Component composition of dwarf birch (Betula nana) secondary phloem

Full Text

Карликовая береза (Betula nana) — древовидный кустарник, представитель рода Береза, семейства Березовые (рис. 1). Ареал обитания данного вида приурочен к арктическим и субарктическим зонам Евразии и Северной Америки. Вне северных широт карликовую березу можно обнаружить в горных районах Европы. Широкое распространение вида свидетельствует о его экологической пластичности. Морфология Betula nana может изменяться от стелющегося кустарничка в северных регионах до крупного кустарника на юге ареала обитания [1]. Карликовая береза имеет стабилизирующее значение кустарничкового покрова типичной тундры, которое проявляется в препятствии развитию термокарстовых процессов [2]. Данный вид является неотъемлемой частью кормовой базы для оленеводства в условиях Крайнего Севера. Основную питательную ценность для оленей несут листья, почки, цветы и молодые побеги, богатые органическими и минеральными веществами. По окончании вегетационного периода (отсутствие высокопитательных органов) в качестве корма олени могут использовать кору карликовых растений [3, 4]. Анализ компонентного состава коры березы повислой показал, что содержание углеводной части во вторичной флоэме в 4 раза выше чем в корке, что свидетельствует о ее большой питательной ценности [5].

 

Рис. 1. Карликовая береза

Fig. 1. Dwarf birch

 

Внешний слой коры — корка — состоит из омертвевших клеток, выполняющих защитную функцию. Слой между коркой и вторичной флоэмой — перидерма — представляет собой комплекс производных феллогена. К производным феллогена относятся феллема и феллодерма. Феллема — это пробковая ткань, которая защищает растение от потери влаги и имеет терморегулирующую функцию вследствие низкой теплопроводности. Феллодерма выполняет запасающую функцию, депонируя органические вещества, которые используются феллогеном. Внутренняя часть коры представляет собой вторичную флоэму (луб), она выполняет функцию транспорта органических веществ от фотосинтезирующих органов к органам-акцепторам. Вторичная флоэма — комплексная ткань, где проводящую функцию выполняют ситовидные элементы, запасающую — лубяная паренхима, механическую — флоэмные волокна и склереиды. Образуется вторичная флоэма путем деления везикулярного камбия: клетки, отложенные наружу, образуют вторичную флоэму; внутрь — ксилему. Ксилема как проводящий элемент, обеспечивает восходящий ток воды и минеральных веществ. Как и флоэма, ксилема представляет собой комплексную ткань: проводящую функцию здесь выполняют сосуды и трахеиды, запасающую — паренхима, механическую — волокна либриформа (рис. 2) [6].

 

Рис. 2. Поперечный срез (ув. ×450) стволика березы карликовой (50 мкм): cork — корка; p — перидерма; SPh — вторичная флоэма; SX — вторичная ксилема

Fig. 2. Cross-section (×450 magnification) of a dwarf birch trunk (50 µm): cork — cortex; p — periderm; SPh — secondary phloem; SX — secondary xylem

 

С точки зрения деревообрабатывающей промышленности ксилема имеет большее значение, поскольку служит сырьем для целлюлозно-бумажной промышленности и производства пиломатериалов. Широкое использование древесины в производстве способствовало росту интереса к ее изучению. Вторичная флоэма входит в состав коры, которая является отходом деревообрабатывающей промышленности. Как следствие, она малоизучена, несмотря на важную роль в росте и развитии растения [7].

Основными компонентами как ксилемы, так и флоэмы являются целлюлоза, гемицеллюлозы, лигнин и экстрактивные вещества. Однако их соотношение различно. Для ксилемы характерно высокое содержание целлюлозы и лигнина, что обусловлено строением клеточной стенки сосудов и волокон либриформа, в то время как вторичная флоэма характеризуется высоким содержанием экстрактивных веществ. Концентрация и разнообразие экстрактивных веществ в коре вызвано многообразием выполняемых функций [7].

Несмотря на широкое распространение карликовой березы и разнообразие ее морфотипов, данных о компонентном составе данного вида нет. Исследование компонентного состава вторичной флоэмы карликовой березы позволит не только оценить ее питательную ценность как кормовой культуры, но и определить пути адаптации данного вида к неблагоприятным условиям окружающей среды.

