ANALYSIS OF THE BEHAVIOR STRUCTURE OF DOPAMINE TRANSPORTER KNOCKOUT RATS

Full Text

Введение

Животные с нокаутом гена транпортера дофамина (DАТ–КО) воспроизводят основные симптомы синдрома дефицита внимания с гиперактивностью (СДВГ), включающие собственно гиперактивность, снижение внимания и когнитивные нарушения [1]. Дофамин (DA) в свою очередь контролирует ряд важных аспектов работы головного мозга, включая внимание, настроение, подкрепление и двигательную функцию. Нарушения метаболизма DA связана с депрессией, биполярными расстройствами, шизофренией, СДВГ, болезнью Паркинсона и наркоманией [2]. Одним из ключевых элементов нейротрансмиссии DA является транспортер DA (DAT), белок, встроенный в клеточную мембрану, который отвечает за обратный захват передатчика. Изменения функции DAT у крыс DAT-KO являются ключевым механизмом при различных патологических состояниях, связанных с гипердофаминергией. Генетически модифицированные крысы с дефицитом DAT характеризуются повышенными уровнями DA, прежде всего в полосатом теле, но не в префронтальной коре. Это приводит к двигательной гиперактивности, когнитивным дефицитам и другим поведенческим отклонениям. Это дает основание использовать крыс DAT-KO в качестве удобной модели для изучения отклонений дофамина, но клиническая картина у людей более сложная, и гипердофаминергические состояния не ограничиваются повышенными уровнями дофамина в полосатом теле [2].

DАТ осуществляет обратный захват DА из синаптической щели в пресинаптический нейрон. Он экспрессируется в дофаминергических нейронах черной субстанции (SN) и вентральной тегменьальной области (VTA): Его концентрация наиболее высока в стриатуме и прилежащем ядре (NA), где DАТ является основным регулятором высвобождения DА [3]. DАТ регулирует сигнализацию как на пре-, так и на постсинаптических рецепторах DА путем удаления нейромедиатора из внеклеточного пространства [4]. DАТ является мишенью для психостимуляторов, таких как кокаин, амфетамины и метилфенидат, который в свою очередь является основным препаратом лечения СДВГ [5]. Среди областей мозга, участвующих в дофаминергической передаче, важную роль играет префронтальная кора, которая вовлечена в нисходящий контроль, и нарушения функционирования этой структуры может выявлять симптомы, характерные для ряда психических заболеваний [6]. Экспериментальные исследования функции DAT у грызунов позволили во многом осознать участие DA в механизме подкрепления, эмоциональных, когнитивных и двигательных функциях [7]. Создание DАТ–КО у грызунов приблизило к пониманию медиаторной функции DА и транквилизирующих свойств психостимуляторов при СДВГ [8]. Согласно данным экпериментальных работ DАТ–КО вызывает спонтанную гиперлокомоторную активность, повышенную импульсивность, нарушение сна и снижение способности к обучению [9]. Получение трансгенных мышей с DАТ позволило изучать механизмы действия кокаина. У DАТ–КО мышей наблюдалось самовведение кокаина [10]. Показано отсутствие подкрепляющего эффекта кокаина у мышей DАТ-КО в тесте условного предпочтения места [11] и снижение его самовведения [12]. Известна также модель крыс DAT-KO, в которой кодирующая последовательность гена DAT была нарушена, а экспрессия белка прекращена [13]. У крыс DAT-KO, помимо явной гиперактивности наблюдались снижение рабочей памяти и дисрегуляция функции нейротрофического фактора мозга (BDNF) в полосатом теле [13]; были выражены компульсивные черты поведения, двигательные стереотипии и поведенческая ригидность во время оперантного выбора [14].

В настоящем исследовании мы сделали попытку проанализировать совокупность стандартных поведенческих паттернов у DАТ-КО крыс, которые наблюдаются у грызунов в ответ на новизну в свободном поведении. Имеющиеся в настоящее время литературные данные рассматривают отдельные функциональные фрагменты двигательных и когнитивных реакций у DАТ-КО. В частности, показано, что микроструктура груминга у крыс DAT-KO значительно отличалась по сравнению с крысами дикого типа (WT). Во время обучения крысы DAT-KO демонстрировали выраженные паттерны гиперактивности и персеверативной (стереотипной) активности [15]. В то время как у крыс DAT-KO наблюдается высокая гиперактивность, стереотипное поведение и социальные нарушения, гетерозиготные особи (DAT-HET) демонстрировали большее разнообразие поведенческого репертуара. У DAT-HET в отличие от WT также наблюдаются нарушения социального поведения [16]. Они имеют больше преимуществ с точки зрения трансляции по сравнению с KO. Это преимущество обусловлено наличием одного функционального аллеля для DAT, что делает их более восприимчивыми к потенциальным эпигенетическим модуляциям [17].

