Email this article In vitro deposition in selected Heuchera L. and ×Heucherella H.R. Wehrh. cultivars challenging for landscape design
- Authors: Mamaeva N.A.1, Krakhmaleva I.L.1, Molkanova O.I.1
-
Affiliations:
- The N.V. Tsitsin Main Botanical Garden of the Russian Academy of Sciences
- Issue: Vol 30, No 3 (2026)
- Pages: 55-69
- Section: Landscape architecture
- Published: 01.06.2026
- URL: https://journals.eco-vector.com/2542-1468/article/view/708055
- DOI: https://doi.org/10.17816/2542-1468-2026-3-55-69
- ID: 708055
Cite item
Full Text
Abstract
The article presents findings on the effectiveness of low temperature, reduced illumination, and the use of the growth retardant chlorocholine chloride (CCC) for in vitro deposition of Heuchera and ×Heucherella cultivars considered promising for landscape design. Six cultivars were examined: ‘Cherry Cola’, ‘Dew Drops’, ‘Midnight Rose Select’, ‘Pistache’, ‘Grape Soda’ and ‘Plume Cascade’. Two storage experiments were conducted: medium-term (10 months) and short-term (6 months). For medium-term storage of Heuchera cultivars over 10 months, the optimal conditions were 1/2 Murashige and Skoog medium supplemented with 40 g/L sucrose and 0,1 mg/L 6-benzylaminopurine, maintained at 15 ± 2 °C under a light intensity of 65 lux. Under these conditions, the viability of regenerants reached 54,4 %. After storage, 73,3…95,0 % of the plants retained the ability to regenerate, depending on the cultivar and storage conditions. The results indicate that cultivar-specific characteristics significantly influenced regeneration success following medium-term deposition. For short-term deposition of Heuchera and ×Heucherella cultivars, the most effective conditions were 1/2 Murashige and Skoog medium supplemented with 40 g/L sucrose and 0,3 mg/L 6-benzylaminopurine, at 8 ± 1 °C with a light intensity of 40…50 lux. Under these conditions, regenerant viability was 100 % across all cultivars and experimental variants. Furthermore, regenerative activity after short-term deposition remained at 100 % and was not affected by the genetic background of the cultivars.
Full Text
Представители родов гейхера (Heuchera L.) и гейхерелла (×Heucherella H.R.Wehrh.) — это декоративно-лиственные многолетние травянистые растения, входящие в состав семейства Камнеломковые (Saxifragaceae Juss.). К роду Heuchera относят 46 видов, распространенных в Северной Америке [1, 2]. Род ×Heucherella — культигенный. Его представители получены в результате гибридизации гейхеры трясунковидной (Heuchera × brizoides hort. ex Lemoine) и тиареллы сердцевидной (Tiarella cordifolia L.) [3].
В настоящее время роды гейхера (Heuchera L.) и гейхерелла (×Heucherella H.R.Wehrh.) активно применяются в составе широкого спектра ландшафтных композиций: от простых рабаток, выполненных на основе моносортовых посадок, до сложных, многокомпонентных миксбордеров (рис. 1). Некоторые сорта гейхеры и гейхереллы также могут быть использованы для интерьерного озеленения [4–6].
Рис. 1. Цветочные композиции с использованием сортов гейхеры (Heuchera L.) и гейхереллы (×Heucherella H.R.Wehrh.): а — гейхерелла в парке Appeltern (Нидерланды); б — гейхера в усадьбе С.Н. Худекова (Россия)
Fig. 1. Flower arrangements of the genera Heuchera and ×Heucherella: a — Appeltern Park (Netherlands); б — S.N. Khudekov estate (Russia)
Базовой характеристикой представителей родов гейхера (Heuchera L.) и гейхерелла (×Heucherella H.R.Wehrh.) является их принадлежность к группе малолетников [3, 7–9]. В связи с этим при поддержании коллекции in vitro этих культур в условиях нормального роста (температура 24 ± 2 °С, интенсивность света 1500 лк, фотопериод 16/8 ч) длительность пассажа составляет в среднем четыре недели [10–12]. Совершенствование приемов культивирования гейхеры и гейхереллы, индуцирующих устойчивое замедление ростовых процессов и увеличение продолжительности беспересадочного периода ныне приобрело актуальность, поскольку они имеют широкое распространение в ландшафтном проектировании. Это позволяет оптимизировать систему поддержания их генофонда в условиях in vitro.
Основополагающий принцип методики депонирования растений in vitro состоит в сохранении жизнеспособности в период хранения и восстановления регенерационной активности после завершения хранения.
Одним из наиболее эффективных методических подходов к длительному сохранению регенерантов in vitro считается их содержание в условиях замедленного роста [13–15]. Замедления ростовых процессов можно достичь благодаря использованию различных способов регуляции экзогенных факторов, в частности физически, т. е. манипуляций с условиями культивирования (снижение температуры и интенсивности света) и химических, т. е. модификаций состава питательной среды (уменьшение концентрации компонентов основы питательной среды, применение осмотиков и ретардантов).
В комплексе факторов, замедляющих метаболические процессы у растений in vitro, наиболее доступно и широко распространено депонирование растений при низких положительных значениях температуры [16]. Снижение температуры при культивировании регенерантов позволяет увеличить длительность пассажа до 6…24 мес. в зависимости от таксономического статуса объекта хранения. При этом избранный температурный диапазон должен коррелировать с экологическими характеристиками растений. Сохранение биологического материала культур, произрастающих в условиях умеренного климата, как правило, осуществляется при температуре 4…8 °С, для представителей тропической флоры — 10…15 °С [17–21].
Снижению кинетики роста регенерантов также способствует уменьшение интенсивности света [22]. Влияние этого стресс-фактора затрагивает как физиологические характеристики растений, снижая продуктивность фотосинтеза, так и изменяет анатомическое строение стебля регенерантов, в частности, слабее развиваются механические ткани и ткани центрального цилиндра. При этом активируется растяжение клеток, что обусловливает вытягивание микропобегов, и повышается уровень биосинтеза эндогенных ауксинов, что потенциально способствует дальнейшему развитию корневой системы. В технологии депонирования снижение интенсивности света используют, преимущественно, как вспомогательный элемент. Эффективность данного подхода изучена для некоторых биологических объектов: гипсофила каменная (Gypsophila petraea (Baumg.) Rchb.), гвоздика мозолистая (Dianthus callizonus Schott et Kotschy.), виноград культурный (Vitis vinifera L.) [23, 24].
