Disturbances of hormonal status and ovulation process in infantile female rats with polycystic ovary syndrome induced by dehydroepiandrosterone

Full Text

Обоснование

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) представляет собой комплексное эндокринное заболевание, которым в мире страдают от 4 до 21% женщин репродуктивного возраста, что делает его одной из наиболее распространенных гормональных дисфункций у женщин. СПКЯ характеризуется сочетанием клинических и биохимических признаков гиперандрогении, овариальной дисфункции и морфологии поликистозных яичников [1, 2]. Поскольку СПКЯ приводит к нарушению функционирования репродуктивной системы у женщин и часто ассоциирован с бесплодием, то для нормализации фертильности у пациенток с СПКЯ применяют фармакологические подходы (кломифен-цитрат, летрозол), направленные на восстановление функций яичников [3, 4], а также методы вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), включая экстракорпоральное оплодотворение [5]. Важно, что при проведении ВРТ пациентки с СПКЯ часто сталкиваются с серьезными проблемами, которые обусловлены как высоким риском развития синдрома гиперстимуляции яичников при стимуляции гонадотропинами [6], так и низкой долей зрелых форм ооцитов [7].

Для разработки эффективных подходов для лечения и мониторинга СПКЯ, а также оптимизации ВРТ в условиях этой патологии необходимы адекватные модели СПКЯ на животных. Наибольшее распространение здесь имеют модели СПКЯ на грызунах, индуцированные их длительной обработкой андрогенами, в первую очередь дегидроэпиандростероном (ДГЭА), поскольку они сравнительно легко создаются, хорошо воспроизводятся и по ряду характеристик близки СПКЯ человека [8, 9]. Это обусловлено тем, что длительная гиперандрогения является ведущим фактором этиологии и патогенеза СПКЯ [10]. Несмотря на широкое применение ДГЭА-индуцированных моделей СПКЯ на грызунах, они охарактеризованы в недостаточной степени, в том числе в отношении гормонального статуса и функционального состояния систем овариального стероидогенеза и овуляции [9, 11]. Отсутствует информация о влиянии гонадотропинов, лютеинизирующего гормона (ЛГ) и хорионического гонадотропина (ХГ) человека, на овариальный стероидогенез и овуляцию у грызунов с ДГЭА-индуцированным СПКЯ. Имеется лишь одна работа о влиянии на овуляцию у мышей с ДГЭА-индуцированным СПКЯ агониста гонадолиберина, который частично восстанавливал овуляцию, вызывая образование желтых тел (ЖТ) [12].

Исследование стимуляции овариального стероидогенеза и овуляции у грызунов с ДГЭА-индуцированным СПКЯ исключительно важно для разработки оптимальных стратегий контролируемой индукции овуляции при СПКЯ, которая зачастую являются единственным путем для развития беременности у пациенток с этим заболеванием. Поскольку при СПКЯ применение ЛГ и ХГ человека несет значимые риски развития синдрома гиперстимуляции яичников [6], то альтернативой им могут стать низкомолекулярные аллостерические агонисты рецептора ЛГ, наделенные активностью индукторов овуляции, которые, в отличие от ЛГ и ХГ человека, оказывают на рецептор ЛГ более умеренный стимулирующий эффект и не вызывают его значимой даун-регуляции [13]. Нами ранее показано, что тиено[2, 3-d]-пиримидиновые производные TP03 и TP4/2 при введении неполовозрелым, предварительно обработанным Фоллимагом самкам крыс [14, 15], а также половозрелым животным [16] повышают у них продукцию прогестерона и стимулируют овуляцию, о чем свидетельствует образование в яичниках желтых тел, количество которых сопоставимо с таковым при стимуляции крыс с помощью ХГ человека [14]. Однако данные о эффективности аллостерических агонистов рецептора ЛГ при СПКЯ в литературе отсутствуют.

Цель исследования

Изучить овариальный стероидогенез, маркеры овуляции и морфологию яичников у инфантильных самок крыс с СПКЯ, индуцированным ДГЭА, а также оценить влияние на эти показатели аллостерического агониста TP03, 5-амино-N-трет-бутил-2-(метилсульфанил)-4-(3-(никотинамидо)фенил)тиено[2, 3-d]-пиримидин-6-карбоксамида.

