Применение ЭПР-спектрометрии для идентификации факта облучения низкоэнергетическими электронами семян пшеницы

Полный текст

Согласно информации, предоставленной Продовольственной и сельскохозяйственной организацией ООН (ФАО), мировые потери растениеводческой продукции составляют от 10 до 30 % [1]. Основные их причины – различные заболевания растений, вызываемые микроорганизмами (фитопатогенами), а также насекомые-вредители. В связи с этим возникает необходимость применения средств защиты растений.

Для борьбы с болезнями и вредителями растений активно применяют агрохимикаты. Однако у них есть ряд недостатков, среди которых можно выделить токсичность для людей и окружающей среды, а также загрязнение почвы и грунтовых вод [2]. В качестве альтернативы предлагают радиационные технологии, которые более эффективны и безопасны для окружающей среды [3].

Радиационную обработку сельскохозяйственных продуктов можно проводить с использованием гамма-излучения (⁶⁰Co или ¹³⁷Сs), электронного излучения с энергией до 10 МэВ и тормозного излучения до 5 МэВ [4]. Для эффективной защиты зерна от бактерий и грибов без негативного воздействия на пищевые качества необходима доза до 10 кГр [3], для уничтожения насекомых – 0,1…1,0 кГр [3, 5]. Такие параметры подходят для обработки семян, не предназначенных для посева.

В литературе [6] охарактеризован способ предпосевной обработки семян низкоэнергетическими (до 300 кэВ) электронами, при котором глубина проникновения излучения настолько мала, что позволяет избежать повреждения зародыша. Такие электронные ускорители представляют собой электронно-физические устройства и не содержат радиоактивных изотопов. У семян зерновых после обработки низкоэнергетическими электронами снижается зараженность фитопатогенами, ростовые показатели при этом существенно не нарушаются или даже улучшаются [6, 7].

Хотя радиационная обработка сельхозпродуктов имеет доказанные преимущества, существуют опасения в отношении такого подхода. Правила, установленные объединенными комитетами Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (ФАО), Международного агентства по атомной энергии (МАГАТЭ) и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), предписывают предотвращать чрезмерное или повторное облучение продуктов [4]. Для проверки соответствия продуктов требованиям безопасности используют специальные методы идентификации [8, 9]. Ионизирующее излучение вызывает образование в облучаемом материале свободных радикалов (парамагнитных частиц). Их количество зависит от поглощенной дозы излучения. Один из наиболее чувствительных методов идентификации факта облучения – спектрометрия на основе электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Он предусматривает изучение материалов с неспаренными электронами. Идентификация происходит путем поглощения магнитного поля объектом исследования и продуцированием квантовых переходов между энергетическими уровнями. Этот метод регламентируют российские (ГОСТ 31672-2012, ГОСТ 31652-2012, ГОСТ Р 52529-2006 и др.) и европейские (EN13708:2001, EN 1787:2000 и т. д.) стандарты.

Цель исследования – выявление возможности применения ЭПР-спектрометрии для идентификации факта облучения низкоэнергетическими электронами семян яровой пшеницы.

Для ее достижения решали следующие задачи: оценить связи между интенсивностью ЭПР-сигнала семян пшеницы и дозой облучения; изучить изменения динамики сигнала ЭПР со временем; проанализировать возможности и ограничения использования метода ЭПР-спектрометрии для определения факта облучения.

Методика. Объектом исследования служили семена яровой пшеницы сорта Ирень урожая 2023 г. I репродукции. Их облучали спустя год после сбора урожая на широкоапертурном ускорителе электронов «Дуэт» (Томск, Россия) с энергией 100 и 120 кэВ в диапазоне доз от 1 до 5 кГр с шагом 1 кГр. Необлученные семена использовали в качестве контроля. После облучения их помещали в полиэтиленовые пакеты и до пробоподготовки хранили при комнатной температуре без доступа света и относительной влажности не более 60 % в течение 14 суток. Далее семена измельчали в кофемолке «Kitfort» и просеивали через сито 0,5 мм. Из каждого образца отбирали по 30 мг вещества и помещали в кварцевую пробирку диаметром 4 мм. ЭПР-спектры образцов регистрировали с использованием спектрометра ESR70-03 XD/2 (Минск, Беларусь) на микроволновой полосе X. Частота СВЧ составляла 9,4 ГГц. Для повторных учетов (через 28 дней, 3 и 6 месяцев) образцы хранили в этих же пробирках в течение всего срока измерений. Эксперименты проводили в трех повторностях, по три пробирки на каждую повторность.