Активное лимитирующее действие на ростовые процессы регенерантов оказывает добавление в состав питательной среды ретардантов. Наиболее широко применяют хлорхолинхлорид и паклобутразол [14, 25]. Физиологические аспекты действия хлорхолинхлорида связаны с сокращением вытягивания клеток, активацией камбия (формируются укороченные стебли) и ризогенезом (образуется большое количество коротких корней), биохимические — с индукцией биосинтеза этилена и абсцизовой кислоты, изменением метаболизма тканей (увеличивается содержание хлорофилла в листьях, повышается водоудерживающая способность тканей, усиливается отток пластических веществ в запасающие органы).
В настоящее время для представителей различных таксономических групп c применением ретардантов разработаны способы депонирования в условиях in vitro, что считается оптимальной системой сохранения генофонда представителей природной и культурной флоры ex situ [15, 26–33].
Цель работы
Цель работы — изучение эффективности депонирования при пониженных значениях температуры, освещенности и применения хлорхолинхлорида при среднесрочном и краткосрочном депонировании in vitro изученных сортов гейхеры (Heuchera L.) и гейхереллы (×Heucherella H.R.Wehrh.), перспективных для использования в озеленении.
Материалы и методы
Исследования проведены в Лаборатории биотехнологии растений Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН (ГБС РАН) в 2023–2025 гг.
В ходе работы последовательно выполнены два лабораторных эксперимента: среднесрочное (10 мес.) и краткосрочное (6 мес.) хранение регенерантов сортов гейхеры (Heuchera L.) и гейхереллы (×Heucherella H.R.Wehrh.).
В качестве объектов исследования выбраны шесть сортов гейхеры и гейхереллы:
- в первом эксперименте
Heuchera × hybrida hort. ‘Cherry Cola’,
Heuchera × hybrida hort. ‘Dew Drops’,
Heuchera × hybrida hort. ‘Midnight Rose Select;
- во втором эксперименте
Heuchera villosa Michx. ‘Pistaсhe’,
Heuchera × hybrida hort. ‘Cherry Cola’,
×Heucherella ‘Grape Soda’,
×Heucherella ‘Plume Cascade’ (рис. 2).
Рис. 2. Сорта Гейхереллы (×Heucherella H.R.Wehrh.) в различных условиях культивирования: ‘Plume Cascade’: а — in vivo; б — in vitro; ‘Grape Soda’: в — in vivo; г — in vitro
Fig. 2. Heucherella cultivars under different cultivation conditions: ‘Plume Cascade’: а — in vivo; б — in vitro; ‘Grape Soda’; в — in vivo; г — in vitro
При проведении экспериментов применяли общепринятые и разработанные в Лаборатории биотехнологии растений ГБС РАН способы [34, 35].
Использовали экспланты размером 1,5…2,0 см. Применяли питательную среду с минеральной основой Murashige and Skoog (MS) [36]: при депонировании — половину концентрации компонентов, при изучении восстановительной способности после хранения — полную. Состав питательной среды дополняли 6,8 г/л агара, 40 г/л сахарозы и 0,2 г/л хлорхолинхлорида (ТУР), а также 6-бензиламинопурином (6-БАП) в концентрации 0,1 мг/л в первом эксперименте и 0,3 мг/л — во втором. Для оценки восстановительной способности регенерантов после хранения использовали полную концентрацию компонентов питательной среды Murashige and Skoog, дополненную 0,2 мг/л 6-БАП и стандартные условия культивирования (температура 24 ± 2 °С, интенсивность света 1500 лк). На всех этапах исследования поддерживали фотопериод 16/8 ч.
В первом эксперименте — при среднесрочном хранении — изучали влияние пониженных значений температуры и интенсивности света (по сравнению со стандартными условиями культивирования) и наличия в составе питательной среды ретарданта на морфометрические показатели регенерантов.
Опыт проводили в два этапа:
- в условиях климатической камеры при температуре 15 ± 2 °С, интенсивности освещения 700 лк. Стандартные условия культивирования при температуре 24 ± 2 °С, интенсивности света 1500 лк (контрольный вариант);
- при наличии в составе питательной среды ТУР (0,2 г/л) как в климатической камере, так при стандартных условиях культивирования (контрольный вариант — отсутствие ретарданта в составе питательной среды).
Во втором эксперименте — при краткосрочном хранении — в условиях климатической камеры (при температуре 8 ± 1 °С) оценивали влияние различных режимов сохранения растительного материала на рост и развитие регенерантов на питательных средах разного компонентного состава.
Опыты проводили в следующих условиях:
- при различной освещенности: 40…50 лк; 500 лк (контрольный вариант);
- при наличии в составе питательной среды ТУР (0,2 г/л) и отсутствии ретарданта (контрольный вариант).
Во втором эксперименте снижали температуру и освещенность, увеличивали концентрацию 6-БАП.
Жизнеспособность (доля вегетирующих растений относительно общего количества в каждом варианте опыта) и морфометрические показатели регенерантов (число микророзеток, их высоту и число листьев (облиственность)) оценивали через каждые 2 мес. в первом эксперименте, через 3 мес. — во втором.
Статистическую обработку полученных экспериментальных данных осуществляли стандартными методами с использованием пакета программ IBM SPSS Statistics 23. Достоверные различия между вариантами опыта устанавливали с помощью множественного рангового критерия Дункана при P < 0,05. В таблицах и на гистограммах указаны средние значения изученных морфометрических признаков и их стандартные ошибки (±).
Результаты исследования
В ходе исследований были изучены различные режимы депонирования. На первом этапе работы исследована эффективность сохранения регенерантов в условиях замедленного роста и в стандартных условиях, оценена целесообразность применения хлорхолинхлорида.
Показано, что после 2 мес. депонирования жизнеспособность эксплантов гейхеры во всех вариантах опыта составляла 100 %. Добавление в питательную среду ретарданта способствовало снижению кинетики их роста в 1,2 раза. При этом наибольшее замедление ростовых процессов отмечали при сохранении эксплантов на средах, дополненных ТУР в условиях пониженных температуры и интенсивности света. Так, число и высота микророзеток в условиях климатической камеры составили 3,8 ± 0,2 шт. на эксплант и 9,3 ± 0,4 мм на среде с ТУР, 4,4 ± 0,2 шт. и 11,8 ± 0,4 мм на среде без ТУР. В стандартных условиях аналогичные морфометрические параметры составили 4,3 ± 0,1 шт. и 12,9 ± 0,5 мм на среде с ТУР, 5,3 ± 0,1 шт. и 13,3 ± 0,5 мм на среде без ТУР (рис. 3).