Целью настоящего исследования было исследовать особенности проявления паттернов поведения в ответ на новизну в свободном поведении у крыс DAT-KO по сравнению с DAT-HET и WT.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Этические правила и нормы. Эксперименты проведены в соответствии с международными европейскими биоэтическими стандартами (86/609-EEC) и этическими стандартами Российской Федерации по содержанию и обращению с лабораторными животными.

Выбор животных. Опыты выполнены на 57 половозрелых крысах самцах Wistar весом 250-350 г, содержавшихся по 6-8 особей в стандартных пластмассовых клетках в условиях вивария. Животные содержались в условиях 12-часового режима освещения при постоянной температуре (22±2॰С) и влажности (50±10%) в клетках размером 53х32х19 см c подстилкой из древесной стружки. Масса животных находилась в пределах 250–350 г. Животные получали корм без ограничений. Эксперименты проходили в вечернее время в интервале с 16 до 20 часов. В помещении, где содержали экспериментальных животных, поддерживали искусственный световой режим (12 часов свет/ 12 часов темнота) и относительной влажности воздуха 55±10 %.

Эксперименты выполнялись в соответствии с требованиями надлежащей лабораторной практики (GLP) и Европейской Директивой о защите животных, используемых в научных целях (Directive 2010/63/EU). Работа получила одобрение локального комитета по этике ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины».

Получение крыс с нокаутом гена DAT.  Крысы с нокаутом гена DAT были получены из Istituto Italiano di Tecnologia (IIT) (Генуя, Италия) для вивария Санкт-Петербургского государственного университета, Института трансляционной биомедицины. Нокауты были получены путем редактирования генома по методу CRISPR-Cas9 и прогенотипированы как ранее было описано в статье [18]. Была разработана одиночная направляющая РНК (sgRNA) и смежный с протоспейсером мотив, нацеленные на сайт инициации трансляции в одиночном экзоне DAT крысы.  Смесь sgRNA (25 нг/мкл) и мРНК Cas9 (IDT, 30 нг/мкл) вводили микроинъекцией в пронуклеусы оплодотворенных яйцеклеток крыс Sprague Dawley. Зиготы культивировали до 2-клеточной стадии и переносили самкам крыс. Полученное потомство генотипировали с помощью полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, фланкирующих область-мишень gRNA (Dat: 5'- CTCATCAACCCGCCACAGAcaccaGTGGAGGCTCAAGAG -3' и DatKn 5'- CTCATCAACCCGCCACAGAGTGGAGGCTCAAGAG -3') и проводили скрининг с помощью секвенирования по Сэнгеру. Животные родились в IIT от скрещивания самцов и самок DAT–HET, отняты от груди на PND 21 и отправлены в виварий Института Трансляционной Биомедицины Университета во взрослом возрасте, где их размещали парами в клетках Makrolon® III с подстилкой из опилок и с едой и водой ad libitum. Для отправки было выбрано не более пары сибсов на генотип, чтобы избежать возможных генетических сдвигов. Все самки были DAT–HET, и все три генотипа были представлены в каждом помете, что исключает риск сдвигов из-за различного материнского поведения. Их содержали в кондиционируемом помещении (температура 21 ± 1°C, относительная влажность 60 ± 10%), при 12-часовом обратном цикле свет-темнота (свет выключался в 07:00 утра) до начала экспериментальных протоколов. Животные дикого типа, гетерозиготы и нокауты по DAT рождались в соотношении, близком к менделевскому, а гомозиготные нокауты были жизнеспособны и достигали зрелого возраста без каких-либо явных фенотипов [19].

