BACKGROUND: The search for new criteria for semen quality based on the evaluation of the structural and functional state of the sperm genome remains a relevant task in reproductive medicine.
AIM: This work aimed to assess DNA integrity and the content of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in the same ejaculated spermatozoa obtained from patients with normozoospermia and pathozoospermia.
METHODS: The study included semen samples from 63 patients with normozoospermia (n = 33) and pathozoospermia (n = 30). Microscopic slides were prepared from the samples, on which fragmented DNA was first detected using the TUNEL assay, followed by digital image acquisition. Subsequently, 5hmC was detected by indirect immunofluorescence, and digital images of the same microscopic fields were acquired again. In total, 126,000 spermatozoa were analyzed (2000 per sample).
RESULTS: A substantial proportion of spermatozoa (72.8%–94.2%) in all samples showed no DNA integrity violations and exhibited a low (background) level of 5hmC. The proportions of spermatozoa exhibiting DNA fragmentation, increased hydroxymethylation, or both characteristics simultaneously were 0.05%–13.8%, 0.15%–11.5%, and 0.99%–13.38%, respectively. The proportion of spermatozoa with DNA fragmentation and/or DNA hyperhydroxymethylation did not differ between patients with normozoospermia and those with pathozoospermia. DNA fragmentation and DNA hyperhydroxymethylation in ejaculated spermatozoa were found to be interdependent, and their coexistence in gametes was nonrandom.
CONCLUSION: The nonrandom coexistence of DNA fragmentation and DNA hyperhydroxymethylation in spermatozoa, along with the interdependence of these features, indicates a common trigger, most likely oxidative stress. However, the presence of additional factors leading to DNA damage or altered hydroxymethylation levels may explain the less than complete overlap of these features in spermatozoa. The assessment of DNA fragmentation and hydroxymethylation levels in spermatozoa appears to be a promising approach for evaluating semen quality and identifying potential causes of idiopathic infertility.
Обоснование. Поиск новых критериев качества эякулята, основанных на оценке структурно-функционального состояния генома сперматозоидов — актуальная задача репродуктологии.
Цель исследования. Оценка целостности ДНК и содержания 5-гидроксиметилцитозина (5hmC) в одних и тех же эякулированных сперматозоидах, полученных от пациентов с нормозооспермией и патоспермией.
Методы. Исследование проведено на образцах эякулята 63 пациентов с нормозооспермией (n=33) и патоспермией (n=30). Из образцов готовили микроскопические препараты, на которых последовательно выявляли фрагментированную ДНК методом TUNEL, получали цифровые фотоизображения, выявляли 5hmC методом непрямой иммунофлуоресценции и снова получали цифровые фотоизображения тех же полей зрения. Всего проанализировано 126 000 сперматозоидов — по 2000 в каждом образце.
Результаты. Значительная доля сперматозоидов (72,8–94,2%) во всех образцах характеризовалась отсутствием нарушений целостности ДНК и низким (фоновым) уровнем 5hmC. Доля сперматозоидов, в которых были выявлены фрагментация ДНК, повышенный уровень гидроксиметилирования или обе характеристики одновременно составила 0,05–13,8, 0,15–11,5 и 0,99–13,38% соответственно. Доля сперматозоидов с фрагментацией и/или гипергидроксиметилированием ДНК не отличалась у пациентов с нормозооспермией и патоспермией. Установлено, что фрагментация и гипергидроксиметилирование ДНК в эякулированных сперматозоидах взаимозависимы, и их сочетание в гаметах носит неслучайный характер.
Заключение. Неслучайность сочетания в сперматозоидах фрагментации ДНК и ее гипергидроксиметилирования и взаимозависимость этих характеристик свидетельствует об их общем триггере, которым, вероятнее всего, является окислительный стресс. При этом наличие других факторов, приводящих к повреждению ДНК или изменению уровня ее гидроксиметилирования, объясняет не 100% совпадение этих характеристик в сперматозоидах. Оценка фрагментации ДНК и уровня ее гидроксиметилирования в сперматозоидах представляется перспективной для определения качества эякулята и выявления потенциальных причин идиопатического бесплодия.