Методы

Дизайн исследования

Эксперименты проводили с неполовозрелыми (инфантильными) самками крыс линии Wistar, возраст которых в начале исследования составил 23-26 дней (масса тела 60-70 г). 22 крысы на протяжении 6 недель обрабатывали ДГЭА (суточная доза – 6 мг/100 г) («ACMEC Biochemical Co. Ltd.», КНР), в то время как еще 9 крыс вместо ДГЭА получали его растворитель (кунжутное масло) и рассматривались, как контроль. Животных, которые по результатам анализа прогестерона в крови (через 5½ недель после начала ДГЭА-обработки) и мониторинга эстрального цикла в течение последних двух недель ДГЭА-обработки (нарушенный эстральный цикл и длительное нахождение в фазах проэструс/диэструс), соответствовали критериям СПКЯ, рандомизировали на две группы. Одну из них обрабатывали Фоллимагом (15 МЕ/крысу, п/к) («Мосагроген», Россия), гонадотропином со смешанной активностью фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) (преимущественно) и ЛГ, а через 48 ч TP03, аллостерическим агонистом рецептора ЛГ (25 мг/кг массы тела, в/б). Другая группа в тех же объемах получала их растворители – физиологический раствор вместо Фоллимага и ДМСО вместо TP03. Контрольную группу составили крысы с регулярным эстральным циклом. Тем самым, формировали 3 группы: контроль (Con, n=7), СПКЯ без обработки TP03 (PO, n=8) и СПКЯ с обработкой Фоллимагом и TP03 (PO+TP, n=7). В конце эксперимента животных наркотизировали и декапитировали, оценивая у них массу тела и яичников, уровни глюкозы и стероидных гормонов в крови, экспрессию овариальных генов, а также проводили морфологический анализ яичников.

Условия проведения исследования

На протяжении всего эксперимента крысы находились в экспериментальной комнате вивария ИЭФБ РАН, в клетках по 3–4 животных в каждой, со свободным доступом к сухому гранулированному корму и питьевой воде. Животных содержали в условиях стандартного режима освещения (день/ночь: 12 ч/12 ч), при температуре 21–24 ℃.

Критерии соответствия (отбора)

При формировании группы самок крыс с развившимся СПКЯ в качестве критериев отбора использовали снижение уровня прогестерона, не менее чем на 30%, по отношению к среднему уровню гормона, измеренному в диэструсе у контрольной группы, а также нарушение эстрального цикла и преимущественное нахождение животных в фазах проэструс/диэструс по результатам микроскопического анализа влагалищных мазков. В результате из 22 животных, подвергшихся длительной обработке ДГЭА, для дальнейших экспериментов были отобраны 15 крыс, которые удовлетворяли приведенным выше критериям, а остальные были исключены из экспериментов. В контрольной группе для исследования были отобраны самки крыс с регулярным эстральным циклом, находящиеся в диэструсе (7 животных из 9).

Описание вмешательства

Для индукции СПКЯ инфантильным самкам крыс, начиная с возраста 23-26 дней, на протяжении 6 недель вводили ДГЭА. Через 5½ недель у животных забирали кровь из хвостовой вены под местной анестезией (2%-ный раствор лидокаина, 2–4 мг/кг), оценивая уровни глюкозы, прогестерона, эстрадиола и тестостерона. Через 6 недель обработки ДГЭА, часть крыс с развившимся СПКЯ (группа PO) получала растворители препаратов, а другая часть обрабатывалась Фоллимагом и через 48 ч TP03 (группа PO+TP). В конце эксперимента крыс наркотизировали с помощью хлоралгидрата (400 мг/кг, в/б), декапитировали, оценивали массу тела, забирали яичники для измерения их массы и дальнейшего исследования экспрессии целевых овариальных генов с помощью ПЦР, а также образцы крови для измерения уровней прогестерона и эстрадиола.

Исходы исследования

Основной исход исследования

Оценка гормонального статуса (уровни эстрадиола, прогестерона и тестостерона в крови), морфологический и функциональный анализ яичников (определение числа предовуляторных и третичных фолликулов и фолликулярных кист, измерение экспрессии овариальных генов) и изучение ответа на стимуляцию TP03, низкомолекулярным агонистом рецептора ЛГ (образование желтых тел, изменения гормонального статуса), у крыс с ДГЭА-индуцированной моделью СПКЯ.

 

Дополнительные исходы исследования

Не предусмотрены.

 

Методы регистрации исходов

Для изучения стероидогенного статуса, а также ответа на стимуляцию TP03 в крови животных измеряли уровни прогестерона, эстрадиола и тестостерона, для чего использовали наборы «Прогестерон-ИФА» и «Эстрадиол-ИФА» фирмы «ХЕМА» (Россия) и набор «СтероидИФА-тестостерон» («Алкор-Био», Россия). Уровни глюкозы измеряли с помощью глюкометра и тест-полосок «One Touch Ultra» («LifeScan Inc.», США).