Генотипирование животных. Были взяты самцы крыс Wistar. С их образцами ДНК была поставлена ПЦР с праймерами к гену DAT (фрагмент 200 н.п.), затем произведена рестрикция эндонуклеазой BtsImutI по стандартному протоколу и электрофорез в агарозном геле. При создании нокаутов производили делецию одного нуклеотида внутри гена (в центре получаемого в результате проводимого с праймерами к гену DAT фрагмента), в результате чего менялась рамка считывания. При этом также исчезал сайт рестрикции, узнаваемый BtsImutI. Поэтому пробы ДНК крыс дикого типа на форезе демонстрировали фрагмент 100н.п., пробы нокаутированных крыс – 200н.п., гетерозиготы по нокаутированному гену DAT-HET – два фрагмента 200н.п. и 100н.п. (рис. 1).

Рисунок 1. Пробы ДНК крыс на форезе.

Примечание. Пробы ДНК крыс дикого типа WT на форезе демонстрировали фрагмент 100 н.п., пробы нокаутированных крыс DAT-KO – 200 н.п., гетерозиготы по нокаутированному гену – два фрагмента 200н.п. и 100 н.п.

Figure 1. DNA samples of rats analyzed by electrophoresis.

Note. DNA samples from wild-type rats (WT) showed a 100 bp fragment; samples from DAT knockout rats (DAT-KO) showed a 200 bp fragment; heterozygous rats (DAT-HET) displayed two fragments – 200 bp and 100 bp.

Исследования поведения. Свободную двигательную активность животных исследовали в тесте «открытого поля», представляющего собой круглую площадку диаметром 80 см, ограниченную по окружности непрозрачными бортами высотой 30 см. По всей площади открытого поля равномерно расположены 16 отверстий (норок), диаметром 3 см каждая, предназначенных для выявления видоспецифического компонента исследовательской активности у грызунов (норковый рефлекс). Освещенность открытого поля равнялась 100 лк. Во время опыта установка находилась в специальной звукоизолированной комнате. Продолжительность одного опыта составляла 3 мин. Был выбран ряд элементарных поведенческих паттернов, совокупность которых характеризует целостное поведение в «открытом поле» [20; 21]. Для обеспечения корректной обработки посредством цифрового этографа паттерны были каталогизированы: «локомоция» (поступательное движение тела в горизонтальной плоскости); «обнюхивание» (принюхивание и повороты головы без существенных изменений координат корпуса в горизонтальной и вертикальной плоскостях). Этот акт может осуществляться в позах «сидя», «стоя», которые трудно различимы без потери его основного биологического значения, поэтому при регистрации не разделялся в зависимости от позы, в которой он появлялся); «вертикальная стойка» (стойка на задних лапах в свобободной области открытого поля); груминг (все разновидности этой реакции, включая вылизывание лап, гениталий, умывание, чесательные движения); «движение на месте» (изменение координат головы и корпуса в пределах условной окружности, центром которой являются относительно неподвижные задние конечности животного; «заглядывание в норку» (норковый рефлекс); «стойка на стенку» (вертикальная стойка на задних лапах с упором на стенку экспериментальной установки). Регистрация актов производилась посредством нажатия кнопки, соответствующей определенному поведенческому паттерну, на клавиатуре. Регистрировали число наблюдаемого паттерна за опыт и вероятность его проявления за опыт. Вероятность паттерна р рассчитывали, как отношение числа наблюдаемого паттерна за опыт к общему числу паттернов за опыт.

Статистика. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 10.0).

Перед выбором методов анализа проверяли распределение данных на нормальность с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. При отклонении распределения от нормального использовали непараметрические методы статистики.

Для оценки различий между несколькими группами применяли непараметрический тест Краскела-Уоллиса. При выявлении статистически значимых различий по результатам теста Краскела-Уоллиса выполняли пост-хок анализ по критерию Дана.

Результаты представлены в виде медианы и межквартильного размаха (Me [Q1; Q3]). Статистически значимыми различия считались при уровне вероятности p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На рисунке представлены показатели двигательной активности крыс с нормальным (WT), гетерозиготным (DAT-HET) и нокаутным (DAT-KO) генотипом по транспортеру дофамина.

Движение на месте. Проведенный анализ с использованием непараметрического критерия Краскела–Уоллиса выявил статистически значимые различия между группами по числу актов движения на месте (H (2) =14.64, p=0.0007). Пост-хок тест Данна показал, что у крыс линии DAT-KO количество актов движения было значительно ниже по сравнению с животными групп WT (p <0.001) и DAT-HET (p<0.05). Различий между WT и DAT-HET не обнаружено.