Цель работы

Цель работы — определение путей адаптации карликовой березы к условиям тундровой зоны путем анализа компонентного состава вторичной флоэмы.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовали образец Betula nana, отобранный в августе 2020 г. в экспедиции на севере Восточно-Европейской равнины в зоне тундры (Россия, НАО, 68°03′N, 61°38′E). Образцы замораживали в жидком азоте и хранили в низкотемпературном холодильнике Thermo Scientific Forma 88 000 при температуре –80 °C. Для анализа использовали вторичную флоэму — слой между корой и древесиной стволика карликовой березы. Вторичную флоэму высушивали в лиофильной сушилке Labconco FreeZone и измельчали скальпелем до размера 0,5…1 мм.

Для анализа компонентного состава вторичной флоэмы была предложена оригинальная методика с применением экстракции этанолом и горячей водой, а также щелочного, кислотного и ферментативного гидролиза. В результате исследования вторичной флоэмы карликовой березы были определены следующие показатели: содержание гемицеллюлоз, целлюлозы, лигнина, экстрактивных веществ, растворимых в спирте и воде, в том числе пектина и крахмала (рис. 3).

 

Рис. 3. Схема анализа компонентного состава вторичной флоэмы

Fig. 3. Schematic diagram of secondary phloem component analysis

 

Для определения содержания пектиновых веществ измельченную абсолютно сухую флоэму подвергали ферментативному гидролизу. В качестве ферментного препарата пектолитического действия использовали Pectinex Ultra Color (Novozymes), содержащий пектинэстеразу и полигалактуроназу. Пектинэстераза осуществляет этерификацию пектиновых веществ, полигалактуроназа — расщепление α-1,4-связи [10]. Содержание пектиновых веществ рассчитывали по концентрации восстанавливающих сахаров в гидролизате. Концентрацию восстанавливающих сахаров определяли методом Шомоди — Нельсона [11].

Методика определения содержания крахмала включала в себя стадии щелочного и ферментативного гидролиза. Полученный в результате щелочного гидролиза раствор нейтрализовали уксусной кислотой. Ферментативный гидролиз проводили в два этапа: на первом этапе в раствор вносили Aquazym и инкубировали в течение 1 ч при температуре 50 °С, на втором этапе вносили Dyozym и выдерживали при тех же условиях. Данная методика обусловлена последовательностью реакций при гидролизе крахмала. На первом этапе Aquazym, обладающий амилолитической активностью, разрушает молекулу крахмала до декстринов с меньшей молекулярной массой. На втором этапе Dyozym благодаря высокой глюкоамилазной активности расщепляет полученные декстрины до глюкозы [13]. Исходя из концентрации глюкозы в полученном гидролизате рассчитывали содержание крахмала. Концентрация глюкозы была определена на автоматическом анализаторе глюкозы мембранного типа «Энзискан Ультра».

При использовании ферментных препаратов для анализа компонентного состава необходимо учитывать содержание свободных сахаров в анализируемой пробе и в ферментном препарате. Для этого параллельно с опытом проводили холостые пробы, с которыми выполняли те же манипуляции, но без использования ферментного препарата для определения свободных сахаров в пробе и без вторичной флоэмы для определения их содержания в используемом ферментном препарате.

Для определения содержания веществ, экстрагируемых горячей водой, измельченную вторичную флоэму кипятили в дистиллированной воде с присоединенным обратным холодильником, после чего сушили. По разнице масс рассчитывали содержание водорастворимых экстрактивных веществ.

Содержание веществ, растворимых в этиловом спирте определяли по разнице масс абсолютно сухой вторичной флоэмы и остатка после спиртовой экстракции. Полученный остаток кипятили в присутствии обратного холодильника в 2%-м растворе HCl. В результате чего гемицеллюлозы переходили в раствор в виде восстанавливающих сахаров, по концентрации которых рассчитывали содержание гемицеллюлоз. Остаток после кислотного гидролиза промывали дистиллированной водой до pH 7,0 и подвергали ферментативной обработке целлюлазами, ферментами, катализирующими расщепление целлюлозы.

Гидролиз целлюлозы возможен в присутствии комплекса целлюлолитических ферментов: эндо-, экзодеполимеразы и β-глюкозидазы. Эндоглюконазы катализируют разрыв гликозидных связей внутри целлюлозной цепи, уменьшая молекулярную массу молекулы и увеличивая их количество. Экзоглюконазы катализируют отщепление молекулы глюкозы (экзоглюкозидаза) или целлобиозы (экзоцеллобиогидролаза). Расщепление полученной в результате гидролиза целлобиозы на две молекулы глюкозы катализируется целлобиазой [16]. В качестве ферментных препаратов целлюлолитического действия при анализе компонентного состава вторичной флоэмы карликовой березы использовали биокатализаторы на основе рекомбинантных ферментных препаратов Penicillium verruculosum [17]. Расчет расхода ферментных препаратов проводили исходя из их активности и массы субстрата. По окончании ферментативного гидролиза целлюлоза расщепляется до глюкозы, по концентрации которой рассчитывали содержание целлюлозы.