Рис. 3. Изменение морфометрических характеристик регенерантов гейхеры в процессе среднесрочного депонирования in vitro (при различных значениях температуры и на средах различного состава): а — жизнеспособность эксплантов; б — высота микророзеток; в — число микророзеток на эксплант
Fig. 3. Changes in morphometric characteristics of Heuchera regenerants during medium-term in vitro deposition under different temperatures and medium compositions: a — viability of explants; б — height of microrosettes; в — number of microrosettes per explant
Дальнейшее депонирование (с 4-го по 8-й месяц) показало снижение количества жизнеспособных эксплантов. В частности, на питательных средах без добавления ТУР при всех условиях хранения отмечали большую жизнеспособность растений. Так, на 8-й месяц культивирования этот показатель составил 72,2 % в климатической камере и 68,9 % в стандартных условиях, что больше в 1,2 и 1,1 раза соответственно, чем на средах с добавлением ТУР. Установлено, что в процессе сохранения высота микророзеток увеличивалась, а их число уменьшалось. Не были обнаружены отличия в изменении морфометрических параметров во всех вариантах опыта.
Установлено, что в период с 8-го по 10-й месяц депонирования жизнеспособность эксплантов уменьшилась в среднем в 1,6 раза. Таким образом, более длительное сохранение гейхеры (превышающее 10 мес.) без пересадки нецелесообразно. Выявлено, что до 10-го месяца наиболее эффективно депонирование на средах без ингибитора роста в условиях пониженных температуры и интенсивности света. Жизнеспособность эксплантов составляет 55,3 %. Наибольшее число микророзеток отмечали на средах без ТУР во всех вариантах физических условий (2,6 ± 0,2 и 2,5 ± 0,2 шт.), а различия по высоте микророзеток не были обнаружены (от 32,9 ± 1,5 до 36,7 ± 1,6 мм).
Кроме того, жизнеспособность и интенсивность роста эксплантов также зависят от сортовых особенностей гейхеры. Наибольшей жизнеспособностью характеризуется сорт ‘Cherry Cola’, у которого в течение 10 мес. хранения доля жизнеспособных эксплантов составила 70,8 %. У сорта ‘Dew Drops’ с 8-го по 10-й месяц депонирования отмечали снижение жизнеспособности эксплантов в 3,7 раза (с 61,4 до 16,7 %). Сорт ‘Midnight Rose Select’ в период до 10 мес. депонирования характеризовался наименьшей жизнеспособностью. Однако в дальнейшем у него доля жизнеспособных эксплантов оказалась больше (36,7 %), чем у сорта ‘Dew Drops’ (16,7 %). Наибольшей интенсивностью роста (числом микророзеток, образовавшихся до 2-го – 4-го месяца, и увеличением их высоты) отличаются сорта ‘Cherry Cola’ и ‘Dew Drops’. После 10 мес. хранения высота микророзеток у сорта ‘Cherry Cola’ составила 40,8 ± 0,9 мм, ‘Dew Drops’ — 39,6 ± 2,6 мм, ‘Midnight Rose Select’ — 25,3 ± 1,4 мм, а по числу микророзеток существенных различий не было установлено (от 2,2 ± 0,2 до 2,3 ± 0,2 шт.).
При депонировании растений in vitro важное значение имеет сохранение регенерационной способности эксплантов при отсутствии аномалий развития по завершении хранения.
После 10 мес. депонирования в зависимости от условий опыта способность к регенерации сохранялась у 73,3…95,0 % эксплантов (на среде Murashige and Skoog c 0,2 мг/л 6-БАП). Наибольшую регенерацию микророзеток (95,0 %) отмечали после сохранения в стандартных условиях на среде без добавления ретарданта, наименьшую (73,3 %) — в аналогичных условиях на среде с ТУР. Наибольшими морфометрическими показателями (числом микророзеток 7,5 ± 0,4 шт. и их высотой 24,4 ± 1,5 мм) отличались экспланты после депонирования в климатической камере на среде с ТУР. В других вариантах опыта по числу микророзеток и их высоте существенных различий не установлено (табл. 1).
Таблица 1
Морфометрические характеристики регенерантов гейхеры (Heuchera) после среднесрочного хранения при различных температурных режимах на средах разного состава
Morphometric characteristics of Heuchera regenerants after medium-term in vitro deposition under different temperatures and medium compositions
Условия хранения | Жизнеспособность, % | Высота микророзеток, мм | Число микророзеток на эксплант, шт. | |
1 | 23 °С | 95,0 a | 17,1 ± 1,1 b | 4,9 ± 0,4 b |
2 | 73,3 b | 17,0 ± 1,7 b | 5,0 ± 0,4 b | |
1 | 15 °С | 80,0 ab | 19,0 ± 1,3 b | 5,5 ± 0,3 b |
2 | 86,7 ab | 24,4 ± 1,5 a | 7,5 ± 0,4 a | |
Примечание: 1 — питательная среда Murashige and Skoog с половиной концентрацией компонентов без добавления ТУР; 2 — питательная среда Murashige and Skoog с половиной концентрацией компонентов, дополненная 0,2 г/л ТУР. Идентичными буквами отмечены значения морфометрических показателей без достоверных статистических различий, разными буквами — значения морфометрических показателей с наличием достоверных статистических различий. | ||||
По данным различных исследований [27, 37, 38], восстановительная способность регенератов после длительного хранения детерминирована их генетическими особенностями. При среднесрочном депонировании изученных в представленной работе сортов гейхеры эта закономерность прослеживается слабее (табл. 2).
Таблица 2
Морфометрические характеристики сортов гейхеры (Heuchera) после депонирования в течение 10 мес.