Определение фазы эстрального цикла проводили с использованием микроскопического исследования вагинального мазка по стандартной методике [17], для чего у крыс на протяжении двух последних недель эксперимента ежедневно в 10.00 забирали влагалищные мазки. Мазок переносили с тампона на предметное стекло и высушивали. Стадии эстрального цикла определяли по соотношению ядросодержащих эпителиоцитов, безъядерных ороговевших эпителиоцитов и лейкоцитов.

Морфологический анализ яичников проводили по описанной ранее методике [14]. Яичники фиксировали в 4%-ном растворе пара-формальдегида в Na-фосфатном буфере (20 мМ, pH 7.4, 0.9% NaCl) в течение 48 ч при 4 °C. После промывки тем же буфером их помещали в 30%-ный раствор сахарозы и замораживали на сухом льду с использованием среды Tissue-Tek («Sacura, Finetek Europe», Нидерланды). С помощью криостата Leica CM-1520 («Leica Microsystems», Германия) готовили серии продольных срезов (толщина 8–10 мкм), каждый пятый срез в серии помещали на стекло Super-Frost («Menzel», Берлин, Германия). После промывки стекол со срезами фосфатным буфером и их обработки 50%-ным водным этанолом в течение 15 мин, их окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Окрашенные срезы промывали и заключали под покровное стекло, используя для этого глицерин. Морфологический анализ проводили с помощью микроскопа Carl Zeiss Imager A1 («Carl Zeiss», Германия), подсчитывая на срезах количество третичных и предовуляторных фолликулов, желтых тел и фолликулярных кист. Сканирование стекол для получения изображений осуществляли с помощью планшетного сканнера CanoScan 8800F («Canon», Япония), после чего полученные изображения обрабатывали с использованием программы Photoshop CS6.

Экспрессию овариальных генов оценивали с помощью RT-ПЦР, для чего с помощью реагента ExtractRNA из яичников выделяли суммарную РНК и осуществляли обратную транскрипцию, используя набор MMLV RT Kit («Евроген», Россия). Сигналы оценивали с помощью амплификатора Applied Biosystems 7500 («Thermo Fisher Scientific Inc.», США) и набора qPCRmix-HS SYBR+Low ROX («Евроген», Россия) в смеси, которая содержала по 0.4 мкмоль/л прямого и обратного праймеров. Структура используемых в работе прямых и обратных праймеров для целевых овариальных генов представлена в таблице 1. В качестве референсных использовали гены актина B (Actb) и 18S рРНК. Для расчета данных по экспрессии генов использовали метод ΔΔC_t, относя их к экспрессии генов в контрольной группе, принятой за 1.0. При расчете использовали программное обеспечение 7500 Software v2.0.6 и Expression Suite Software v1.0.3 (США).

 

Таблица 1. Последовательности прямых и обратных праймеров, используемых для оценки уровня экспрессии генов в яичниках

Table 1. Sequences of forward and reverse primers used to assess gene expression in the ovaries

 

Гены	Прямой (For) и обратный (Rev) праймеры	Размер продукта (bp)	Идентификатор по Genbank
StAR	(For) AAGGCTGGAAGAAGGAAAGC (Rev) CACCTGGCACCACCTTACTT	66	NM_031558.3
Cyp11a1	(For) TATTCCGCTTTGCCTTTGAG (Rev) CACGATCTCCTCCAACATCC	74	NM_017286.3
Cyp17a1	(For) CATCCCCCACAAGGCTAAC (Rev) TGTGTCCTTGGGGACAGTAAA	61	XM_006231435.3
Cyp19a1	(For) GGTATCAGCCTGTCGTGGAC (Rev) AGCCTGTGCATTCTTCCGAT	118	NM_017085.2
Lhcgr	(For) CTGCGCTGTCCTGGCC (Rev) CGACCTCATTAAGTCCCCTGAA	103	NM_012978.1
Vegf-a	(For) CACTGGACCCTGGCTTTACT (Rev) GACGTCCATGAACTTCACCA	62	NM_001287114.1
Vegf-b	(For) GCACAAATCAGATGGTGAGAGA (Rev) CAGGAGATGGTTGATGGCTTAG	101	XM_006230911.4
Cox-2	(For) ATCAAAGCCTTCGCCACTCA (Rev) ACGGGGCCTTCAAAATGTCT	79	NM_017232.4
Egr-1	(For) CGTAATCCAAGGGGGTCCAG (Rev) GTGTAAGCTCATCCGAGCGA	196	NM_012551.3
Adamts-1	(For) CTGCTGCCCTCAGGTGTAAA (Rev) TGAGTGGACTAAAGCTGCGG	187	NM_024400.2
Actb	(For) CTGGCACCACACCTTCTACA (Rev) AGGTCTCAAACATGATCTGGGT	125	NM_031144.3
18S rRNA	(For) GGACACGGACAGGATTGACA (Rev) ACCCACGGAATCGAGAAAGA	50	XM_039106097.1