После спиртовой экстракции, кислотного гидролиза и обработки целлюлазами в остатке вторичной флоэмы остается лигнин, содержание которого определяли по массе абсолютно сухого остатка после промывки.

Результаты и обсуждение

Вегетационный период карликовой березы определяется переходом среднесуточной температуры через границу 5 °С [5]. Согласно графику среднемесячных температур (рис. 4), вегетационный период Betula nana длится 3 мес и приходится на полярный день. Высокая инсоляция способствует усилению фотосинтеза [18]. Среднее количество осадков в области произрастания карликовой березы — 20 мм в год, но вследствие низкой транспирации в условиях пониженных температур карликовая береза не испытывает недостатка влаги. Кроме того, низкие температуры тундровой зоны ведут к снижению интенсивности дыхания растений. Высокая интенсивность фотосинтеза при низких затратах на дыхание ведет к увеличению продуктивности растения и, следовательно, к формированию избытка сахарозы [19].

 

Рис. 4. Среднемесячная температура в зоне сбора образцов карликовой березы по месяцам

Fig. 4. Average monthly temperature in the dwarf birch sampling area by month

 

Утилизация сахарозы происходит в тканях-акцепторах через ее гидролиз ферментами инвертазой и сахарозосинтазой. Сахарозосинтаза в присутствии уридинтрифосфата расщепляет сахарозу на фруктозу и уридиндифосфатглюкозу (УДФ-глюкозу). Выбор пути использования УДФ-глюкозы зависит от типа клетки-акцептора и локализации сахарозосинтазы. Примембранные сахарозосинтазы поставляют УДФ-глюкозу в целлюлозосинтазный комплекс для формирования клеточной стенки. Сахарозосинтазы, связанные с мембраной амилопласта, используют УДФ-глюкозу для образования крахмала. При этом наблюдения за активностью сахарозосинтазы во вторичных флоэме и ксилеме березы повислой показали, что в период активного камбиального роста продукты распада сахарозы предпочтительно используются для образования целлюлозы в ксилеме, в условиях торможения ксилогенеза, вызванного неблагоприятными условиями среды, сахароза утилизировалась преимущественно путем образования крахмала во флоэме. Инвертаза участвует в расщеплении сахарозы на фруктозу и глюкозу, которые используются для формирования компонентов клеточной стенки [20].

Для анализа влияния природных условий тундровой зоны на компонентный состав вторичной флоэмы карликовой березы представлены данные о компонентном составе луба березы повислой (Betula pendula) как типичного представителя рода Береза умеренной зоны [5] (таблица).

 

Компонентный состав вторичной флоэмы березы карликовой (Betula nana) и березы повислой (Betula pendula)

Component composition of secondary phloem in dwarf birch (Betula nana) and silver birch (Betula pendula)

Компонент	Betula nana	Betula pendula [5]
Целлюлоза	14,4 ± 3,3	23,4
Гемицеллюлозы	21,4 ± 1,2	21,8
Лигнин	27,4 ± 4,5	18,1
Экстрактивные вещества, растворимые в спирте	20,9 ± 3,2	15,8
Экстрактивные вещества, растворимые в воде	26,8 ± 2,7	19,3
пектиновые вещества	7,1 ± 1,7	–
крахмал	7,3 ± 1,5	–

 

Согласно полученным результатам, содержание экстрактивных веществ во вторичной флоэме карликовой березы выше, чем у березы повислой.

К растворимым в спирте веществам относятся жирные кислоты, липиды, фитостеролы и терпены. Доказано, что жирные кислоты и липиды способствуют адаптации растения к низким температурам. Под влиянием низких температур снижается текучесть клеточных мембран, что активирует синтез десатуразы, фермента, катализирующего превращение одинарной связи между атомами углерода в цепи жирных кислот в двойную. Полиненасыщенные жирные кислоты обеспечивают устойчивость растения к замерзанию [21]. Фитостеролы — производные изопреноидов, входят в состав плазматической мембраны растительной клетки. В растении фитостеролы могут находиться в свободном виде, образовывать сложные эфиры с жирными кислотами и гликозиды со свободными сахарами. Фитостеролы являются предшественниками фитогормонов — регуляторов роста и развития растения [22]. Терпены — это непредельные углеводороды, производные изопрена. Благодаря наличию кратной связи могут образовывать полимеры и кислородзамещенные производные, которые носят название — терпеноиды. Структурное разнообразие терпенов и терпеноидов обусловливает разнообразие выполняемых ими функций. Они являются участниками обменных процессов, участвуют в фотохимических реакциях, регулируют активность генов [23]. Таким образом, экстрактивные вещества участвуют в формировании устойчивости к неблагоприятным факторам среды, что необходимо для жизни в условиях Крайнего Севера.