Morphometric characteristics of Heuchera cultivars after 10 months of deposition
Сорт | Жизнеспособность, % | Высота микророзеток, мм | Число микророзеток на эксплант, шт. |
‘Cherry Cola’ | 87,5 a | 21,4 ± 1,3 a | 5,8 ± 0,4 ab |
‘Dew Drops’ | 66,7 b | 20,1 ± 1,4 ab | 6,8 ± 0,6 a |
‘Midnight Rose Select’ | 95,8 a | 17,8 ± 1,2 b | 5,4 ± 0,3 b |
Примечание: идентичными буквами отмечены значения морфометрических показателей без достоверных статистических различий, разными буквами — значения морфометрических показателей с наличием достоверных статистических различий. | |||
По жизнеспособности регенератов от двух других изученных сортов гейхеры достоверно отличается сорт ‘Dew Drops’, характеризующийся наименьшим значением этого показателя (66,7 %). Таким образом, в эксперименте по среднесрочному депонированию исследуемые сорта гейхеры по регенерационной способности располагаются в следующем порядке: ‘Midnight Rose Select’ (90,0…100,0 % в зависимости от условий и состава питательной среды) ˃ ‘Cherry Cola’ (70,0…90,0 %) ˃ ‘Dew Drops’ (50,0…80,0 %). Также выявлены статистически значимые различия между сортами ‘Cherry Cola’ и ‘Midnight Rose Select’ по высоте микророзеток: 21,4 ± 1,3 и 17,8 ± 1,2 мм соответственно. Однако высота микророзеток не оказывает непосредственного влияния на регенерационную активность растений.
На втором этапе работы осуществлено изучение эффективности различных режимов сохранения регенерантов в условиях климатической камеры и использования в составе питательной среды ТУР.
Установлено, что в течение 6 мес. хранения жизнеспособность регенерантов у всех изученных сортов гейхеры и гейхереллы во всех вариантах опыта не изменяется и составляет 100 %. Некротизации, витрификации и других аномалий развития микророзеток не зафиксировано.
После 3 мес. культивирования условия хранения, не снижая жизнеспособность растений, оказывали влияние на процессы их роста и развития. Снижение освещенности (с 500 до 40–50 лк) приводило к уменьшению числа микророзеток в 1,1 раза при увеличении их облиственности в 1,2 раза. Различия между морфометрическими показателями регенерантов статистически значимые. По высоте микророзеток достоверных различий не выявлено (рис. 4).
Рис. 4. Изменение морфометрических характеристик регенерантов гейхеры и гейхереллы в процессе краткосрочного депонирования in vitro (при разном уровне освещенности и на средах разного состава): а — высота микророзеток; б — число микророзеток на эксплант; в — число листьев у микророзеток
Fig. 4. Changes in morphometric characteristics of Heuchera and ×Heucherella regenerants during short-term in vitro deposition under different light intensities and medium compositions: а — height of microrosettes; б — number of microrosettes per explant; в — number of leaves in microrosettes
Добавление в состав питательной среды регулятора ТУР способствовало снижению числа микророзеток у всех изученных сортов гейхеры и гейхереллы при обоих режимах освещенности: в 1,2 раза при 500 лк, в 1,1 раза — при 40…50 лк. Однако предпочтительно использование ретарданта при освещенности 500 лк, поскольку кроме бόльшего замедления разрастания растений. Это способствует снижению облиственности микророзеток (в 1,2 раза) при статистически недостоверном изменении их высоты (11,0 ± 0,3 мм при 500 лк и 12,9 ± 0,5 мм при 40…50 лк).
В процессе дальнейшего депонирования (с 3-го по 6-й месяц) сортов гейхеры и гейхереллы установлено, что снижение освещенности способствует уменьшению числа микророзеток и их высоты в 1,5 и 1,4 раза соответственно. При этом их облиственность изменяется незначительно и составляет 5,8 ± 1,3 шт. в условиях освещенности 500 лк и 5,5 ± 0,9 шт. — при 40…50 лк.
Добавление в состав питательной среды ТУР способствует статистически достоверному снижению числа микророзеток у исследуемых сортов гейхеры и гейхереллы (в 1,2 раза) освещенности 500 лк. Уменьшение ее до 40…50 лк детерминирует статистически недостоверное изменение числа микророзеток (5,4 ± 1,0 шт. на средах с добавлением ТУР, 5,5 ± 1,2 шт. — на средах без ТУР). На изменение кинетики роста регенерантов наибольшее влияние оказывает снижение интенсивности света с 500 лк до 40…50 лк, а также использование ретарданта в составе питательной среды при освещенности 40…50 лк. В обоих вариантах опыта высота микророзеток сокращается в 1,2 раза. Все изученные режимы депонирования детерминируют статистически недостоверное изменение облиственности микророзеток. Абсолютные значения этого показателя варьируют в очень узких пределах: от 5,8 ± 1,2 до 5,5 ± 1,1 шт. (см. рис. 3).
На рост и развитие регенерантов гейхеры и гейхереллы существенно влияют их сортоспецифические особенности. После 6 мес. хранения стабильно низкой интенсивностью разрастания характеризуется сорт ‘Pistaсhe’ (число микророзеток варьирует от 3,1 ± 0,3 до 4,9 ± 0,5 шт., в зависимости от условий хранения), стабильно высокой — сорт ‘Cherry Cola’ (от 7,0 ± 1,5 до 7,8 ± 1,6 шт.). Наибольшая вариабельность этого показателя, в зависимости от режимов хранения, отмечена у сорта ‘Plume Cascade’: 2,8 ± 0,7 шт. — при освещенности 40…50 лк и наличии в составе питательной среды ТУР, 8,7 ± 1,4 шт. — при 500 лк, но в отсутствие ТУР. Максимальное замедление размножения сортов ‘Cherry Cola’, ‘Plume Cascade’ и ‘Pistaсhe’ достигается за счет снижения освещенности (40…50 лк) вне зависимости от состава питательной среды. Число микророзеток составляет соответственно: 7,0 ± 1,8 — без добавления ТУР, 2,8 ± 0,8 — с добавлением ТУР и 3,1 ± 0,3 шт. — без ТУР. У сорта ‘Grape Soda’ наименьшие число микророзеток отмечено на питательных средах без добавления ретарданта вне зависимости от интенсивности света: 7,0 ± 2,0 шт. — при освещенности 500 лк, 7,1 ± 2,3 шт. — при 40…50 лк.
