала. Следует также отметить, что во многих исследованиях отмечается значительная вариабельность результатов IGRA при обследовании одного и того же пациента. Так, A Zwerling et al. (2013) при повторных исследованиях лиц с интервалом в 1 год сообщают о реверсии (изменение положительного результата на отрицательный) 62% и конверсии (изменение отрицательного результата на положительный) 5,3% для теста QFT-GIT [50]. M Joshi et al. (2014) приводят данные об уровне реверсии QFT-GIT 45% и конверсии 3,2% при интервале 1 год [51]. Для теста T-SPOT.TB в исследовании TC King et al. (2015) показан уровень реверсии 17,6% и конверсии 0,8% при интервале между исследованиями >150 дней [52]. На наш взгляд, высокие показатели вариабельности тестов IGRA связаны, по крайней мере отчасти, с общей высокой вариабельностью индукции синтеза цитоки-нов в клеточных культурах (спонтанных и стимулированных), отмеченной нами при проведении различных исследований даже у здоровых пациентов (IL-8, TNFa и др). Правда, имеются данные, что использование автоматического анализатора ELISA вместо ручных методов может снизить вариабельность теста QFT-GIT [53]. Что касается официальной позиции ВОЗ относительно использования кожных тестов и IGRA для диагностики латентного туберкулеза, выполнение туберкулиновых проб рекомендуется в качестве скрининговых в странах, имеющих средний и низкий уровень экономического развития. При этом, несмотря на высокий уровень вариабельности, заявляется о возможности замены туберкулиновой пробы тестами IGRA в странах, имеющих высокий уровень экономического развития [27]. В РФ диагностика латентного туберкулеза в настоящее время полностью основывается на кожных пробах. Так, детям, вакцинированным БЦЖ, с 12 месяцев до 7 лет 1 раз в год в обязательном порядке с целью скрининга выполняется проба Манту (2 ТЕ ППД-Л). Детям, не вакцинированным БЦЖ, туберкулиновая проба проводится с возраста 6 месяцев 2 раза в год. Помимо этого, проба Манту используется с целью отбора лиц для проведения вакцинации БЦЖ, начиная с 2 месяцев [26, 28]. Диаскин-тест выполняется детям из вышеуказанных возрастных групп при положительном результате пробы Манту в качестве следующего этапа диагностики. Кроме того, этот тест используется с целью скрининга у детей в возрасте от 8 до 18 лет 1 раз в год. Стоит отметить, что детям, относящимся к группам риска, но не находящим- ся на диспансерном учете у фтизиатра, соответствующие кожные тесты выполняют 2 раза в год. При сомнительном или положительном результате диаскин-теста показано выполнение дополнительных инструментальных (рентгенография, КТ, МРТ) и лабораторных исследований (микроскопические и бактериологические исследования, ПЦР-диагностика) [26, 28]. Таким образом, как показал проведенный обзор литературы, на сегодняшний день отсутствуют идеальные методы диагностики туберкулеза, и особенно остро стоит вопрос относительно раннего выявления лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза, на латентной стадии. В связи с этим продолжается активный поиск новых альтернативных маркеров инфекции и осуществляются попытки усовершенствования существующих методов (в том числе и лабораторных). В частности, потенциальными биомаркерами могут быть IL-17 [54], хемокин IP-10 [55] и соотношение IFN-y/ TNF-a [56] и др., а для серологического исследования больных с подозрением на активный туберкулез предлагается использовать рекомбинантные протеины Rv0220, Rv2958c, Rv2994 и Rv3347c [57]. ВЫВОДЫ 1. Использование доступных на сегодняшний день серологических методов исследования не рекомендовано в связи с противоречивыми данными относительно их точности и ограниченной диагностической значимостью, что обусловливает необходимость усовершенствования данных методов. 2. Выполненный аналитический обзор литературы показал, что существующие в настоящий момент способы оценки клеточного иммунного ответа, использующиеся в качестве скрининговых для выявления латентного туберкулеза, имеют как преимущества, так и недостатки, в связи с чем требуется их усовершенствование и/или разработка новых дополнительных методик. 3. В целях оценки преимуществ совмещения метода введения прик-тестом рекомбинантных белков M. tuberculosis целесообразно исследование чувствительности и специфичности вышеуказанного метода при использовании ESAT-6 (early secreted antigenic target 6, молекулярной массой 6 кДа) и протеин 10 (CFP10 -culture filtrate protein 10, МВ 10 кДа). 4. В настоящее время для усиления диагностической чувствительности и специфичности целесообразно комбинировать доступные методы специфической диагностики туберкулеза, используя в качестве первого этапа диагностики кожные тесты.

About the authors

OS S Prylutskyi

Donetsk National Medical University n.a. Gorky

Email: aspr@mail.ru
PhD, professor, head of the Department of clinical immunology, allergology and endocrinology of Donetsk National Medical University n.a. M. Gorky. 212 Port-Arturnaya st., Donetsk, Ukraine, 83060

YuD D Rogovaya

Donetsk National Medical University n.a. Gorky

Email: julia.rogovaia@yandex.ru
student of Donetsk National Medical University n.a. M. Gorky.

References

Supplementary files