К группе веществ, растворимых в воде, относятся таннины, красящие и пектиновые вещества, крахмал, свободные сахара. Таннины представляют собой полифенольные соединения. Благодаря своей способности связываться с белками, полисахаридами и биополимерами они выполняют защитную функцию [24]. Использование в методике анализа компонентного состава ферментных препаратов с высокой амилолитической и глюкоамилазной активностью позволило рассчитать содержание крахмала во вторичной флоэме, которое составило 7,3 %. Крахмал — это основное запасное вещество для растения. Он представляет собой полисахарид, состоящий из единиц D-глюкопиранозы, которые связаны α-1,4-связью в молекуле амилозы и α-1,4 с ответвлениями α-1,6 в молекуле амилопектина. В растении крахмал присутствует в виде крахмальных зерен [10]. Обработка измельченной вторичной флоэмы щелочью позволила улучшить доступ к крахмалу аксиальной паренхимы [11]. Содержание крахмала во вторичной флоэме относительно высокое, для сравнения — содержание крахмала в лубе березы повислой в период камбиального роста составляет 0,11 % [5], что обусловлено временем сбора образцов карликовой березы, которое соответствует замедлению ксилогенеза. Снижение интенсивности ксилогенеза на фоне высокой продуктивности карликовой березы ведет к формированию избытка сахарозы, которую необходимо утилизировать. Один из способов ее утилизации — образование крахмала. Локализация пула — вторичная флоэма — обусловлена слабым развитием запасающих органов, для рода Береза это листья и корни [5].

Среди водорастворимых веществ есть пектиновые вещества. Пектин — это полисахарид, состоящий из остатков D-галактуроновой кислоты, соединенных α-1,4-гликозидной связью, в растении чаще встречается в виде метилового эфира. Находится в срединной пластинке и в клеточных стенках паренхимных клеток внутренней части коры [9]. Пектиновые вещества набухают в воде, благодаря чему вода меньше испаряется и замерзает при более низких температурах [25]. Таким образом, высокое содержание пектиновых веществ во вторичной флоэме (7,1 %) может служить механизмом адаптации карликовой березы к низким температурам и круглосуточной инсоляции в вегетационный период.

Гемицеллюлозы коры представителей рода Береза состоят в основном из остатков глюкозы и ксилозы. Благодаря своей аморфной структуре и гидрофильным свойствам гемицеллюлозы замедляют высыхание тканей [26]. Содержание гемицеллюлоз во вторичной флоэме карликовой березы составляет 21,4 %, что не отличается от содержания их в лубе березы повислой — 21,8 %. Следовательно, гемицеллюлозы не имеют значения для адаптационных механизмов карликовой березы. Отметим, что гидролизат, полученный при кипячении вторичной флоэмы в 2%-м растворе НСl был малинового цвета. Пигменты растений извлекаются водой, однако водный экстракт, полученный при кипячении вторичной флоэмы, был коричневого цвета. Следовательно, малиновую окраску придали не пигменты, а продукты реакций, протекающих при кислотном гидролизе. Подобные цветные реакции характерны для веществ фенольной природы [24]. Фенольные соединения во вторичной флоэме могут быть таннинами и предшественниками лигнина, что может свидетельствовать о высокой степени лигнификации.

Такие компоненты клеточной стенки, как целлюлоза, гемицеллюлозы и лигнин, — связаны и формируют лигноцеллюлозную структуру тканей древесных растений [27]. Целлюлоза — самый распространенный полисахарид на Земле, который состоит из остатков β-глюкозы, данное положение ОН-группы у С1 обусловливает различие пространственной структуры молекул крахмала и целлюлозы [14, 15]. Содержание целлюлозы во вторичной флоэме карликовой березы ниже чем в березе повислой, в то время как содержание лигнина значительно выше. Высокие показатели лигнина во вторичной флоэме можно обнаружить во флоэмных волокнах и склереидах, паренхимные клетки луба не лигнифицируются. Лигнин принимает участие в защите растения от факторов стресса. В тундровой зоне это высокое УФ-излучение, вызванное круглосуточной инсоляцией [5]. Опыты по исследованию влияния экзогенной сахарозы на формирование вторичной флоэмы показали, что избыток сахарозы в период камбиального роста приводит к формированию склереид во вторичной флоэме березы повислой, что не характерно для рода Береза [28]. Таким образом, склерификация вторичной флоэмы является путем вывода избытка сахарозы для карликовой березы. Следовательно, высокий потенциал фотосинтеза на фоне низких затрат на дыхание приводит к избытку сахарозы, которая депонируется не только в виде крахмала, но и выводится за счет лигнификации клеток.

