METHODOLOGICAL FEATURES OF VERIFICATION OF GANGLIOSIDES AND SIALIDASES, WHICH ARE POTENTIAL TARGETS OF PHARMACOLOGICAL DRUGS

Full Text

Впервые ганглиозиды были открыты и охарактеризованы в середине 1930-х годов. Уникальной особенностью этого класса соединений, в отличие от других гликосфинголипидов, является присутствие в их структуре сиаловых кислот. В избыточном количестве ганглиозиды представлены в центральной нервной системе человека, включая нервные и базальные ганглии, играя роль структурных «каркасных» молекул клеточных мембран последних. В 1970—1980 годах фармакологами предпринимались попытки использовать отдельные ганглиозиды для терапии неврологических расстройств. Однако регулярного применения такая терапия не получила из-за того, что экзогенно введенные ганглиозиды природного происхождения быстро подвергались деградации с избыточным образованием сиаловых кислот, что увеличивало их токсичность и делало их опасными для применения на человеке. Однако, в начале 2000 годов в США и Японии удалось осуществить клонирование генов, отвечающих как за синтез различных серий ганглиозидов, так и за синтез сиалидаз (ферментов, обеспечивающих деградацию ганглиозидов). Причем, у различных типов сиалидаз была выявлена не только различная специфичность к разным видам ганглиозидов, но и «жесткая» компартментализация в клетке — что открывает перспективы для разработки новых фар- макологических средств, мишенями действия которых будут либо сами ганглиозиды, либо деструктурирующие их сиалидазы (гиперэкспрессия которых, как было показано экспериментально, приводила к устойчивым метаболически нарушениям у животных, связанным с инсулинорезистентностью последних и вызывающим стойкие  изменения физиологического поведения животных) [11]. Таким образом, несмотря на то, что в полной мере роль ганглиозидов для организма ещё предстоит выяснять, уже сейчас очевидно, что прогресс исследований, связанных с изучением ганглиозидов и сиалидаз, сможет сделать значимый вклад в разработку новых фармакологических средств, перспективных для применения в онкологии, неврологии, вирусологии и многих других отраслях медицинских знаний. В частности, было отмечено, что при различных воспалительных состояниях, опухолевых заболеваниях и врожденных метаболических расстройствах может происходить повышения уровня сиаловых кислот в плазме крови и моче [3, 12]. Однако, научное исследование ферментов, регулирующих состав ганглиозидов, связано с уникальными методологическими соображениями. Так, ещё в 1950-х годах ученые начали разрабатывать методику измерения количества сиаловых кислот в биологических материалах (уровень которых в плазме крови, как считается, отражает общий уровень сиалогликопротеинов и сиалогликолипидов в организме, поскольку сиаловые кислоты, являющиея ацилированными производными нейраминовой кислоты, в биологическом материале в основном находятся в нередуцирующей позиции гликосфинголипидов и гликопротеинов). При этом изначально для указанных целей использовались метод на основе орсинола [2], метод на основе ресорсинола [10], прямой метод Эрлиха [9], методы на основе соляной кислоты, а также смеси уксусной и серной кислот [6] и т.д. Однако, все эти методы, используемые для определения концентраций различных полисахаридов, проявляли низкую специфичность в отношении сиаловых кислот. В связи с чем для рутинных количественных определений сиаловых кислот в биологических материалах вплоть до настоящего времени наиболее широко используется более специфический оптико–химический метод, предполагающий использование 5,5’-диэтил-2-тио-барбитуровой кислоты (TБК) и периодата натрия (NaIO₄) [1, 8]. При этом, как считается, NaIO₄ окисляет аминогруппу сиаловых кислот с гидролизом ацетильной группы, что при концентрациях NaIO₄ 40 мкМ и выше значительно усиливает интенсивность розового цвета конечного продукта реакции даже при комнатной температуре. Затем, поскольку NaIO₄ является сильным окислителем, производится связывание его непрореагировавшего избытка в реакционной смеси избытком арсенита натрия. После этого осуществляется связывание окисленных NaIO₄ сиаловых кислот с ТБК. Причем, следует отметить, что при замене 5,5'-диэтил-2-тио-барбитуровой кислоты на 5-нитро-барбитуровую кислоту или 5,5'-диэтил-барбитуровую кислоту хромофор в реакционной смеси не образуется. Следующим важным шагом в описываемом методе является экстракция полученного в реакционной смеси хромофора неполярным растворителем циклогексаном. В результате чего верхняя органическая фаза приобретает ещё более интенсивный, чем ранее розовый цвет, в то время как нижняя водная фаза становится практически бесцветной. При этом, учитывая, что в структуре сиаловых кислот присутствует кето-группа, а третий углерод этих кислот связан с двумя атомами водорода, можно предположить, что и другие сахара, являющиеся 2-кето-3-дезокси-кислотами, в результате осуществления рассматриваемого метода могут образовывать хромофор, аналогичный вышеупомянутому. В частности, было доказано, что и 2-дезокси-рибоза после взаимодействия с метаперйодатом натрия, а затем с ТБК окрашивает реакционную смесь в розовый цвет. Однако, если у сиаловых кислот, представленных у млекопитающих и человека, главным образом, N-ацетил-нейраминовой кислотой (NANA) и N-гликолил-нейраминовой кислотой (NGNA), максимум светопоглощения в видимой области спектра регистрируется при 549 нм, то у 2-дезокси-рибозы – при 532 нм (рис. 1).