 

Анализ в подгруппах

Все сравниваемые животные имели сходные пол и возраст, но различались характером воздействий. Сравнивали контрольных животных и крыс с ДГЭА-индуцированным СПКЯ, а также СПКЯ-крыс с обработкой Фоллимагом и TP03 и без таковой. Перед формированием групп с СПКЯ, согласно критериям отбора, из эксперимента были исключены животные, не удовлетворяющие выбранным критериям.

Статистические процедуры

Запланированный размер выборки

Размер выборки предварительно оценивали из расчета не менее 6 животных в каждой экспериментальной группе. Поскольку развитие СПКЯ происходит не у всех животных, которых обрабатывали ДГЭА, то изначально брали больше животных, с учетом исключения тех, которые не удовлетворяли условиям отбора. Так для индукции СПКЯ были взяты 22 крысы, из которых в дальнейшем 15 удовлетворяли условиям отбора. Из 9 контрольных крыс для экспериментов были отобраны 7.

Статистические методы

Статистический анализ данных осуществляли с помощью программы IBM SPSS Statistics 26 («IBM», США). Нормальность распределения проверяли критерием Колмогорова-Смирнова, равенство дисперсий критерием Левена. Данные, имеющие нормальное распределение (масса тела, масса яичников, уровни глюкозы и стероидных гормонов, экспрессия ряда генов), оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорным тестом Тьюки (при условии соблюдения равенства дисперсий) или с апостериорным тестом Даннет (если дисперсии не были равными), представляя их, как M±SEM. Данные, имеющие ненормальное распределение (число фолликулов, кист и желтых тел, экспрессия ряда генов), анализировали с помощью критерия Крускалла-Уоллиса с последующим попарным сравнением по Манна-Уитни с поправкой Бонферрони, представляя, как медиану и межквартильные интервалы (25%; 75%). Различия считали достоверными при уровне значимости p<0.05.

Результаты

Формирование выборки

 

Рис. 1. Последовательность формирования выборки исследования

Fig. 1. Formation of the research sample

Характеристики выборки

Описание основных параметров животных включены в таблицы 2 (масса тела, уровни глюкозы), 4 (уровни прогестерона и эстрадиола) и на рисунке 2 (фазы эстрального цикла) в разделе Основные результаты исследования.

Основные результаты исследования

Масса тела у крыс с ДГЭА-индуцированным СПКЯ была снижена в сравнении с контролем, хотя и в небольшой степени (снижение на 12.2%, p<0.001), и частично восстанавливалась при обработке Фоллимагом и TP03 (табл. 2). В группе PO отмечали снижение более чем в два раза массы яичников и снижение на 45% отношения массы яичников к массе тела. При обработке Фоллимагом и TP03 наблюдали значительное повышение массы яичников и ее соотношения к массе тела, причем как в сравнении с группой PO, так и с контролем (табл. 2). Уровень случайной глюкозы в крови крыс с СПКЯ значимо не менялся, но в небольшой степени повышался по сравнению с контролем при обработке Фоллимагом и TP03 (табл. 2).

 

Таблица 2. Масса тела и яичников, удельная доля яичников и уровень глюкозы у самок крыс с СПКЯ в сравнении с контрольными животными, и влияние на них обработки TP03

Table 2. Body and ovarian weight, ovarian ratio, and glucose levels in female rats with PCOS compared with control animals, and the effect of TP03 treatment on them

Показатель	Con (n=7)	PO (n=8)	PO+TP (n=7)
Масса тела, г	229.2±3.4	201.3±4.9 a	209.7±8.4
Масса яичников, мг	83.7±4.9	40.2±2.2 a	109.6±5.5 a,b
Отношение массы яичников к массе тела, мг%	3.65±0.20	2.02±0.15 a	5.25±0.23 a,b
Глюкоза, ммоль/л	6.43±0.27	6.90±0.13	7.33±0.19 a

Примечание. Различия с контролем (^a) и PO (^b) статистически значимы при p<0.05. Данные представлены, как M±SEM.