Кора карликовой березы служит кормовой базой для оленеводства. Основную питательную ценность для животного имеют крахмал и целлюлоза. Крахмал легко доступен для пищеварительных ферментов, его перевариваемость составляет от 94 до 97 %. Пищеварительные железы не вырабатывают целлюлаз, поэтому целлюлоза расщепляется под действием ферментов микроорганизмов, которые заселяют рубец и толстый кишечник. Целлюлоза — легкогидролизуемое соединение, однако во вторичной флоэме целлюлоза присутствует в виде лигноуглеводного комплекса. Соединения целлюлозы с лигнином и гемицеллюлозами затрудняют доступ ферментов к субстрату, следовательно, усвояемость целлюлозы снижается [29]. Несмотря на негативное влияние, оказываемое на питательную ценность целлюлозы, лигнин положительно влияет на амило- и целлюлозолитическую активность рубцовой жидкости, снижает количество вредоносных бактерий и азота в пищеварительном тракте животного [30]. Высокое содержание крахмала во вторичной флоэме карликовой березы делает ее хорошим ресурсом при выборе пастбищ для оленеводства. Высокое содержание лигнина, в свою очередь, снижает перевариваемость целлюлозы и гемицеллюлоз, но положительно сказывается на пищеварении животных. Пектиновые вещества, входящие в состав вторичной флоэмы, оказывают благоприятное влияние на выведение из организма биогенных токсинов и тяжелых металлов, находящихся в составе нерастворимых комплексов (нерастворимые комплексы, образованные пектиновыми веществами с биогенными токсинами и тяжелыми металлами). Также пектины препятствуют развитию гнилостных процессов в рубце [31].

Выводы

Вторичная флоэма, несмотря на свой небольшой объем, имеет важное значение для жизни растения. Анализ компонентного состава вторичной флоэмы карликовой березы позволил определить его адаптивный ответ на экстремальные условия арктической зоны, которая характеризуется высокой инсоляцией и низкими температурами в период короткого вегетационного периода. Примером адаптационных изменений компонентного состава карликовой березы к климатическим условиям тундровой зоны стали высокие содержания во вторичной флоэме экстрактивных и пектиновых веществ. Пектиновые вещества за счет своей влагоудерживающей способности снижают температуру замерзания и минимизируют негативный эффект от высокой инсоляции. Экстрактивные вещества выполняют защитную функцию в растении путем участия в обменных процессах и фотохимических реакциях. В период интенсивного ксилогенеза сахароза, которая образуется в избытке на фоне высокой продуктивности растения, используется для формирования целлюлозы вторичной стенки в ксилеме. В период снижения интенсивности ксилогенеза сахароза утилизируется преимущественно во вторичной флоэме путем накопления крахмала, что объясняет его высокое содержание. Другим путем вывода избытка сахарозы из обмена является склерификация клеток, на что указывает повышенное содержание лигнина. Оценка компонентного состава вторичной флоэмы в разные фазы вегетационного периода позволит точнее определить механизмы адаптации карликовой березы к условиям среды.

Благодарности

Выражаем благодарность Чухчину Дмитрию Германовичу и коллективу ЦКП НО «Арктика» Северного (Арктического) федерального университета имени М. В. Ломоносова за помощь в проведении исследования.

About the authors

Victoria A. Kamennaya

Northern (Arctic) Federal University named after M.V. Lomonosov

Author for correspondence.
Email: tory.kobzar@yandex.ru

Teaching master 

Russian Federation, 17, Naberezhnaya Severnoy Dviny, 163002, Arkhangelsk

Andrey S. Aksenov

Northern (Arctic) Federal University named after M.V. Lomonosov

Email: a.s.aksenov@narfu.ru

Cand. Sci. (Tech.), Professor 

Russian Federation, 17, Naberezhnaya Severnoy Dviny, 163002, Arkhangelsk

References

Supplementary files