Параметры ЭПР-спектрометра во время регистрации были следующими: середина поля – 3350 Э; диапазон поля – 1000 Э; частота модуляции – 100 кГц; модуляция – 4 Э; мощность СВЧ – 50 мВт; коэффициент усиления – 50; время снятия спектра – 600 с.

G-фактор – параметр, который позволяет установить спин электрона и определить свойства парамагнитного центра. Его определяли по формуле:

h_v=gµ_B B

где h – постоянная Планка; v – СВЧ-частота X-диапазона; µ_В – магнетон Бора; В – выбранная точка магнитного поля (Тл).

Результаты анализировали с использованием Microsoft Excel 2022. Для каждой точки измерений рассчитывали среднее значение и стандартную ошибку. Статистическую значимость различий между облученными образцами и контролем, а также между опытными группами, полученными при различных энергиях (100 и 120 кэВ) и при одинаковых дозах, оценивали с применением t-критерия Стьюдента. Уровень значимости принимали равным p ≤ 0,05.

Результаты и обсуждение. Результаты анализа ЭПР-спектров семян пшеницы, полученных через 14 дней после радиационной обработки, демонстрируют увеличение интенсивности сигнала прямо пропорционально поглощенной дозе. Этот факт свидетельствует о перспективности использования ЭПР-спектрометрии для идентификации облученных семян пшеницы. Следует отметить, что контрольный образец также демонстрировал наличие слабого сигнала, обусловленного естественным фоновым уровнем свободных радикалов. Отмечена зависимость между энергией электронов и количеством образующихся свободных радикалов. В частности, амплитуда сигнала образца, облученного дозой 1 кГр при энергии электронов 100 кэВ, составляла 1260 отн. ед., а образца, облученного той же дозой, но при энергии электронов 120 кэВ, – 2190 отн. ед. (рис. 1). Увеличение амплитуды сигнала с ростом энергии электронов зарегистрировано для всех исследованных образцов. Это, вероятно, связано с увеличением проникающей способности электронов при повышении их энергии, что приводит к образованию свободных радикалов в более глубоких слоях зерна пшеницы. Известно [6], что глубина проникновения низкоэнергетического излучения с энергией 100 кэВ составляет 0,1 мм (100 мкм), 120 кэВ – 0,15 мм (150 мкм), это подтверждает выявленную закономерность увеличения интенсивности ЭПР-сигнала при повышении энергии электронов из-за образования свободных радикалов в более глубоких слоях зерна. Значение g-фактора для всех образцов оставалось стабильным и составляло 2,0048, что указывает на наличие углерод-центрированных радикалов.

 

Рис. 1. ЭПР-спектры образцов семян пшеницы, зарегистрированные спустя 14 дней после облучения электронами: а) энергия 100 кэВ ; б) энергией 120 кэВ.

 

Для образцов, подвергнутых воздействию электронов с энергией 100 кэВ, спустя 14 дней после облучения в дозах 1…5 кГр средняя интенсивность сигнала варьировала от 892±15,4 до 2793,7±3,8 отн. ед., демонстрируя отчетливую дозозависимую закономерность. В дальнейшем наблюдали постепенное снижение интенсивности, обусловленное распадом свободных радикалов, индуцированных ионизирующим излучением. Через 28 дней регистрируемая интенсивность уменьшилась в среднем на 16…38 % в зависимости от дозы облучения, что соответствовало диапазону значений от 746,7±4,2 до 1739±4,2 отн. ед. В последующие месяцы скорость затухания сигнала замедлилась, что свидетельствует о дифференцированной кинетике распада радикалов различной природы. Через 3 месяца интенсивность снизилась до 715,7±7,4…1295,3±5,2 отн. ед., что эквивалентно дополнительному ослаблению сигнала на 5…25 %, по сравнению с предыдущим этапом наблюдений. По истечении 6 месяцев она достигла 530,7±6,5…862,7±1,8 отн. ед., отражая снижение на 26…33 % относительно данных трехмесячного периода (рис. 2). Общее снижение интенсивности сигнала спустя 6 месяцев, по сравнению с 14-и дневным периодом для образцов, облученных электронами с энергией 100 кэВ, составило 41…69 % в зависимости от дозы облучения. Во всех случаях различия между облученными образцами и контролем были статистически значимыми (p ≤ 0,05).