На изменение числа листьев у изученных сортов гейхеры и гейхереллы наиболее существенное, но не одинаковое влияние оказывает режим освещенности в 500 лк. При таком условии у цветнолистных сортов ‘Cherry Cola’, ‘Plume Cascade’ и ‘Grape Soda’ наблюдается уменьшение облиственности микророзеток (относительно вариантов опыта с пониженной освещенностью) в 1,5; 1,3 и 1,2 раза соответственно. При этом минимальные значения отмечены у ‘Cherry Cola’ — 4,6 ± 0,8 шт., у ‘Plume Cascade’ — 4,2 ± 0,7 шт., у ‘Grape Soda’ — 3,8 ± 0,5 шт. на питательных средах без добавления ТУР. На зеленолистный сорт ‘Pistaсhe’ освещенность 500 лк оказывает обратное воздействие, активируя процесс образования новых листьев. У него в этом режиме облиственность микророзеток (6,1 ± 1,2 шт.) достоверно превышает идентичный показатель в других вариантах опыта, между которыми статистически достоверных различий не установлено.
Таким образом, после 6 мес. хранения для всех изученных в эксперименте сортов гейхеры и гейхереллы оптимальной является питательная среда Murashige and Skoog с половиной концентрацией компонентов, дополненная 6-БАП (0,3 мг/л) без добавления ТУР при температуре 8 ± 1 °C и освещенности 40…50 лк. Это снижает кинетику роста регенерантов без уменьшения их жизнеспособности и наличия аномалий развития. Число микророзеток составляет 5,5 ± 0,8 шт., высота микророзеток — 16,7 ± 0,4 мм, облиственность — 5,5 ± 1,6 шт. (см. рис. 3).
После завершения краткосрочного хранения сортов гейхеры и гейхереллы установлено, что у всех изученных генотипов во всех вариантах эксперимента способность к регенерации составила 100 %. У эксплантов не были выявлены морфологические изменения, отсутствовали каллус и обводненные микророзетки и др. Между морфометрическими показателями регенерантов, депонированных в течение 6 мес. при разных условиях, установлено отсутствие статистически значимых различий (табл. 3, рис. 5).
Таблица 3
Морфометрические характеристики регенерантов гейхеры и гейхереллы после краткосрочного хранения при разном уровне освещенности на средах разного состава
Morphometric characteristics of Heuchera and ×Heucherella regenerants after short-term deposition under varying light intensities on media of different compositions
Условия хранения | Высота микророзеток, мм | Число микророзеток на эксплант, шт. | Доля наиболее развитых микророзеток, % | Число листьев у наиболее развитых микророзеток, шт. | |
1 | 500 лк | 10,7 ± 0,1 а | 6,0 ± 1,4 а | 26,8 a | 11,1 ± 0,5 a |
2 | 10,5 ± 0,1 а | 6,8 ± 1,0 а | 22,4 a | 10,8 ± 0,3 a | |
1 | 40-50 лк | 10,6 ± 0,1 а | 8,5 ± 1,3 а | 19,4 ab | 10,7 ± 0,5 a |
2 | 10,6 ± 0,1 а | 8,1 ± 0,9 а | 15,7 b | 10,5 ± 0,3 a | |
Примечание: 1 — питательная среда Murashige and Skoog с половиной концентрацией компонентов без добавления ТУР. 2 — питательная среда Murashige and Skoog с половиной концентрацией компонентов, дополненная 0,2 г/л ТУР. Идентичными буквами отмечены значения морфометрических показателей без достоверных статистических различий, разными буквами — значения морфометрических показателей с наличием достоверных статистических различий. | |||||
Рис. 5. Развитие регенерантов Heuchera villosa сорта ‘Pistaсhe’ после краткосрочного депонирования in vitro при различных режимах и на питательных средах разного состава: а — освещенность 40…50 лк с добавлением ТУР, б — 40…50 лк без ТУР, в — освещенность 500 лк с ТУР, г — 500 лк без ТУР
Fig. 5. Development of Heuchera villosa ‘Pistaсhe’ regenerants after short-term in vitro deposition under different conditions and on nutrient media of different compositions: а — 40…50 lx illumination with the addition of ССС, б — 40…50 lx without ССС, в — 500 lx illumination with ССС, г — 500 lx without ССС
Исключение составляет количество наиболее развитых микророзеток. Значения этого показателя существенно снижаются (15,7 %) после хранения регенератов на питательной среде с добавлением ТУР в условии пониженной освещенности (40…50 лк), по сравнению с применением режима освещенности 500 лк вне зависимости от состава питательной среды (без ретарданта — 26,8 %, с ТУР — 22,4 %). Таким образом, после краткосрочного депонирования влияние созданных в эксперименте физических и химических факторов на регенерационную активность растений незначительное. На морфометрические показатели регенератов, характеризующие регенерационную активность, их генетические особенности оказывают в целом несущественное влияние (табл. 4).
Таблица 4
Морфометрические характеристики некоторых сортов гейхеры и гейхереллы после депонирования в течение 6 мес.
Morphometric characteristics of Heuchera and ×Heucherella cultivars after 6 months of deposition
Сорт | Высота микророзеток, мм | Число микророзеток на эксплант, шт. | Доля наиболее развитых микророзеток, % | Число листьев у наиболее развитых микророзеток, шт. |
‘Cherry Cola’ | 10,6 ± 0,1 а | 6,6 ± 0,6 b | 25,2 a | 10,0 ± 0,1 b |
‘Grape Soda’ | 10,7 ± 0,1 а | 6,5 ± 1,0 b | 20,6 a | 10,6 ± 0,4 ab |
‘Pistaсhe’ | 10,5 ± 0,1 а | 10,4 ± 0,7 a | 15,3 a | 11,2 ± 0,3 a |
‘Plum Cascade’ | 10,6 ± 0,1 а | 5,8 ± 0,8 b | 23,2 a | 11,4 ± 0,2 a |
Примечание: идентичными буквами отмечены значения морфометрических показателей без достоверных статистических различий, разными буквами — значения морфометрических показателей с наличием достоверных статистических различий. | ||||
По числу микророзеток достоверно отличается от других сортов, использованных в эксперименте сорт ‘Pistaсhe’ (10,4 ± 0,7 шт.), а число листьев у полностью сформированных микророзеток существенно выше у двух сортов — ‘Pistaсhe’ (11,2 ± 0,3 шт.) и ‘Plum Cascade’ (11,4 ± 0,2 шт.). При этом абсолютные показатели облиственности микророзеток, несмотря на выявленные статистически значимые различия, мало отличаются.