Note: Differences from control (^a) and PO (^b) are significant at p<0.05. Data are presented as M±SEM.

Исследование влагалищных мазков в последние 2 недели развития СПКЯ показали, что крысы с моделью этого заболевания имеют нарушенный эстральный цикл и находятся преимущественно в фазах диэструс (D) и проэструс (P), но без перехода в эструс (E). Наиболее типичные профили смены фаз цикла для контрольных и СПКЯ-крыс представлены на рисунке 2.

 

Рис. 2. Типичные профили смены фаз эстрального цикла у самок крыс с СПКЯ в сравнении с контрольными животными. D – диэструс, P – проэструс, E – эструс, M – метэструс.

Fig. 2. Typical profiles of the changes in estrous cycle phases in female rats with PCOS compared to control animals. D – diestrus, P – proestrus, E – estrus, M – metestrus

 

Морфологическое исследование яичников показало, что у крыс с СПКЯ, в сравнении с контролем, снижено число третичных фолликулов и желтых тел предыдущих эстральных циклов, хотя число предовуляторных фолликулов сопоставимо с таковым в контроле (рис. 3, табл. 3). Характерным является наличие фолликулярных кист в яичниках крыс группы PO при их отсутствии в яичниках контрольных животных (рис. 3, табл. 3). После стимуляции крыс с помощью TP03 не было выявлено значимых изменений числа третичных и предовуляторных фолликулов, желтых тел предыдущих циклов и количества кист по сравнению с необработанными СПКЯ-крысами, но появлялись новые желтые тела (рис. 3, табл. 3). Наряду с нормальными желтыми телами в группе PO+TP были выявлены ЛНФ, число которых превышало число желтых тел (рис. 3, табл. 3).

 

Таблица 3. Третичные и предовуляторные фолликулы, желтые тела предыдущего и нового циклов, лютеинизированные неразорвавшиеся фолликулы и кисты в яичниках крыс с СПКЯ в сравнении с контрольными животными, и влияние на них обработки TP03

Table 3. Tertiary and preovulatory follicles, corpora lutea of ​​the previous and new cycles, luteinized unruptured follicles and cysts in the ovaries of rats with PCOS in comparison with control animals, and the effect of TP03 treatment on them

Показатель	Con (n=7)	PO (n=8)	PO+TP (n=7)
Третичные фолликулы, шт.	24.5 (22.3; 27.0)	8.5 (4.5; 10.8) a	11.0 (6.0; 17.0) a
ПФ, шт.	4.5 (3.8; 6.3)	4.0 (2.5; 4.0)	4.0 (1.0; 9.0)
ЖТ предыдущего цикла, шт.	8.5 (7.8; 10.3)	3.0 (1.3; 4.0) a	4.0 (3.0; 4.0) a
ЖТ нового цикла, шт.	Нет	Нет	2.0 (2.0; 3.0) a,b
ЛНФ, шт.	Нет	Нет	4.0 (3.0; 5.0) a,b
Кисты, шт.	Нет	4.0 (2.3; 6.8) a	4.0 (3.0; 6.0) a

Примечание. Различия с контролем (^a) и PO (^b) статистически значимы при p<0.05. Данные представлены, как медиана и межквартильный интервал (25%; 75%). ПФ – предовуляторные фолликулы, ЛНФ – лютеинизированные неразорвавшиеся фолликулы, ЖТ– желтые тела.

Note. Differences from control (^a) and PO (^b) are significant at p<0.05. Data are presented as median and interquartile range (25%; 75%). PF – preovulatory follicles, LUF – luteinized unruptured follicles, CL – corpora lutea.

 

Рис. 3. Срезы яичников СПКЯ-крыс, в том числе с обработкой TP03, в сравнении с контрольными животными. а – Con; б – PO; в – PO+TP03. Обозначения: ПФ – предовуляторные фолликулы, пЖТ – желтые тела, образовавшиеся в предыдущих циклах, нЖТ – новые желтые тела, появившиеся в результате стимуляции крыс TP03, ЛНФ – лютеинизированные неразорвавшиеся фолликулы, ФК – фолликулярные кисты. Толщина срезов – 10 мкм. Окраску срезов проводили гематоксилином и эозином. Масштаб – 1 мм.

