SUBPOPULATION LYMPHOCYTE STRUCTURE IN EXPERIMENTAL MOUSE INFECTION CAUSED BY VARIANTS OF ONE TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS STRAIN

Full Text

Введение Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) относится к группе флавивирусов млекопитающих, переносимых клещами. Репликация ВКЭ в центральной нервной системе приводит к серьезным неврологическим расстройствам, таким как менингит, энцефалит или менингоэнцефалит. В настоящее время патогенетические механизмы клещевого энцефалита, в том числе взаимодействие вируса с иммунной системой, активно изучаются, но все еще остаются не до конца ясными. В экспериментах на лабораторных животных было показано, что штаммы ВКЭ могут значительно различаться по своим патогенетическим характеристикам. Например, при инфекции, вызванной периферическим введением штамма Софьин, наблюдается более короткая средняя продолжительность жизни и более высокая летальность по сравнению с другими штаммами, такими как Осима [6, 11]. Каким образом вирулентность вируса связана с особенностями формирования иммунного ответа при флавивирусной инфекции, остается изученным недостаточно. Как и другие вирусы, ВКЭ обладает способностью модифицировать действие иммунной системы и уходить от его распознающего влияния. Например, вирус приводит к формированию внутриклеточных везикул, которые могут защищать вирусную РНК от клеточного распознавания через RIG-I- и MDA-5-пути [14, 15, 21] и таким образом отодвигать время начала индукции ИФН 1-го типа. ВКЭ также обладает способностью к репликации в разных типах клеток иммунной системы. Показано, что T-клетки могут поддерживать репликацию штаммов вируса КЭ: Абсеттаров, Найдорфл, Hypr 71 [8]. В литературе имеются сведения о взаимодействии дендритных клеток и вируса КЭ [8, 17]. Однако эти данные носят фрагментарный характер, в настоящее время недостаточно изучены молекулярно-клеточные механизмы взаимодействия вируса с макроорганизмом, в частности мало известно о влиянии эффекторов как врожденного, так и адаптивного иммунитета на течение КЭ. Показано, что ВКЭ может существовать в виде стабильной гетерогенной популяции, содержащей варианты, обладающие селективным преимуществом при репродукции либо в клещах, либо в млекопитающих. Варианты одного и того же штамма могут значительно различаться по своим патогенетическим характеристикам и, соответственно, по способности индуцировать противовирусный иммунный ответ. Характер активации врожденного и адаптивного иммунного ответа может зависеть от соотношения этих вариантов в популяции. Цель работы - изучение иммунофенотипических особенностей лимфоцитов мышей при экспериментальной инфекции, вызванной клонами 57 и 58, являющимися вариантами одного штамма ВКЭ. Материалы и методы исследования Экспериментальные животные. Использованы мыши линий Balb/c (SPF, самки, 15-16 г), полученные из питомника лабораторных животных «Пущино», содержащиеся в условиях вивария ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова». Вирусы, используемые в работе. ВКЭ: варианты 57 и 58, полученные клонированием бляшек из популяции адаптированного к клещам варианта штамма ЭК-328 (Romanova et al., 2007). Штамм относится к сибирскому подтипу ВКЭ. Варианты 57 и 58 отличаются друг от друга двумя аминокислотами в поверхностном белке Е. Ранее в экспериментах на мышах клоны продемонстрировали различия по нейроинвазивности и чувствительности к интерферону. Животных заражали интраперитонеально, по 0,3 мл 1 000 000 БОЕ вируса в виде культурально-жидкостно-инфицированных клеток почки эмбриона свиньи. В каждой группе исследовано по 6 мышей. Получение суспензии мононуклеарных лейкоцитов (МЛ). Суспензию спленоцитов получали, гомогенизируя селезенку в 5 мл среды RPMI 1640 (ПанЭко, Россия). Клетки осаждали 10 мин