Таким образом, при среднесрочном депонировании изученных сортов гейхеры и гейхереллы условия хранения и состав питательных сред оказывают существенное влияние на рост и развитие регенерантов, а при краткосрочном депонировании такая зависимость не выявлена. На восстановительную способность регенератов после депонирования (как среднесрочного, так и краткосрочного) также оказывают влияние генетические особенности растений, однако оно не доминирует. Полученные экспериментальные данные позволяют рассматривать депонирование in vitro как эффективную составляющую системы поддержания биоразнообразия представителей растительного мира ex situ с применением методов биотехнологии.
Выводы
- Установлено, что питательная среда Murashige and Skoog с половиной концентрацией компонентов, дополненная 40 г/л сахарозы и 0,1 мг/л 6-БАП при температуре 15 ± 2 °С и интенсивности света 650 лк является оптимальной при хранении регенерантов изученных сортов гейхеры в течение 10 мес.;
- Выявлено, что по завершении среднесрочного депонирования жизнеспособность регенерантов гейхеры составила 54,4 % (в среднем по всем изученным сортам), а способность к регенерации сохранилась у 80,0 % эксплантов;
- Установлено, что применение питательной среды Murashige and Skoog с половиной концентрацией компонентов, дополненной 40 г/л сахарозы и 0,3 мг/л 6-БАП при температуре 8 ± 1 °C и освещенности 40…50 лк оптимально при хранении регенерантов изученных сортов гейхеры и гейхереллы в течение 6-ти мес.;
- Показано, что жизнеспособность регенерантов всех изученных сортов гейхеры и гейхереллы после 6 мес. хранения составила 100 % при следующих морфометрических показателях: число микророзеток 5,5 ± 0,8 шт., высота микророзеток — 16,7 ± 0,4 мм, облиственность микророзеток — 5,5 ± 1,6 шт. (в среднем по изученным сортам);
- Выявлено, что добавление в состав питательной среды ретарданта ТУР в концентрации 0,2 г/л как при среднесрочном, так и при краткосрочном депонировании изученных сортов гейхеры и гейхереллы оказалось неэффективным;
- Установлено, что после среднесрочного хранения на регенерационную активность эксплантов изученных сортов гейхеры доминирующее влияние оказывают генетические особенности;
- Показано, что по завершении краткосрочного хранения изученных сортов гейхеры и гейхереллы их генетические особенности не оказывают существенного влияния на регенерационную активность эксплантов.
Работа выполнена в рамках государственного задания ГБС РАН (№ 126020916823-0).
About the authors
Natal’ya A. Mamaeva
The N.V. Tsitsin Main Botanical Garden of the Russian Academy of Sciences
Author for correspondence.
Email: mamaeva_n@list.ru
Cand. Sci. (Biology), Senior researcher of Plant Biotechnology Laboratory
Russian Federation, 4, Botanicheskaya st., 127276, MoscowIrina L. Krakhmaleva
The N.V. Tsitsin Main Botanical Garden of the Russian Academy of Sciences
Email: seglory@bk.ru
Researcher of Plant Biotechnology Laboratory
Russian Federation, 4, Botanicheskaya st., 127276, MoscowOl’ga I. Molkanova
The N.V. Tsitsin Main Botanical Garden of the Russian Academy of Sciences
Email: molkanova@mail.ru
Cand. Sci. (Agriculture), Leading researcher, Head of Plant Biotechnology Laboratory
Russian Federation, 4, Botanicheskaya st., 127276, MoscowReferences
- The world flora online, Heuchera L. Available at: https://www.worldfloraonline.org/taxon/wfo-4000017800 (accessed 30.06.2025).
- Heuchera L. Available at: https://powo.science.kew.org/taxon/urn:lsid:ipni.org:names:30001424-2 (accessed 30.06.2025).
- Heims D., Ware G. Heucheras and Heucherellas. Portland, Cambridge: Timber Press, 2005, 208 p.
- Isachkin A.V., Kryuchkova V.A., Sharafutdinov H.V., Skakova A.G. Dekorativnoe sadovodstvo s osnovami landshaftnogo proektirovaniya [Ornamental gardening with the basics of landscape design]. Moscow: Infra-M, 2016, 525 p.
- Shutova A.G., Shish S.N., Getko N.V., Shamshur G.R., Spiridovich Ye.V. Vertikal'noye ozeleneniye-innovatsionnoye budushcheye ekologicheskoy biotekhnologii [Vertical gardening — an innovative future of ecological biotechnology]. Nauka i innovatsii [Science and Innovation], 2021, no. 5 (219), pp. 69–74.
- Burganskaya T.M., Makoznak N.A., Berozko O.M., Volchenkova G.A. Proyektirovaniye modul'nykh tsvetnikov prirodno-landshaftnogo tipa [Design of modular flower beds of natural landscape type]. Minsk: BSTU, 2023, 136 p.
- Kuznetsova T.N. Astil'by, geykhery, khosty [Astilbes, geicheras, hostas]. Nizhny Novgorod: Slog, 2012, 110 p.
- Belyayeva T.N. Biologicheskiye osobennosti dekorativnykh dvudol’nykh mnogoletnikh rasteniy pri introduktsii v usloviyakh yuzhnoy taygi Zapadnoy Sibiri [Biological features of ornamental dicotyledonous perennial plants during introduction in the conditions of the southern taiga of Western Siberia]. Diss. Dr. Sci. (Biol.), 03.02.01. Tomsk, 2021, 959 p.