Рис. 1. Спектры светопоглощения в видимой области спектра 2-дезокси-рибозы и N-ацетил-нейраминовой кислоты.

 

При этом, хромофоры, полученные с помощью NaIO₄ и ТБК как из сиаловых кислот, так и из 2-дезоксирибозы, при комнатной температуре могут сохранять свой стабильность в течение нескольких часов, тогда как при нагревании до 100°C деградируют в течение нескольких минут. Однако, при воздействии на реакционную смесь щелочных растворов деградируют до неокрашенного состояния только хромофоры, полученные из сиаловых кислот, в то время как хромофор, полученный из 2-дезоксирибозы, сохраняет свою окраску. Кроме того, стоит отметить, что вклад N-ацетил-нейраминовой кислоты и N-гликолил-нейраминовой кислоты в образование упомянутых хромофоров также различен, о чём свидетельствует тот факт, что молярный коэффициент светопоглощения для NGNA на 19 % ниже, нежели для NANA – что, возможно, указывает на различия в прочности связи ацетильной и гликолильной групп в сиаловых кислотах. Также было отмечено, что метокси-нейраминовая кислота, обработанная NaIO₄ и ТБК, как описано выше, не образует в реакционной смеси окрашенных продуктов. Это подтверждает гипотезу о том, что для точного определения сиаловых кислот, связанных с другими углеводами через кислород при втором атоме углерода, необходим мягкий кислотный гидролиз содержащего эти кислоты биологического материала. Таким образом, описываемый метод с использованием NaIO₄ и ТБК позволяет определять наличие в анализируемом материале свободных сиаловых кислот – что даёт возможность использовать этот метод при регистрации активности ферментов, отщепляющих от различных субстратов связанные с ними сиаловые кислоты. Но концентрация свободных сиаловых кислот в образце при этом должна быть не менее 10 нМ. А кроме того, вышеописанный метод не позволяет достоверно различать присутствие в анализируемых образцах различных типов сиаловых кислот. При том, что уже к настоящему времени в различных биологических материалах идентифицировано наличие не менее 19-и разных природных производных нейраминовой кислоты. Наиболее оптимальным методом для обнаружения различных производных нейраминовой кислоты при их концентрациях в образцах ниже 10 нМ является использование высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектированием [7].  В частности, для идентификации в биологических жидкостях NANA и NGNA был разработан вариант описываемого метода, использующий флуоресцентный реагент ДДБ (1,2-диамино-4,5-диметоксибензол). Последний, вообще говоря, является универсальным реагентом, используемым для высокочувствительного определения наличия в анализируемых образцах любых сахаров, содержащих кето-группу в α-положении. Но при определённых условиях ДДБ образует стабильные флуоресцентные продукты только с NANA и NGNA (рис. 2). 

Рис. 2. Хроматограмма продуктов дериватизации при 60 °C ДДБ с 2 мкМ NANA и NGNA. Здесь пики 1 и 3 соответствуют NGNA, 2 и 4 — NANA, 5 — ДДБ.

Описываемый метод позволяет весьма чувствительно и селективно идентифицировать наличие в биологических жидкостях NANA и NGNA в присутствии значительных количеств многих других соединений (включая сахара, органические кислоты, альдегиды и т.п., такие как D-ксилоза, D-рибоза, 2-дезокси-D-рибоза, D-фукоза, D-глюкоза, D-галактоза, D-фруктоза, D-глюкозамин, D- галактозамин, мальтоза, целобиоза,  гентобиоза, лактоза, бензальдегид, р-гидрокси-бензаль дегид, ванилин, глюкуроновая, маннуроновая, идуроновая, галактуроновая и дегидро-аскорбиновая кислоты и т.п.) [4]. Это делает данный метод весьма эффективным инструментом изучения присутствия производных нейраминовой кислоты в биологических образцах. Это проиллюстрировано рис. 3, на котором показаны типичные хроматограммы, полученные с помощью описываемого метода у здоровых доноров и пациентов с метастатическим раком печени. При этом пики, соответствующие NGNA, на рис. 3 не показаны, поскольку это производное нейраминовой кислоты в организме человека отсутствует. Выявленная же в сыворотке крови концентрация NANA у здоровых доноров составила в среднем 492,2 ± 35 мкг/мл, в то время как у пациентов с раком печени превысила 820 мкг/мл.