 

Рис. 2. Кинетика распада свободных радикалов в образцах пшеницы, облученных электронами, с течением времени: а) энергия 100 кэВ ; б) энергия 120 кэВ .

 

Аналогичные закономерности отмечены и для образцов, облученных электронами с энергией 120 кэВ. Однако, как было отмечено ранее, на 14-е сутки интенсивность ЭПР-сигнала в этой группе оказалась несколько выше и находилась в диапазоне 892±15,4…3357±7,8 отн. ед. в зависимости от дозы, что обусловлено увеличением глубины проникновения электронов и формированием большего количества радикалов в структуре зерна. К 28-у дню снижение составило 16…32 %, а интенсивность соответствовала диапазону 746,7±4,2…2298,7±9,6 отн. ед. Далее темпы затухания сигнала несколько замедлились, что отразилось в снижении интенсивности через 3 месяца до 715,7±7,4…1209,7±24,3 отн. ед. Это эквивалентно ослаблению сигнала на 5…47 %, по сравнению с предыдущим этапом. Спустя 6 месяцев интенсивность составила 530,7±6,5…720,7±2,2 отн. ед., что отражает уменьшение на 26…41 %, по сравнению с трехмесячными данными (см. рис. 2). Общее снижение интенсивности сигнала спустя 6 месяцев относительно 14-и дневного периода для образцов, облученных электронами с энергией 120 кэВ, составило 41…78 % в зависимости от дозы облучения. Во всех случаях различия между облученными образцами и контролем были статистически значимыми (p ≤ 0,05).

Сопоставление результатов, полученных при различных энергиях облучения, демонстрирует, что на ранних этапах (14…28 дней) интенсивность сигнала при 120 кэВ была достоверно выше, чем при 100 кэВ. Разница в зависимости от дозы через 14 дней составляла от 8 до 55 %, через 28 дней – от 12 до 62 % (p ≤ 0,05 для всех доз). Особенно заметное усиление интенсивности сигнала при 120 кэВ наблюдали в интервале доз 1…3 кГр. Помимо эффекта от увеличения глубины проникновения электронов в структуру зерна, это также свидетельствует о повышенной эффективности генерации стабильных радикальных форм в группе, облученной при 120 кэВ. Однако на поздних сроках хранения (3 и 6 месяцев) различия между двумя сериями становились менее выраженными. Через 3 месяца превосходство 120 кэВ при дозах 1…3 кГр все еще сохранялось (разница составляла 15…44 %, p ≤ 0,05), но для высоких доз (4…5 кГр) оно нивелировалось. Через 6 месяцев различия были незначительными или даже в отдельных случаях наблюдали большее затухание сигнала в группе 120 кэВ, что, вероятно, связано с ускоренной релаксацией радиационно-индуцированных радикалов при более глубоком проникновении электронов. Это указывает на схожие кинетические закономерности деструкции парамагнитных центров в обоих вариантах облучения на поздних этапах.

В ходе регистрации сигнала на протяжении всего эксперимента все образцы находились в кварцевых пробирках с крышкой в атмосферном воздухе и при комнатной температуре. Подобный режим хранения мог способствовать ускоренному распаду радиационно-индуцированных радикалов из-за влияния кислорода и отсутствия герметичной среды. Даже в контрольных образцах, не подвергавшихся облучению, регистрировали постепенное снижение интенсивности сигнала – с 892±15,4 отн. ед. на 14-е сутки до 530,7±6,5 отн. ед. через 6 месяцев. Это, вероятно, связано с распадом природных стабильных радикалов, уже присутствующих в структуре зерна до начала эксперимента. Фоновый ЭПР-сигнал в контрольной группе мог быть обусловлен воздействием ультрафиолетового и коротковолнового солнечного излучения в период вегетации растения, что способствовало накоплению фотохимически-индуцированных свободных радикалов в клеточных структурах. Кроме того, возможным источником сигнала служит естественное радиационное фоновое излучение окружающей среды, а также процессы окислительно-восстановительного характера в составе биоматериала – в частности, самопроизвольное образование свободных радикалов в результате окисления липидов и других компонентов при хранении. Совокупность этих факторов могла сформировать исходный уровень сигнала в контрольных образцах, который демонстрировал тенденцию к снижению интенсивности с течением времени.