Fig. 3. Ovarian sections from PCOS rats, including those treated with TP03, compared to control animals. a – Con; b – PO; c – PO+TP03. Abbreviations: PF – preovulatory follicles, pCL – corpora lutea formed in previous cycles, nCL – new corpora lutea formed as a result of stimulation of rats with TP03, LUF – luteinized unruptured follicles, Cyst – follicular cysts. Section thickness is 10 μm. Sections were stained with hematoxylin and eosin. Scale bar is 1 mm.

 

Уровень эстрадиола в крови СПКЯ-крыс до их разделения на группы не менялся, в то время как уровень прогестерона был снижен более чем в 3 раза (p=0.00001) (табл. 4). Отмечалось также отчетливо выраженное повышение уровня тестостерона (p=0.00001 в сравнении с контролем), что обусловлено длительным введением ДГЭА, прекурсора тестостерона (табл. 4). После стимуляции TP03 уровень эстрадиола не менялся, в то время как уровень прогестерона повышался и превосходил таковой в группе PO на 260% (p=0.001). Более того, он превышал уровень гормона в контрольной группе животных (табл. 4).

 

Таблица 4. Уровни стероидных гормонов в сыворотке крови самок крыс с СПКЯ в сравнении с контрольными животными, и влияние на них обработки TP03.

Table 4. Serum steroid hormone levels in female rats with PCOS compared to control animals and the effect of TP03 treatment on them.

 

Гормон	Con (n=7)	PO (n=8)	PO+TP (n=7)
До обработки Фоллимагом и ТР03 (СПКЯ-крысы, n=15)
Эстрадиол, нмоль/л	0.41 (0.24; 0.53)	0.32 (0.23; 0.34)
Прогестерон, нмоль/л	16.80 (14.60; 21.13)	5.2 (3.9; 6.8) a
Тестостерон, нмоль/л	3.75 (2.73; 3.98)	17.48 (8.73; 22.02) a
После обработки Фоллимагом и ТР03
Эстрадиол, нмоль/л	0.42±0.07	0.27±0.03	0.32±0.04
Прогестерон, нмоль/л	17.89±1.90	8.72±0.93 a	31.36±3.18 a,b

Примечание. Различия с контролем (^a) и PO (^b) статистически значимы при p<0.05. Данные представлены, как M±SEM в случае нормального распределения или как медиана и  межквартильный интервал (25%; 75%) в случае распределения данных, отличных от нормального распределения.

Note. Differences from control (^a) and PO (^b) are significant at p<0.05. Data are presented as M±SEM in case of normal distribution or as median and interquartile range (25%; 75%) in case of data distribution other than normal distribution.

 

Изучение экспрессии овариальных генов, вовлеченных в синтез и конверсию стероидных гормонов, привело к следующим результатам. В группе СПКЯ была значимо снижена экспрессия генов, кодирующих холестерин-транспортирующий белок StAR, а также цитохромы CYP11A1 и CYP17A1, ответственные за ключевые стадии синтеза прогестерона и его производных. Экспрессия генов, кодирующих рецептор ЛГ и фермент ароматазу (цитохром CYP19A1), значимо не менялась. Обработка TP03 приводила к повышению экспрессии гена Cyp17a1, которая в группе PO+TP превосходила этот показатель и в контрольной группе (рис. 4). Экспрессия гена цитохрома CYP11A1 также повышалась, но в небольшой степени, не достигая ее значений в контроле, в то время как экспрессия гена Star не восстанавливалась и оставалась существенно ниже контрольного уровня (рис. 4). В группе PO+TP в очень значительной степени снижалась экспрессия гена Cyp19a1, причем ниже ее уровня как в контроле, так и в группе PO (рис. 4).

 

Рис. 4. Тепловая карта и экспрессия овариальных генов в яичниках самок крыс с СПКЯ в сравнении с таковой у контрольных животных, и влияние на нее TP03. Различия с контролем (^a) и PO (^b) статистически значимы при p<0.05. Данные представлены, как M±SEM в случае нормального распределения или в виде графиков «box-and-whiskers» (линия в середине – медиана, границы ящика – 25-й и 75-й процентили, концы усов – минимальное и максимальное наблюдаемые значения) в случае распределения данных, отличных от нормального распределения.

Fig. 4. Heat map and ovarian gene expression in the ovaries of female rats with PCOS compared to that of control animals, and the effect of TP03. Differences from control (^a) and PO (^b) are significant at p<0.05. Data are presented as M±SEM in case of normal distribution or as box-and-whiskers plots (the line in the middle is the median, the boundaries of the box are the 25^th and 75^th percentiles, the ends of the whiskers are the minimum and maximum observed values) in case of data distribution different from normal distribution.