Количество пересечённых квадратов. Аналогично, по показателю горизонтальной активности (число пересечённых квадратов) выявлены достоверные межгрупповые различия (H(2)=16.34, p=0.0003). Согласно пост-хок тесту Данна, крысы DAT-KO пересекали достоверно больше квадратов, чем WT (p<0.001) и DAT-HET (p<0.05) животные, что указывает на выраженную гиперактивность в данной группе.

Рисунок 2. Поведение в открытом поле WT, DAT-HET и DAT-KO крыс: число пересеченных квадратов и число движений на месте.

Примечание. Группы животных: WT – крысы дикого типа, DAT-KO– крысы, нокаутные по гену DAT; DAT-HET -   гетерозиготы по нокаутированному гену DAT. *p <0,05; *** p <0,01 - значимые различия.

Figure 2. Behavior of WT, DAT-HET, and DAT-KO rats in the open field test: number of squares crossed and number of movements in place.

Note. Animal groups: WT – wild-type rats; DAT-KO – rats with dopamine transporter gene knockout; DAT-HET – heterozygous rats for the DAT knockout gene. p < 0.05; **p < 0.01 – significant differences.

Локомоция. По числу актов передвижения выявлены достоверные различия между группами (тест Краскела–Уоллиса, H (2)=11.31,  p=0.003). Пост-хок тест Данна показал, что крысы линии DAT-KO демонстрировали существенно меньшее число актов «локомоция» по сравнению с гетерозиготными животными (DAT-HET) (p <0.01).

Норковая активность. Количество актов заглядывания в отверстия также различалось между группами (H (2) =14.35, p=0.0008). Крысы DAT-HET проявляли более выраженное исследовательское поведение по сравнению с WT (p<0.05) и DAT-KO (p<0.01), что свидетельствует о генотип-зависимом изменении мотивации к исследованию пространства.

Стойки с упором. Для данного показателя значимых различий между группами не выявлено (H(2)=3.93, p>0.05), что указывает на сохранность данного элемента двигательной активности при нокауте DAT.

Вертикальные стойки. Напротив, число вертикальных стоек существенно снижалась у крыс DAT-KO по сравнению с DAT-HET (p=0.006; тест Краскела–Уоллиса, H(2)=10.22, p=0.006), что может отражать дефицит двигательной инициативы и сниженную спонтанную активность.

Рисунок 3. Поведение в открытом поле WT, DAT-HET и DAT-KO крыс: число актов «локомоция», «заглядывание в норку», «стойка с упором», «вертикальная стойка»

Примечание. Группы животных: WT – крысы дикого типа, DAT-KO– крысы, нокаутные по гену DAT; DAT-HET -   гетерозиготы по нокаутированному гену DAT. *p <0,05; ** p <0,01 - значимые различия.

Figure 3. Behavior of WT, DAT-HET, and DAT-KO rats in the open field test: number of acts of «locomotion», «hole poking», «supported rearing», and «vertical rearing».

Note. Animal groups: WT - wild-type rats; DAT-KO - rats with dopamine transporter gene knockout; DAT-HET - heterozygous rats for the DAT knockout gene. p < 0.05; *p < 0.01 – significant differences.

Груминг. По количеству актов груминга выявлены статистически значимые различия между группами (тест Краскела–Уоллиса, H(2)=6.94, p=0.03). Пост-хок тест Данна показал, что крысы DAT-KO выполняли груминг существенно реже, чем животные группы WT (p<0.05). Различий между WT и DAT-HET не отмечено. При этом показатель вероятности груминга не различался между генотипами (p>0.05), что указывает на снижение выраженности, но не частоты запуска данного поведенческого паттерна у DAT-KO крыс.

Обнюхивание. Анализ количества актов обнюхивания показал наличие достоверных различий между группами (H(2)=11.99, p=0.002). Крысы DAT-KO демонстрировали значительно меньше актов обнюхивания по сравнению как с WT, так и с DAT-HET животными (p<0.01). Вероятность обнюхивания также была снижена у DAT-HET по сравнению с WT (p<0.05).

Рисунок 4. Поведение в открытом поле WT, DAT-HET и DAT-KO крыс: число актов и вероятность появления за опыт паттернов «груминг», «обнюхивание».

Примечание. Группы животных: WT – крысы дикого типа, DAT-KO– крысы, нокаутные по гену DAT; DAT-HET -   гетерозиготы по нокаутированному гену DAT. *p <0,05; ** p <0,01 - значимые различия.