центрифугированием со скоростью 250 g в мин при температуре 4 °С. Осадок ресуспендировали и удаляли эритроциты гипотоническим шоком: к осадку добавляли 900 мкл дистиллированной воды и перемешивали 10 с, затем добавляли 100 мкл 10-кратного раствора Хэнкса (МПБП, Россия). После лизиса эритроцитов спленоциты осаждали и дважды отмывали средой RPMI. Подсчет живых и мертвых клеток проводили в камере Горяева, используя 0,1%-ный раствор трипанового синего в 0,9%-ном растворе NaCl. Оценку субпопуляционной структуры лимфоцитов селезенки мышей осуществляли методом проточной цитометрии с применением моноклональных антител против соответствующих антигенов различных субпопуляций лимфоцитов. Клетки отмывали холодным фосфатно-солевым буфером с 1%-ной фетальной телячьей сывороткой и окрашивали согласно инструкции производителя (e-Bioscience, США) моноклональными антителами, меченными флюорохромом к поверхностным клеточным маркерам (СD3, CD4, CD8, CD19, MHC II, меченые FITC; CD25, NK1.1 - PE; Foxp3 - APC, СD45 - PerC7). Затем клетки отмывали 2 раза холодным фосфатно-солевым буфером с 1%-ной фетальной телячьей сывороткой. Результаты учитывали на проточном цитометре FC-500 (фирмы Beckman Culter, США). Гейт (окно) популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 10 000 клеток в гейте. Статистическую значимость различий уровня цитокинов между группами оценивали непараметрическими методами исследования с помощью критерия Манна-Уитни. Статистически достоверными считали различия при p ≤ 0,05. Результаты и их обсуждение Исследование субпопуляционной структуры лимфоцитов селезенок мышей, зараженных вариантами ВКЭ, выявило некоторые особенности. Оба вируса не вызывали повышение численности Т-клеток (СD45/CD3) по сравнению с интактными мышами. Количество Т-хелперов (СD3/CD4) и СTL (цитотоксических лимфоцитов (CD3/CD8) оставалось также на уровне контроля (таблица). Влияние штаммов ВКЭ на субпопуляционную структуру лимфоцитов селезенок мышей Balb/c Маркеры Количество клеток, M ± Sd, % ЭК 58 57 57 + 58 Интактные CD45/СD3 59,4 ± 4,2*↑ 32,8 ± 2,8 39,8 ± 2,1 19,5 ± 1,2*↓ 32,5 ± 3,1 CD16/32 2,1 ± 0,3*↓ 3,0 ± 0,2*↓ 1,8 ± 0,4*↓ 3,9 ± 0,4*↓ 7,3 ± 0,6 NKT (СD3/CD16/32) 0,8 ± 0,2*↑ 0,1 ± 0,04*↓ 0,1 ± 0,03*↓ 0,4 ± 0,4 0,4 ± 0,05 СD3/CD4 43,8 ± 4,1*↑ 22,7 ± 2,1 28,4 ± 2,1 13,1 ± 0,9*↓ 25,6 ± 1,5 СD45/CD25 14,0 ± 0,8*↑ 15,3 ± 1,2*↑ 13,4 ± 1,0*↑ 13,1 ± 1,8*↑ 9,0 ± 0,4 T-reg CD4/CD25/Foxp3 0,4 ± 0,05*↓ 0,5 ± 0,03*↓ 0,3 ± 0,02*↓ 0,3 ± 0,03*↓ 0,9 ± 0,4 CD45/CD19 23,2 ± 2,1*↑ 14,0 ± 1,1 19,8 ± 1,5*↑ 18,0 ± 1,6*↑ 14,2 ± 1,5 CD45/MHCII 33,4 ± 2 39,0 ± 2,4 34,3 ± 3,1 35,3 ± 4,0 37,6 ± 3,7 CD3/CD8 12,3 ± 1,1*↑ 7,4 ± 0,5 7,2 ± 0,7 10,5 ± 1,2 8,0 ± 0,5 Примечание: * - достоверность различий по сравнению с контролем (интактные мыши) p < 0,05, U-тест Манна-Уитни для независимых выборок. Антиген СD3 является маркером зрелых Т-лимфоцитов и представлен на медуллярных тимоцитах и Т-лимфоцитах периферической крови. Этот антиген является высоко специфическим, и выявление CD3 четко указывает на принадлежность Т-лимфоцитов к зрелым этапам дифференцировки этих клеток [2, 13, 16]. Основным фактором, препятствующим активному размножению вирусов и инфицированию пораженного организма, являются зрелые цитотоксические лимфоциты (СD8 Т-клетки, CTL), обладающие важным свойством - специфичностью действия на клетку-мишень, т.