Рис. 3. Хроматограммы, полученные при определении N-ацетил-нейраминовой кислоты (после дериватизации её с 1,2-диамино-4,5-диметоксибензеном) в сыворотке крови здорового донора (А) и пациента, пораженного раком печени с метастазами (Б).

Прим. Объём сыворотки в пробе составил 5 мкл. Обозначения для пиков те же, что и на рис. 2.

 

Также на рис. 4 отображено распределение продуктов дериватизации ДДБ с компонентами мочи здорового донора. Здесь на хроматограмме было зарегистрировано существенно большее количество пиков, чем на рис. 3 – что свидетельствует о дериватизации ДДБ с другими содержащимися в анализируемой пробе сахарами с α-кетогруппой. Однако, как видно из рис. 4, в специфических условиях обработки мочи, включающих дериватизацию ДДБ при 60°C, пик N-ацетилнейраминовой кислоты был заметно более выражен, чем пики пирувата, α-кетоглутаровой кислоты и других подобных им соединений, содержавшихся в анализируемой пробе. Кроме того, как и ожидалось, на хроматограмме, полученной при анализе мочи здорового человека, не было обнаружено пиков, соответствующих N-гликолилнейраминовой кислоте. Это демонстрирует специфичность и точность описываемого метода в обнаружении и дифференциации различных производных нейраминовой кислоты в биологических образцах.

 

Рис. 4. Хроматограмма, полученная после обработки 1,2-диамино-4,5-диметокси-бензеном 5 мкл мочи здорового донора. Здесь пики 2 и 4 соответствуют NANA, 5 — ДДБ. 6 — α-кетоглутаровой кислоте, 7 — пирувату и т.д.

 

Для точного мониторинга изменений в составе ганглиозидов после воздействия на них нейраминидаз (сиалидаз) в вышеописанный метод в качестве внутреннего стандарта было добавлено синтетически полученное производное моносиалоганглиозида GM3 — GM3–N-пропионил-нейраминовая кислота (рис. 5) [5].

 

Рис. 5. Схема химического синтеза GM3–Neu–Pr из GM3–Neu–Ac.

 

 

ВЫВОДЫ

1. Таким образом, разработанные к настоящему времени методы позволяют не только осуществлять весьма чувствительный и селективный количественный и качественный анализ различных ганглиозидов, присутствующих в биологических образцах, но и эффективно определять активность сиалидаз (ферментов, участвующих в гидролизе вышеупомянутых ганглиозидов).
2. Но вследствие необходимости использования при этом достаточно сложного, дорогого и «капризного» в применении оборудования для высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектированием, в рутинных биохимических исследованиях ганглиозидов и сиалидаз наиболее общепринятым до сих пор остаётся ранее описанный здесь более простой оптико–химический метод, основанный на использовании тиобарбитуровой кислоты.

About the authors

Sergei Proshin

Gerzen University

Author for correspondence.
Email: psnjsn@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-9720-4381
SPIN-code: 2978-4545
http://elibrary.ru/author_profile.asp?id=88899

Professor, Doctor of medical science, Head of department of Pharmacology

Russian Federation, 48 Naberezhnaya Reki Moiki, Saint Petersburg, 191086

Ludmila L Miller

Prepare for Success at Lesgaft National State University of Physical Education, Sport and Health, St Petersburg!

Email: l.miller@lesgaft.spb.ru
ORCID iD: 0000-0003-0049-690X
SPIN-code: 6894-3932

Candidate of Medical Sciences, Head of the Department of Sports Medicine and Comprehensive Rehabilitation

Russian Federation, 190121, St. Petersburg, Dekabristov street, 35.

Vladimir Vladimirovich Grischin

Academician I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University, Saint Petersburg, Russia;

Lesgaft National State University of Physical Education, Sports and Health, Saint Petersburg, Russia

Email: w.grischin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3759-8611
SPIN-code: 3452-7882

Доцент

Russian Federation, Russia, St. Petersburg, Leo Tolstoi Street; Russia, 190121, St. Petersburg, st. Decembrists, 35

Alexei Evgen'evich Levenkov

N.G.U. P.F. Lesgaft
Lesgaft National State University of Physical Education, Sport and Health, St. Petersburg

Email: a.levenkov@lesgaft.spb.ru
ORCID iD: 0009-0001-8706-4212

Associate professor

Russian Federation, Russia, 190121, St. Petersburg, st. Decembrists, 35

References