Figure 4. Behavior of WT, DAT-HET, and DAT-KO rats in the open field test: number of acts and probability of occurrence during the trial for the patterns «grooming» and «sniffing».

Note. Animal groups: WT - wild-type rats; DAT-KO - rats with dopamine transporter gene knockout; DAT-HET - heterozygous rats for the DAT knockout gene. p < 0.05; p < 0.01 – significant differences.

ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенных исследований установлено, что DAT-KO крысы демонстрировали выраженную гиперактивность по сравнению с крысами WT и DAT-HET, на что указывало увеличение общего пройденного расстояния по числу пересечений квадратов в открытом поле. Они также проводили значительно меньше времени в центре и двигались по повторяющемуся круговому шаблону вдоль стен. Наши исследования во многом согласуются с данными литературы. Подобное поведение в открытом поле показано ранее у крыс и мышей DAT-KO [17; 22]. При анализе поведения крыс DAT-KO в открытом поле были выявлена закономерность: значительная гиперактивность, выраженное в виде круговых движений. Показано, что отмеченные особенности поведения у крыс DAT-KO коррелировали со снижением размеров полосатого тела и увеличением объема мозжечка [20]. Гиперактивность у крыс DAT-KO отмечается и в других исследованиях [13;  20]. Гиперактивность, по-видимому, является результатом повышенного уровня дофамина в стриатуме, опосредующем сложные двигательные функции [22]. Длительное и чрезмерное воздействие дофамина приводит к нейротоксическому эффекту и в дальнейшем к нейродегенерации синаптических элементов [ 23]. Это согласуется с данными о нейродегенерации ГАМК-ергических интернейронов [24], снижением плотности шипиков в стриатуме мышей DAT-KO [25] и  снижением экспрессии BDNF [ 13].

Поведенческая расторможенность представляет собой перекрывающуюся черту импульсивности (при СДВГ) и компульсивности (при ОКР), предположительно являющуюся результатом дофаминергического дисбаланса и снижения коркового контроля [26]. Показано, что подобные изменения функцией дофамина отмечаются и при шизофрении [27]. У мышей DAT-KO отмечаются нарушения префронтально-мезолимбических связей [28]. Повторяющееся поведение, выраженное как избегание центра открытого поля, представляет более сложный компульсивно-подобный феномен, в значительной степени регулируемый изменениями в лимбической системе [29], т.к. избегание центра можно объяснить также и повышением тревожности у животных DAT-KO. Это подтверждается более высоким уровнем кортикостерона и повышенной восприимчивостью к стрессу у самок крыс DAT-KO [30]. В то же время наблюдалось снижение реакции замирания самцов крыс DAT-KO, подвергавшихся анксиогенному воздействию среды [17]. Поэтому более вероятным объяснением избегания центра открытого поля является появление компульсивно-подобных свойств у крыс DAT-KO [31]. Это подтверждается также увеличением манипуляций с шариками в тесте на закапывание шариков у крыс DAT KO и целенаправленным персеверативным грызением металлического прута. Крысы DAT KO перемещали шарики ртом (возможно, пытаясь их грызть) с компульсивным стремлением их устранить. Такое поведение может отражать фундаментальные аспекты для моделей крыс ОКР с сопутствующим СДВГ [31]. У крыс DAT KO наблюдались явно компульсивные черты поведения, двигательные стереотипии и поведенческая ригидность во время выбора подкрепления [14]. С помощью методов функциональной визуализации подтвердили данные о нейронных механизмах компульсивности у животных DAT-KO, как результат дефицита контроля тормозного действия, связанного с дофаминергическим дисбалансом коры и ствола мозга [32], а также дисбалансом корково-подкорковых взаимоотношений  [33]. Когнитивная ригидность является отличительной чертой многих нейропсихиатрических расстройств, включая ОКР [34] и шизофрению [35]. Она выражена у крыс DAT-KO, о чем свидетельствует стереотипное поведение при достижении вознаграждения [14].