 

Изменения были обнаружены также для экспрессии генов, являющихся маркерами овуляции. В группе PO снижалась экспрессия генов Adamts-1 и Vegf-a, кодирующих металлопротеиназу ADAMTS-1 и фактор роста эндотелия сосудов А-типа (VEGF-A), и повышалась экспрессия гена Cox-2, кодирующего циклооксигеназу-2 (рис. 4). При этом значимых изменений в экспрессии генов Egr-1 и Vegf-b, кодирующих белок-1 раннего ростового ответа и фактор VEGF-B, выявлено не было. Обработка TP03 приводила к еще большему повышению экспрессии гена Cox-2, а также восстанавливала экспрессию генов Adamts-1 и Vegf-a, но не выше контрольного уровня (рис. 4). Экспрессия генов Egr-1 и Vegfb в группе PO+TP не менялась.

 

Дополнительные результаты исследования

Дополнительные исходы исследования не предусмотрены.

Нежелательные явления

Нежелательные явления в ходе проведения экспериментов отсутствовали. Исключение составили две крысы с СПКЯ, у которых на фоне инъекций ДГЭА возникли проблемы с функционированием желудочно-кишечного тракта, и они были выведены из эксперимента еще на предварительном этапе до формирования экспериментальных групп.

Обсуждение

Резюме результатов исследования

Показано, что у инфантильных самок крыс с СПКЯ, индуцированным шестинедельной обработкой ДГЭА (6 мг/100 г/сутки, п/к), снижены масса яичников, число третичных фолликулов и желтых тел предыдущих циклов, уровни прогестерона и эстрадиола в крови, экспрессия генов овариального стероидогенеза (Star, Cyp11a1, Cyp17a1) и маркеров овуляции (Adamts-1, Vegf-a), повышен уровень тестостерона в крови, а в яичниках обнаруживаются фолликулярные кисты, что хорошо соответствует патогенетической картине СПКЯ. Обработка крыс сначала Фоллимагом, а затем низкомолекулярным агонистом рецептора ЛГ приводила к повышению массы яичников, значительному повышению уровня прогестерона в крови и экспрессии гена цитохрома CYP17A1 в яичниках, а также вызывала овуляцию, о чем свидетельствует появление в яичниках желтых тел нового цикла. Наряду с ними в яичниках выявлялись ЛНФ, что было ассоциировано с ослаблением ответа яичников на TP03, а также со снижением экспрессии генов, кодирующих металлопротеиназу ADAMTS-1 и фактор VEGF-A, ответственных за разрыв фолликулов после активации агонистом рецептора ЛГ.

Интерпретация результатов исследования

Масса тела у самок крыс, обработанных ДГЭА, снижалась в сравнении с контролем в небольшой степени, хотя и статистически значимо, в то время как уровень глюкозы при этом не менялся. Отсутствие существенных изменений массы тела и глюкометаболических показателей является характерной особенностью ДГЭА-индуцированной модели СПКЯ, и в целом согласуется с данными других авторов, полученными как на крысах Wistar [18], так и на мышах [19, 20]. В этом состоит отличие ДГЭА-индуцированной модели СПКЯ у грызунов от заболевания у человека, поскольку ожирение и нарушенная толерантность к глюкозе достаточно часто встречаются у женщин с СПКЯ и являются одними из факторов риска развития этого заболевания [21, 22]. Вследствие этого ДГЭА-модели СПКЯ на грызунах в большей степени используют для изучения изменений функционального состояния и гормонального статуса яичников, чем для оценки метаболических нарушений при СПКЯ [23].

В полном соответствии с вышесказанным, у инфантильных крыс с СПКЯ были выявлены значительные нарушения морфологии яичников. В сравнении с контрольной группой того же возраста СПКЯ-крысы имели сниженную массу яичников и ее соотношения к общей массе тела, а также, по данным микроскопического анализа, характеризовались сниженным числом третичных фолликулов и желтых тел предыдущих циклов при отсутствии новых желтых тел. Кроме того, у них было продемонстрировано появление значительного числа фоллликулярных кист. Эти данные свидетельствуют о развитии у обработанных ДГЭА инфантильных крыс патогенетической картины, типичной для СПКЯ, и хорошо согласуются с данными других авторов, которые у крыс и мышей с ДГЭА-индуцированным СПКЯ также выявили морфологию поликистозных яичников, дисфункции в созревании фолликулов и нарушение овуляции [18, 20].