Такие результаты согласуются с ранее опубликованными данными [10], указывающими на аналогичную динамику изменения ЭПР-сигнала во времени в облученных органических матрицах. Авторами представлен общий вид спектров радиационно-индуцированного сигнала ЭПР после облучения образцов пшеницы в дозах от 1 до 27 кГр низкоэнергетическим пучком электронов с энергией 500 кэВ. Характер спектров схож с результатами, полученными в нашей работе, хотя энергия низкоэнергетических электронов была гораздо ниже – 100…120 кэВ. Кинетику распада радикалов в условиях эксперимента прослеживали спустя полгода наблюдений.

Особенность обработки низкоэнергетическим излучением –формирование высокой поглощённой дозы только в поверхностных слоях зерна пшеницы. При этом ростовые показатели (энергия прорастания, всхожесть, длина ростка и корешка) не нарушаются, поскольку зародыш семени занимает малую площадь в нижней части спинной стороны зерновки и количество импульсов низкоэнергетических электронов в зародыше меньше, чем в самой зерновке [6, 7].

Выводы. Результаты исследований свидетельствуют о наличии потенциала у использования спектрометрии электронного парамагнитного резонанса в качестве метода выявления факта облучения семян пшеницы в диапазоне доз от 1 до 5 кГр при энергии электронов 100 и 120 кэВ, что подтверждает линейная зависимость интенсивности сигнала от поглощенной дозы. Снижение различий между сигналами образцов с разными дозами в течение времени ограничивает применение метода для точного дозиметрического контроля. Спустя 6 месяцев после облучения интенсивность сигнала в зависимости от дозы уменьшилась на 41…69 % (100 кэВ) и 41…78 % (120 кэВ), по сравнению с данными, полученными на 14-е сутки после облучения, что необходимо учитывать при идентификации факта облучения продукции спустя продолжительный период после процесса радиационной обработки.

Сравнение результатов при энергиях 100 и 120 кэВ показало, что на ранних этапах (14 и 28 суток) во всех дозовых группах интенсивность сигнала при 120 кэВ была статистически достоверно (p ≤ 0,05) выше, что связано с большей глубиной проникновения электронов и, как следствие, более выраженным эффектом радиационного воздействия. Разница при отдельных дозах достигала 55 %. На более поздних сроках (3 и 6 месяцев) различия между сериями частично сохранялись, однако статистические различия наблюдали не во всех дозовых группах. Величина g-фактора, равная 2,0048, указывает на наличие в исследуемых образцах углерод-центрированных радикалов.

Кинетика затухания сигнала ЭПР носит двухфазный характер. В первые 14…28 дней после облучения происходит его интенсивное снижение, достигающее в зависимости от дозы облучения 16…38 % (100 кэВ) и 16…32 % (120 кэВ), по сравнению с результатами, зафиксированными на 14 день после, что связано с распадом короткоживущих радикалов. В последующий период скорость затухания снижается и спустя 3 месяца интенсивность сигнала уменьшается в среднем на 4…25 % (100 кэВ) и 4…47 % (120 кэВ), по сравнению с предыдущим этапом наблюдений, что свидетельствует о формировании более стабильных радикальных форм, сохраняющихся в течение длительного времени. По истечении 6 месяцев интенсивность сигнала уменьшилась на 26…33 % (100 кэВ) и 26…41 % (120 кэВ) отн. ед. относительно данных трехмесячного периода.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ.

Работа выполнена в рамках государственного задания по Программе деятельности Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» (проект 5ф6.1).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ.

В работе отсутствуют исследования человека или животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ.

Авторы работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Об авторах

И. М. Меджидов

Всероссийский научно-исследовательский институт радиологии и агроэкологии Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Автор, ответственный за переписку.
Email: immedzhidov@mail.ru
Россия, 249035, Калужская обл., Обнинск, Киевское ш., 1, корп. 1

В. А. Харламов

Всероссийский научно-исследовательский институт радиологии и агроэкологии Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Email: immedzhidov@mail.ru

кандидат биологических наук

Россия, 249035, Калужская обл., Обнинск, Киевское ш., 1, корп. 1

Н. Н. Лой

Всероссийский научно-исследовательский институт радиологии и агроэкологии Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Email: immedzhidov@mail.ru

кандидат биологических наук

Россия, 249035, Калужская обл., Обнинск, Киевское ш., 1, корп. 1

Д. И. Титова

Всероссийский научно-исследовательский институт радиологии и агроэкологии Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Email: immedzhidov@mail.ru

кандидат биологических наук

Россия, 249035, Калужская обл., Обнинск, Киевское ш., 1, корп. 1

Список литературы

Дополнительные файлы