Наши данные свидетельствуют также о снижении исследовательской активности у крыс DAT-KO, что соответствует характеристике DAT-KO как животной модели СДВГ. Число актов «заглядывание в норку» и актов «обнюхивание» (проявления исследовательской активности) снижались у крыс DAT-KO.  Аналогичную картину мы наблюдали при анализе количества актов «локомоция» и «вертикальные стойки», что при учете повышенной горизонтальной двигательной активности также косвенно свидетельствует о снижении внимания.  Это согласуется с данными, которые выявили лишь частично сохранные когнитивные навыки, снижение навыков на внимание и элементов пространственной памяти у животных DAT-KO [31]. У крыс DAT-KO наблюдались снижения преимпульсного торможения акустического рефлекса испуга, что указывает на трудности с селекцией нерелевантных стимулов. У них наблюдается нарушение рабочей памяти, что подтверждается снижением спонтанного чередования в тесте Y-образного лабиринта. Исследования с использованием тестов на поиск новизны показывают, что у крыс DAT-KO имеются нарушения, связанные с вниманием [31]. Крысы DAT-KO плохо справляются с оперантными задачами, такими как тыкать носом за пищевое вознаграждение, что указывает на трудности с поддержанием внимания и мотивации Крысы DAT-KO демонстрируют дефицит в когнитивных задачах, требующих пространственной рабочей памяти, что дополнительно свидетельствует о нарушениях, связанных с вниманием. В основе этих нарушений может лежать повышенный уровень мио-инозитола в прелимбической поясной коре крыс DAT-KO, важного структурного компонента клеточных мембран [36]. Фронтальные изменения мио-инозитола возникают также при мании [37], ОКР [38] и шизофрении [39]. Более того, повышенный уровень мио-инозитола является маркером нейровоспаления и был обнаружен в передней поясной коре у хронических пользователей психостимуляторов [40], что, возможно, представляет собой нейротоксическое состояние при длительном воздействии дофамина. Хромосомные аномалии, связанные с СДВГ [41], также могут объяснять механизмы последствия DAT-KO, в частности, микроделецией 1q21.1, [42]. Мыши, несущие делецию 1q21.1, демонстрируют измененную мезолимбическую дофаминергическую передачу и гиперчувствительность к амфетамину [43], аналогично крысам DAT-KO [13]. Это согласуется с исследованиями о том, что животные DAT-KO показали сокращение общего времени груминга по сравнению с мышами WT, базовое снижение неподвижности в тесте принудительного плавания и времени груминга [44]. В целом, наши результаты и отмеченные выше данные в обсуждении предоставляют дополнительные доказательства важности дофаминергической нейротрансмиссии в регуляции восприимчивости к стрессу новизны открытого поля и предполагают, что генетическая потеря DAT предотвращает вызванное стрессом увеличение тревожного поведения. Наши данные также согласуются с данными о том, что микроструктура груминга у крыс DAT-KO значительно отличалась по сравнению с контрольными крысами. Поведение крыс DAT-KO во время интервалов между грумингом полностью отличалось от поведения контрольных животных. 

Наши результаты по изучению грумигнга у крыс DAT-KO согласуются с нашими данными о движениях на месте, как подавленной страхом новизны двигательной активности. В наших исследованиях   DAT-KO по сравнению с крысами WT и DAT-HET демонстрировали снижение числа движений на месте. DAT-HET занимали промежуточное положение между WT и DAT-KO. Показано, что у самцов крыс DAT-KO наблюдается снижение замирания после анксиогенного воздействия среды [17]. Таким образом, стресс новизны открытого поля, по-видимому, может в меньшей степени действать на DAT-KO крыс с точки зрения анксиогенного воздействия.

Следует отметить различия в поведении исследованных нами крыс DAT-HET, которые занимали промежуточное положение между WT и DAT-KO по числу пересечениых квадратов. Крысы DAT-HET были более подвижны чем WT, у них наблюдалось большее количество пересеченных квадратов в тесте «Открытое поле». Это согласуется с данными, что крысы DAT-HET характеризуются большим количеством пересеченных квадратов и стоек, что может свидетельствовать о повышенной двигательной и исследовательской активности. В наших исследованиях получены прямые доказательства повышения у них исследовательской активности: наблюдалось повышение числа актов «заглядывание в норку» и числа стоек у DAT-HET по сравнению с WT и DAT-KO.  Показано, что концентрация внеклеточного дофамина у них увеличена по сравнению с крысами WT [19]. Повышенная двигательная активность животных и нарушение когнитивных функций может доказывать, что генетически обусловленная гипофункция транспортера дофамина у этих животных изменяет траекторию функционирования нервной системы, приводя к поведенческому фенотипу, сходному с симптомами таких нейродегенеративных заболеваний, как синдром дефицита внимания и гиперактивности, шизофрения и биполярное расстройство. Наличие гипердофаминергии, повышенной двигательной и исследовательской активности при одновременном нарушении когнитивных функций может прогнозировать у них наличие аддиктивных нарушений при формировании патологического влечения, что представляет самостоятельный интерес изучения механизмов химических и нехимических зависимостей.