е. способностью уничтожать только клетки, пораженные вирусными частицами [20]. В нашем исследовании варианты 57 и 58 оказывали супрессирующее влияние на NK клетки (c 7,3 % в контроле) до 3 % (вариант 58) и до 1,8 % (вариант 57). В настоящее время известно, что NK-клетки играют важную биологическую роль в механизмах иммунологического надзора, направленного против опухолевых клеток, инфицированных вирусами и паразитами клеток, за счет регуляции процессов пролиферации и дифференцировки клеток костного мозга, элиминации стареющих соматических клеток, модуляции клеток врожденного иммунитета, активации, пролиферации или супрессии Т- и В-лимфоцитов, а также процессов созревания и генерации вирусспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов, что позволяет рассматривать их как существенный компонент неспецифической защиты организма и клеточно-опосредованного иммунного ответа [5, 9, 18]. Известно, что в популяции активированных лимфоцитов, наряду с ЦТЛ и NK, присутствуют натуральные киллеры - Т-клетки (NKT), экспрессирующие маркеры NK-клеток (CD16, CD56), и Т-клеточные дифференцировочные антигены (CD3, CD4, CD8) [1, 10, 12]. Эта субпопуляция лимфоцитов обнаруживается в основном при инфекционном процессе в печени и легких, но практически отсутствует в периферической крови [19]. У мышей, зараженных вариантами 57 и 58, снижалось содержание NКT-клеток с 0,4 % (в контроле) до 0,1 % (p < 0,05) и T-regs с 0,9 % (в контроле) до 0,3 % (вариант 57) и 0,5 % (вариант 58). Вирусы также повышали (p < 0,05) уровень клеток с ранним маркером активации (СD45/CD25) в 1,5-1,7 раза (вариант 57 - 13,4 %, вариант 58 - 15,3 %). Отличительной особенностью варианта 57 была индукция повышения численности В-лимфоцитов (CD45/CD19) в 1,4 раза по сравнению с вариантом 58 (соответственно 19,8 и 14 %). Смешанное инфицирование мышей вариантами 57 и 58 привело к неожиданным результатам. У мышей, одновременно зараженных данными вирусами, отмечалась иммуносупрессия со снижением количества Т-клеток (в 1,7 раза, с 32,5 до 19,5 %), преимущественно представленных субпопуляцией Т-хелперов (CD3/CD4), 1,95 раза (с 25,6 до 13,1 %) по сравнению с интактными мышами. При этом наблюдалась тенденция к повышению численности В-лимфоцитов (с 14,2 до 18 %, p < 0,05). Иммунный ответ у этих мышей также характеризовался преобладанием субпопуляций клеток с экспрессией маркера активации CD25 (13,1 %). Об активации процессов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов свидетельствует усиление экспрессии маркера рецептора для IL-2 (CD25). Молекула CD25 маркирует активированные Т-лимфоциты вне зависимости от их субпопуляционной принадлежности и активированные В-клетки [7]. Таким образом, варианты одного штамма ВКЭ практически не отличались по своему действию на субпопуляционную структуру лимфоцитов инфицированных мышей по отдельности, но в эксперименте со смешанной инфекцией проявили неожиданные свойства. Оба клона в той или иной мере вызывали снижение численности NK-клеток и T-регуляторных клеток. Вариант 57 вызывал увеличение численности В-лимфоцитов. Комбинированное заражение животных вариантами 57 и 58 вызывало дисбаланс иммунного ответа, характеризующийся снижением численности пула Т-лимфоцитов, Т-хелперов, NK-клеток и повышением уровня В-лимфоцитов. Вирусы при одновременном заражении мышей индуцировали активацию эффекторов иммунной системы. Известно, что глубокий дефицит Т-клеточного звена иммунитета в острой фазе инфекционного процесса, а также дисфункция гуморального и цитокинового звеньев иммунной системы влекут за собой тяжелое течение КЭ [3]. Нами показано, что заражение вариантами одного штамма ВКЭ в виде моноинфекции и смешанной инфекции разнонаправленно влияет на экспрессию дифференцировочных и активационных молекул на эффекторах врожденного и адаптивного иммунитета. Таким образом, на ранних этапах инфекционного процесса продемонстрирована способность вариантов ВКЭ, являющихся компонентами одной вирусной популяции, модулировать эффекторные функции врожденного и адаптивного иммунитета.

About the authors

O V Motuzova

E A Akhmatova

V G Khomenkov

N K Akhmatova

O V Lebedinskaya

Email: lebedinska@mail.ru

G G Karganova

References

Supplementary files