- Baranova O.G. Predstaviteli semeystva Saxifragaseae v kollektsii «Al’piyskiye gorki» Botanicheskogo sada Petra Velikogo BIN RAN [The representatives of the family Saxifragaceae in the collection «Alpine Slides» of the Peter the Great Botanical Garden of Komarov Botanical Institute of RAS]. Problemy botaniki Yuzhnoy Sibiri i Mongolii [Problems of Botany of South Siberia and Mongolia], 2023, v. 22, no. 1, pp. 26–30. doi: 10.14258/pbssm.2023005
- Hosoki T., Kajino E. Shoot regeneration from petioles of coral bells (Heuchera sanguinea Engelm.) cultured in vitro, and subsequent planting and flowering ex vitro. In vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 2003, v. 39, pp. 135–138. doi: 10.1079/IVP2002363
- Guseva M.V., Krakhmaleva I.L. Osobennosti regeneratsii raznykh sortov Heuchera i ×Heucherella v kul’ture in vitro [In vitro regeneration features of different cultivars Heuchera and ×Heucherella]. Integral, 2021, no. 4, pp. 423–434. doi: 10.24412/2658-3569-2021-10077
- Xu C., Guo H., Wang Z., Chen Y. Development and comparative analysis of initiation ability in large-scale Heuchera propagation using tissue culture versus cuttings // Scientific Reports, 2023, v. 13, no. 1, p. 14785. doi: 10.1038/s41598-023-42001-8
- Rajasekharan Р.E., Sahijram L. In vitro conservation of plant germplasm. Plant Biology and Biotechnology Volume II: Plant Genomics and Biotechnology. Chapter: Conservation of Plant Germplasm, 2015, pp. 418–443. doi: 10.1007/978-81-322-2283
- Mitrofanova I.V., Mitrofanova O.V., Ivanova N.N., Brailko V.A., Lesnikova-Sedoshenko N.P. Modelirovaniye kontroliruyemykh usloviy, neobkhodimykh dlya adaptatsii i dlitel'nogo khraneniya rastitel’nogo materiala dekorativnykh, aromaticheskikh i plodovykh kul’tur v genobanke in vitro [Modeling of controlled conditions necessary for adaptation and long-term storage of plant material of ornamental, aromatic and fruit crops in a genebank in vitro]. Metodicheskiye rekomendatsii [Methodical recommendations]. Ed. I.V. Mitrofanova. Simferopol: Arial, 2018, 72 p. doi: 10.32514/978-5 907118-88-1
- Molkanova O.I., Gorbunov Yu.N., Shirnina I.V., Egorova D.A. Primenenie biotekhnologicheskikh metodov dlya sokhraneniya genofonda redkikh vidov rasteniy [Use of biotechnological methods for conservation of gene pool of rare plant species]. Botanicheskiy zhurnal [Botanical J.], 2020, v. 105, no. 6, pp. 610–619. doi: 10.31857/S0006813620030072
- Reshetnikov V.N., Spiridovich Ye.V., Nosov A.M. Biotekhnologiya rasteniy i perspektivy yeye razvitiya [Plant biotechnology and prospects of its development]. Fiziologiya rasteniy i genetika [Plant Physiology and Genetics], 2014, v. 46, no. 1, pp. 3–18.
- Cherevchenko T.M., Buyun L.I., Ivannikov R.V., Kovalskaya L.A., Hoang Nghia Son Cokhranenie tropicheskikh i subtropicheskikh orkhidnykh v NBS im. N.N. Grishko NAN Ukrainy: teoreticheskie i prakticheskie aspekty [Conservation of tropical and subtropical orchids at M.M. Gryshko national botanic garden, NAS of Ukraine: theoretical and practical aspects]. Fundamental’nі ta prikladnі aspekti suchasnoї orkhіdologії [Fundamental and applied aspects of modern orchidology], 2014, v. 1, pp. 135–146.
- Mursaliyeva V.K., Sarsenbek B.T., Algazy A.T., Turasheva S.K., Mukhanov T.M., Murzataeva T.Sh., Sitpaeva G.T. Vvedeniye in vitro i regeneratsionnaya sposobnost’ reliktovogo endemika Nedzvetskiya semirechenskaya Niedzwedzkia semiretschenskia B. Fedtsch [Establishment of in vitro and regeneration ability of the relict endemic Niedzwedzkia semiretschenskia B. Fedtsch]. Byulleten’ Karagandinskogo gosudarstvennogo instituta. Seriya «Biologiya. Meditsina. Geografiya [Bulletin of the Karaganda University. Series «Biology. Medicine. Geography»], 2023, no. 3 (111), pp. 115–124. doi: 10.31489/2023BMG3/115-124
- Konstantinov A.V., Kulagin D.V., Panteleyev S.V. Razrabotka unifitsirovannoy tekhnologii mikrorazmnozheniya i podderzhaniya kollektsii perevivayemykh kul’tur tkaney berez sektsii Albae Regel [Development of a unified micropropagation technology and maintenance of transplanted tissue cultures collection of the Albae Regel section birch]. Rol’ botanicheskikh sadov i dendrariev v sokhranenii, izuchenii i ustoychivom ispol’zovanii raznoobraziya rastitel’nogo mira: mater. Mezhdunarodnoy nauchnoy konferentsii, posvyashchennoy 85-letiyu Tsentral’nogo botanicheskogo sada Natsional’noy akademii nauk Belarusi [The role of botanical gardens and arboretums in the conservation, study and sustainable use of plant diversity: mater. International Scientific Conference dedicated to the 85th anniversary of the Central Botanical Garden of the National Academy of Sciences of Belarus]. Minsk, Belarus, June 6–8. Minsk, Belarus: Medisont, 2017. pp. 245–248.
- Doroshenko N.P., Puzyrnova V.G. Sposob sozdaniya kollektsii genofonda vinograda in vitro [Method for creating grape gene pool collection in vitro]. Mezhdunarodnyy nauchno-issledovatel’skiy zhurnal [International Research J.], 2022, no. 5 (119), pp. 44–50. doi: 10.23670/IRJ.2022.119.5.007
- Kirkach V.V. Sovershenstvovaniye tekhnologii razmnozheniya rasteniy roda Rubus L. in vitro s primeneniyem fiziologicheski aktivnykh veshchestv v malykh i sverkhmalykh dozakh [Improvement of the technology of propagation of plants of the genus Rubus L. in vitro using physiologically active substances in small and ultra-small doses]. Diss. Cand. Sci. (Biol.), 06.01.08. Moscow, 2019, 244 p.
- Kreslavskiy V.D., Karpentiyer R., Klimov V.V., Murata N., Allakhverdiyev S.I. Molekulyarnyye mekhanizmy ustoychivosti fotosinteticheskogo apparata k stressu [Molecular mechanisms of photosynthetic apparatus resistance to stress]. Biologicheskiye membrany [Biological membranes], 2007, v. 24, no. 3, pp. 195–217.
- Rodica C., Mitoi M.E., Helepciuc F., Holobiuc I. In vitro conservation under slow growth conditions of two rare plant species from Caryophyllaceae family. Electronic J. of Biology, 2010, v. 6 (4), pp. 86–91.