Ранее нами проведено исследование особенностей поведения самцов крыс, нокаутных по гену ТAAR9. Они также характеризовались повышенным проявлением двигательной активности и снижением показателей, связанных с обнюхиванием [45]. В настоящих исследованиях у крыс DAT-KO наблюдались более выраженные изменения этих показателей. Наши данные подтверждают ранее полученные рядом авторов данные о последствиях DAT-KO. Гиперактивность и компульсивно-подобные свойства у животных DAT-KO предполагают потенциальную трансляционную модель для изучения таких состояний, как СДВГ и других расстройств, связанных с дисфункцией дофамина [46, 47].  Крысы DAT-KO представляют собой ценную модель для изучения роли дофамина в процессах внимания и других когнитивных функций, а их поведенческий фенотип дает представление о нейробиологической основе различных расстройств человека.

Заключение. На основе анализа собственных данных поведения и других исследований сделан вывод, что поведенческая расторможенность представляет собой перекрывающуюся черту элементов аддиктивного поведения: импульсивности и компульсивности, которые требуют самостоятельного изучения у животных DAT-KO.  Наличие гипердофаминергии, повышенной двигательной и исследовательской активности у крыс DAT-HET при одновременном нарушении когнитивных функций может прогнозировать у них аддиктивные расстройства поведения в условиях ген-средового взаимодействия.  

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. А.В. Лизунов – проведение генотипирования животных; А.А. Лебедев, С.С. Пюрвеев — написание и редактирование текста статьи, концепция исследования; Е.Е. Ляксо, Н.Р. Евдокимова, А.Г. Пшеничная, В.А. Лебедев, Е.Р. Бычков — написание и редактирование текста статьи. П.Д. Шабанов — редактирование текста статьи, концепция исследования.

Авторы одобрили версию для публикации, а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой ее части.

Этическая экспертиза. Исследование одобрено комиссией по биоэтике (локальным этическим комитетом) ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (протокол No 4/24 от 24.10.2024).

Источник финансирования. Статья поддержана грантом РНФ 25-15-00139.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, доступны в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Благодарности. Авторы благодарны директору Института трансляционной биомедицины СПбГУ (Санкт-Петербург) Р. Р. Гайнетдинову за любезно предоставленных DAT-KO-животных для создания колонии в ФГБНУ «ИЭМ».

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions. A.V. Lizunov — animal genotyping; A.A. Lebedev, S.S. Pyurveev — manuscript writing and editing, study concept; E.E. Lyakso, N.R. Evdokimova, A.G. Pshenichnaya, V.A. Lebedev, E.R. Bychkov — manuscript writing and editing; P.D. Shabanov — manuscript editing, study concept. All authors approved the final version for publication and agree to be accountable for all aspects of the work, ensuring appropriate investigation and resolution of questions related to the accuracy or integrity of any part of the work.

Ethics approval. The study was approved by the Bioethics Committee (local ethics committee) of the Federal State Budgetary Scientific Institution «Institute of Experimental Medicine» (protocol No. 4/24 dated 24.10.2024).

Funding. Supported by the Russian Science Foundation (RSF), grant No. 25-15-00139.

Conflict of interest. The authors declare no relationships, activities, or interests with third parties (commercial or non-commercial) over the past three years that could be affected by the content of the article.

Originality. No previously published material (text, illustrations, data) was used in preparing this work.

Data availability. All data obtained in this study are available within the article.

Generative artificial intelligence. Generative AI technologies were not used in the preparation of this manuscript.

Acknowledgments. The authors are grateful to R. R. Gainetdinov, Director of the Institute of Translational Biomedicine, St. Petersburg State University (St. Petersburg), for kindly providing DAT-KO animals to establish a colony at the Institute of Experimental Medicine.

About the authors

Andrey Lebedev

Author for correspondence.
Email: aalebedev-iem@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-0297-0425

MD, Dr. Sci. (Biological), Professor, Head of Laboratory

Department of Pharmacology named after S.V. Anichkov

References