DIAGNOSTIC VALUE OF TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA AND POLYMORPHYSM OF ITS GENE (G4682A) IN HEPATIC CIRRHOSIS PROGRESSION

Full Text

Введение Изучению цирроза печени (ЦП) и его осложнений посвящено много клинических и экспериментальных исследований. Особое внимание уделяется изучению роли цитокинов в механизмах развития иммунно-воспалительных процессов, приводящих к прогрессированию повреждения печени. Так, например, заболевания печени вирусного генеза сопровождаются активацией выработки провоспалительных цитокинов, а повышение продукции фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α) ассоциировано с процессами цитолиза, холестаза и прогрессирования фиброза [1, 2, 9, 10]. По данным Е.Р. Черных и соавт. [8], трансформация фиброза в цирроз вирусной этиологии связана с усилением спонтанной продукции цитокинов, отражающих характер клинического течения заболевания. В литературе есть данные об активации цитокинового каскада при ЦП алкогольной этиологии [6]. При этом одни авторы на фоне снижения компенсации ЦП отмечают незначительное повышение сывороточных уровней цитокинов в основном в пределах референсных значений, за исключением интерлейкина-6 [5]. В других исследованиях приводятся данные об истощении иммунных механизмов при вирусных ЦП [7]. В последние годы большое число исследований посвящено выявлению мутаций генов и использованию их в клинической практике в качестве генетических маркеров развития и прогрессирования различных патологий человека, что позволяет прогнозировать риск развития заболевания, тяжесть его течения, а также подобрать для пациента адекватную специфическую терапию [11]. Например, разработана генетическая панель предикторов риска развития ЦП на основе анализа 7 полиморфизмов кандидатных генов [13]. К настоящему времени опубликованы данные о влиянии некоторых аллельных вариантов гена TNF-А на развитие и прогрессирование вирусных заболеваний печени. Однонуклеотидный полиморфизм гена TNF-А в промоторной части в положении -238 влияет на экспрессию и содержание этого цитокина в крови, а генотипы GA и АА достоверно чаще обнаруживаются у пациентов с быстрым развитием фиброза [4]. Наличие в геноме пациента с гепатитом С аллеля А в виде носительства гетерозиготы GA гена TNF-А в локусе (G4682A) ассоциировано с высокими концентрациями трансаминаз [2]. Цель исследования - определить диагностическое значение фактора некроза опухоли-альфа и полиморфизма гена TNF-А (G4682A) в прогрессировании цирроза печени. Материалы и методы исследования Обследован 81 пациент (41 мужчина и 40 женщин) с ЦП разной этиологии, средний возраст больных 52,7 ± 13,6 г. По этиологическому фактору больные ЦП были распределены следующим образом: ЦП вирусного генеза - у 50 (62 %) человек, невирусной этиологии - у 21 (26 %) и 10 (12 %) больных со смешанным ЦП (алкоголь+вирус). Сопоставимая группа контроля включала 80 здоровых доноров. Диагноз ЦП пациентам исследуемой группы был поставлен на основании анамнестических данных и результатов физикального, инструментального, а также лабораторного обследования. Исследуемые больные были разделены на 3 степени тяжести заболевания по шкале Чайльда-Пью [12, 14]: класс А - компенсированный ЦП (n = 23), класс В - субкомпенсированный (n = 26) и класс С - декомпенсированный ЦП (n = 32). Для исследования биохимических показателей аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), альбумина, общего и прямого билирубина использовали автоматический анализатор Architect-4000 (Abbott, США). Концентрацию ФНО-α определяли методом иммуноферментного анализа с использованием набора реагентов «альфа-ФНО - ИФА - БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Исследование однонуклеотидного полиморфизма гена TNF-А (G4682A) у 46 пациентов с ЦП и 80 здоровых доноров проводили на амплификаторе Real-time «CFХ-96» Bio-Rad Laboratories, Inc. (США) соответствующим набором реагентов «SNP-скрин» (ЗАО «Синтол», г. Москва). Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием программы Statistica 7.0 (StatSoft). Данные описывались с помощью среднего и стандартного отклонения (М ± σ) и в виде медианы (Ме) и интерквантильного размаха (25-й и 75-й процентили). Для оценки значимости различий независимых групп применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводился с вычисление коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Различия считались достоверными при р < 0,05. Для расчета пороговых значений и диагностической эффективности показателя, имеющего диагностическую значимость, проводился ROC-анализ и расчет отношения шансов (ОR). Диагностическую ценность параметра оценивали по шкале значений площади под ROC-кривой (AUC). Оценка адекватности прогноза проводилась по четырехпольной таблице с расчетом показателей чувствительности и специфичности, воспроизводимости и соответствия [3]. Для описания соотношения частот генотипов и аллелей изучаемого гена использовался метод χ2. Различия в двух популяциях рассчитывались по отношению шансов (OR) с использованием подхода «случай-контроль» для различных моделей наследования: аддитивной, общей, мультипликативной, доминантной и рецессивной и считались достоверными при р < 0,05. Результаты и их обсуждение Сывороточная концентрация провоспалительного цитокина ФНО-α у 99 % больных ЦП была выше, чем данный показатель в группе контроля, и составила 3,5 (2,6-4,9) пг/мл (р < 0,001), что свидетельствовало об активации воспалительного процесса. Цитолиз по уровню АСТ, холестаз и нарушение синтетической функции по данным альбумина достоверно нарастали по мере прогрессирования ЦП. Концентрация ФНО-α в сыворотке крови у больных с субкомпенсированным ЦП (класс В) была достоверно выше, чем при компенсированной форме класса А (р = 0,01). При этом сывороточный уровень данного цитокина у пациентов с декомпенсированным ЦП (класс С) хотя и имел тенденцию к повышению, но без значимых отличий от класса В (р = 0,34) (таблица). Биохимические показатели и концентрация ФНО-α в сыворотке крови больных ЦП в зависимости от степени тяжести, Ме (25-75 процентиль) Показатель Класс А (n = 23), компенсированный Класс В (n = 26), субкомпенсированный Класс С (n = 32), декомпенсированный АЛТ, Е/л 44,0 (25-100) 43,5 (27-66,7) 45,0 (29,0-60,7) АСТ, Е/л 42,0 (30-74) 55,5 (49-95)1 79,5 (65,1-132,5)2 Альбумин, г/л 42,0 (39-46,3) 34,5 (29,7-37,7)1 28,9 (25,3-32,3)2 Билирубин общий, мкмоль/л 27,0 (12,9-39,0) 46,3 (21-140)1 99,5 (31,3-192,0)2 Билирубин прямой, мкмоль/л 11,9 (6-14,8) 21,6 (14,5-37,9)1 49,2 (26,2-109,7)2 ФНО-α, пг/мл 2,7 (2,5-3,3) 3,6 (3,0-4,9)1 3,9 (2,9-9,8) Примечание: 1 - достоверность различий в классах А и В; 2 - достоверность различий в классах В и С. В рамках исследования была установлена прямая корреляционная связь концентрации ФНО-α со степенью тяжести ЦП по шкале Чайльда-Пью (r = 0,31; р = 0,004) и обратная взаимосвязь с уровнем альбумина (r = -0,24; р = 0,03). Оценку диагностической значимости провоспалительного цитокина ФНО-α для дифференциации компенсированной и субкомпенсированной степени ЦП и выбор его порогового значения проводили с помощью ROC-кривых. Площадь ROC-кривой ФНО-α для дифференциации данных степеней ЦП составила AUC 0,72 ± 0,07 (доверительный интервал 0,6-0,84), р = 0,003 (рис. 1). Рис. 1. ROC-кривая ФНО-α для дифференциации компенсированной и субкомпенсированной степени ЦП Индекс Юдена для данного показателя составил 0,41. Оптимальное пороговое значение ФНО-α для дифференциации компенсированной от субкомпенсированной и декомпенсированных степеней ЦП равнялось 3 пг/мл при чувствительности 65,0 % и специфичности 76,9 %. Таким образом, при сывороточной концентрации ФНО-α менее или равной 3 пг/мл диагностируют компенсированную форму ЦП, при уровне ФНО-α более 3 пг/мл устанавливают субкомпенсированный ЦП. При изучении распространенности генотипов и аллелей полиморфизма гена TNF-А (G4682A) в группах доноров и больных ЦП статистически значимые различия были получены только для доминантного генотипа GG, который в группе больных ЦП встречался значимо реже - в 34,78 % случаев (χ2 = 4,22; р = 0,04), чем в когорте доноров (в 53,75 %). При этом гетерозигота GA и минорный аллель А исследуемого гена у пациентов с ЦП регистрировались несколько чаще в 58,7 и 6,52 %, хотя и недостоверно, чем у доноров - в 43,75 (χ2 = 4,76,37; р = 0,09; ОR = 1,83) и 2,5 % (χ2 = 3,78; р = 0,06; ОR = 1,74) случаев соответственно (рис. 2). 4.tif Рис. 2. Частота обнаружения аллельных пар в полиморфных локусах гена TNF-А (G4682A) в группах доноров и пациентов с ЦП (* различия достоверны) Для сравнительного анализа влияния полиморфизма изучаемого гена на тяжесть ЦП больные были разделены на две группы. В I группу вошли 28 (61 %) пациентов с компенсированной (класс А) и субкомпенсированной (класс В) формой ЦП по шкале Чайльда-Пью. Во II группу были включены 18 (39 %) человек с декомпенсированной (класс С) формой ЦП. В обеих группах генотипы GG и GА и АА встречались с одинаковой частотой (р = 0,42, р = 0,38 и р = 0,83 соответственно). Достоверных различий частоты встречаемости минорного аллеля А также не было найдено (р = 0,59). То есть ассоциации между аллельными вариациями полиморфных локусов гена TNF-А (G4682A) с темпами прогрессирования ЦП нами не выявлено. Выводы 1. В ходе исследования обнаружено повышение продукции ФНО-α у 99 % больных ЦП вирусной, невирусной и смешанной этиологии. 2. Сывороточная концентрация ФНО-α повышалась по мере прогрессирования ЦП, что позволяет использовать данный тест в качестве дополнительного лабораторного маркера для дифференциации компенсированной стадии от субкомпенсированной и декомпенсированной. 3. При сывороточной концентрации ФНО-α менее или равной 3 пг/мл диагностируют компенсированную форму ЦП, при уровне ФНО-α более 3 пг/мл устанавливают субкомпенсированный ЦП. 4. Статистически значимых различий частоты встречаемости генотипов и аллелей гена TNF-А (G4682A) в группах доноров и больных ЦП, а также ассоциации между аллельными вариациями полиморфных локусов изучаемого гена с темпами прогрессирования заболевания не было выявлено.

About the authors

I A Bulatova

Email: bula.1977@mail.ru

A P Schekotova

O V Dolgikh

S V Paducheva

A V Krivtsov

References

Supplementary files