- Sobolev A.A. Obosnovaniye priyemov svetovoy biotekhnologii pri klonal’nom mikrorazmnozhenii vinograda [Justification of light biotechnology techniques for clonal micropropagation of grapes]. Diss. Cand. Sci. (Biol.), 06.01.07. Krasnodar, 2004, 225 p.
- Belokurova V.B. Metody biotekhnologii v sisteme meropriyatiy po sokhraneniyu bioraznoobraziya rasteniy [Methods of biotechnology in the system of efforts for plant biodiversity preservation]. Tsitologiya i genetika [Cytology and Genetics], 2010, v. 44, no. 3, pp. 58–72.
- Mitrofanova I., Molkanova O. Biotechnology ways of plant biodiversity conservation in botanical gardens of Russia. The First International Symposium on Botanical Gardens and Landscapes: Program and Abstracts, Bangkok, December 02-04, Bangkok, 2019, p. 5. Available at: http://plantscience.sc.mahidol.ac.th/bgl2019 (accessed 02.07.2025).
- Orlova N.D., Rayeva-Bogoslovskaya Ye.N., Molkanova O.I., Miroshnichenko A.S., Guseva M.V. Osobennosti deponirovaniya nekotorykh sortov Lonicera caerulea L. kul’ture in vitro [Features of deposition of some varieties of Lonicera caerulea L. in vitro culture]. AgroEkoInfo [AgroEcoInfo]. 2022, no. 2, pp. 11–15. Available at: http://agroecoinfo.ru/STATYI/2022/2/st_210.pdf (accessed 02.07.2025). doi: 10.51419/202122210
- Mitrofanova I.V., Ivanova N.N., Mitrofanova O.V., Lesnikova-Sedoshenko N.P. Osobennosti deponirovaniya khrizantemy sadovoy v usloviyakh in vitro [Features of deposition of garden chrysanthemum under in vitro conditions]. Byulleten’ Gosudarstvennogo Nikitskogo botanicheskogo sada [Bulletin of the State Nikita Botanical Garden], 2019, no. 131, pp. 110–117. doi: 10.25684/NBG.boolt.131.2019.15
- Kritskaya T.A., Kashin A.S. Osobennosti dlitel’nogo deponirovaniya kul’tury in vitro nekotorykh redkikh i ischezayushchikh vidov rasteniy Samarskoy oblasti [Features of in vitro cold storage of some of rare and endangered plants of Saratov region]. Izvestiya Saratovskogo universiteta. Khimiya. Biologiya. Ekologiya [Izvestiya of Saratov University. Chemistry. Biology. Ecology], 2016, no. 16 (1), pp. 74–80. doi: 10.18500/1816-9775-2016-16-1-74-80
- Antsipovich V.V. Deponirovaniye natsional’noy kollektsii kartofelya [Depositing the national potato collection]. Nauka i innovatsii [Science and Innovation], 2019, no. 6 (196), pp. 12–16.
- Shivayogeppa G., Adiga J., Prabhuling G., Reddy B.S., Sathyanarayana B.N. In vitro approaches for conservation Dahlia (Dahlia variabilis L.). Acta Horticulturae, 2010, v. 865, pp. 387–391. doi: 10.17660/ActaHortic.2010.865.57
- Kovaleva I.S., Matsneva A.E., Khanbabayeva O.E., Mazaeva A.S., Sorokopudov V.N. Razrabotka optimal’nykh usloviy dlitel’nogo deponirovaniya kollektsii ozdorovlennykh klonov floksa metel’chatogo (Phlox paniculata L.) [The development of optimal conditions of long-term deposition of improved clones of a Phlox paniculata L. collection]. Vestnik Krasnoyarskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta [The Bulletin of Krasnoyarsk Agrarian University], 2019, no. 8 (149), pp. 47–51.
- Zhdanova I.V. Dlitel’noye khraneniye eksplantov lavandy i lavandina in vitro [Long-term storage of lavender and lavandin explants in vitro]. Ustoychivost’ rasteniy i mikroorganizmov k neblagopriyatnym faktoram sredy: tezisy dokladov VI Vserossiyskoy nauchnoy konferentsii s mezhdunarodnym uchastiem [Resistance of Plants and Microorganisms to Adverse Environmental Factors: Abstracts of the VI All-Russian Scientific Conference with International Participation]. Irkutsk, Bolshoye Goloustnoye, July 3–7. Irkutsk: Irkutsk State University, 2023, p. 172.
- Butenko R.G. Biologiya kletok vysshih rastenij in vitro i biotekhnologiya na ih osnove [Biology of higher plant cells in vitro and biotechnology based on them]. Moscow: FBK-PRESS, 1999, 160 p.
- Molkanova O.I., Koroleva O.V., Stacheeva T.S., Krakhmaleva I.L., Meleshchuk E.A. Sovershenstvovanie tekhnologii klonalnogo mikrorazmnozheniya tsennykh plodovykh i yagodnykh kultur dlya proizvodstvennykh usloviy [Improvement of clonal micropropagation technology of valuable fruit and berry crops varieties for commercial conditions]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK [Achievements of Science and Technology of AIC], 2018, v. 32, no. 9, pp. 66–69. doi: 10.24411/0235-2451-2018-10915
- Murashige T., Skoog F. Arevised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962, v. 15, no. 43, pp. 473–497.
- Yegorova N.A., Zagorskaya M.S., Abdurashitov S.F. Osobennosti dlitel’nogo sokhraneniya myaty sortov Azhurnaya i Bergamotnaya v kollektsii in vitro [Features of long-term preservation of Azhurnaya and Bergamotnaya mint cultivars in an in vitro collection]. Izvestiya vuzov. Prikladnaya khimiya i biotekhnologiya [Proceedings of universities. applied chemistry and biotechnology], 2022, v. 12, no. 1, pp. 64–75. doi: 10.21285/2227-2925-2022-12-1-64-75
- Pronina I.N. Vliyaniye deponirovaniya na rizogenez in vitro i adaptatsiyu ex vitro sortov yabloni [Effect of deposition on in vitro rhizogenesis and ex vitro adaptation of apple varieties]. Agroekologicheskiye aspekty ustoychivogo razvitiya APK: materialy XVI Mezhdunarodnoy nauchnoy konferentsii [Agroecological Aspects of Sustainable Development of the AIC: proceedings of the XVI International Scientific Conference]. Bryansk, March 21. Bryansk: Bryansk State Agrarian University, 2019, pp. 273–277.
Supplementary files