При изучении гормонального статуса у СПКЯ-крыс нами было выявлено значительное повышение уровня тестостерона, как следствие введения животным экзогенного ДГЭА, что на ДГЭА-моделях СПКЯ у крыс наблюдали и другие авторы [24-26]. Как известно, ДГЭА, андроген адренокортикального происхождения, далее превращается в предшественники тестостерона – андростендион и андростендиол. Наряду с этим было показано значимое снижение уровня прогестерона в крови СПКЯ-крыс. Одной из причин этого может являться снижение в яичниках СПКЯ-крыс экспрессии генов, кодирующих ключевые ферменты овариального стероидогенеза – холестерин-связывающий белок StAR и цитохромы CYP11A1 и CYP17A1. При этом уровень эстрадиола не менялся, что может быть, по крайней мере, отчасти обусловлено сохранением экспрессии гена Cyp19a1, кодирующего фермент ароматазу, осуществляющую конверсию андрогенов в эстрогены. В других работах также было продемонстрировано снижение уровней прогестерона и эстрадиола в крови крыс с ДГЭА-индуцированным СПКЯ [25-27], а также с моделью СПКЯ, вызванной ингибитором ароматазы летрозолом, вызывающим устойчивую гиперандрогению [28]. Однако имеются исследования, в которых у крыс с ДГЭА-моделью СПКЯ не было показано значимого снижения уровней прогестерона и эстрадиола [18]. Такие различия в гормональном статусе СПКЯ-крыс, как мы полагаем, обусловлены как различными стратегиями индукции СПКЯ, так и различиями используемых линий грызунов. Клинические данные показывают, что сниженный уровень прогестерона в крови является важным патогенетическим фактором у пациенток с СПКЯ и ассоциирован с низким выходом нормальных ооцитов при проведении процедур ВРТ [29, 30]. В то же время нельзя не отметить, что гиперпродукция прогестерона, как и его дефицит, также негативно влияет на результативность ВРТ при СПКЯ [31].

Ранее нами был разработан и изучен TP03, низкомолекулярный агонист рецептора ЛГ, и его структурный аналог TP4/2, которые проявляли выраженный стимулирующий эффект на овариальный стероидогенез и овуляцию у здоровых самок крыс, сравнимый с таковым ХГ человека [14, 15]. Помимо наших работ, имеются данные голландских авторов по стимуляции овуляции как у грызунов [32], так и у женщин добровольцев [33], с помощью соединения Org43553, которое по структуре и механизмам действия имеет черты сходства с TP03, также взаимодействуя с аллостерическим сайтом рецептора ЛГ. Исследования по влиянию низкомолекулярных агонистов рецептора ЛГ на грызунов с моделями СПКЯ в настоящее время отсутствуют. Вследствие этого, данные о TP03-индуцированной стимуляции овуляции у крыс с ДГЭА-индуцированным СПКЯ, полученные в настоящем исследовании, является первым сообщением об эффективности таких агонистов при СПКЯ. Нами обнаружено, что обработка TP03 значительно повышает массу яичников у СПКЯ-крыс, стимулирует у них продукцию прогестерона и образование желтых тел нового цикла. Следует отметить, что данные о стимуляции овуляции у грызунов с СПКЯ гонадотропинами и агонистами гонадолиберина, стимулирующими секрецию эндогенного ЛГ аденогипофизом, также весьма немногочисленны и неоднозначны. По стимуляции овуляции при ДГЭА-индуцированном СПКЯ имеется лишь одна работа [12], авторы которой показали формирование новых желтых тел у мышей с ДГЭА-моделью СПКЯ при их обработке агонистом гонадолиберина. Противоречивые результаты получены при изучении влияния ХГ лошади, наделенного активностью ЛГ и ФСГ, на овуляцию у крыс с другой андроген-индуцированной моделью СПКЯ, вызываемой 5α-дигидротестероном. Одни авторы не выявили стимулирующего влияния гонадотропина на овуляцию и образование полноценных желтых тел у СПКЯ-крыс, хотя и отмечали улучшение у них фолликулогенеза и повышение выживаемости клеток гранулезы [34], в то время как другие показали частичное восстановление овуляции и снижение числа фолликулярных кист [35].

Важно отметить, что, наряду с новыми желтыми телами, в яичниках крыс группы PO+TP нами были идентифицированы ЛНФ, как результат нарушения молекулярных механизмов, ответственных за разрыв стенки фолликула в условиях стимуляции яичников агонистом рецептора ЛГ. Ранее при исследовании вызываемой TP03 и его аналогом TP4/2 стимуляции овуляции у здоровых самок крыс того же возраста ЛНФ не выявлялись [14, 15], что указывает на прямую взаимосвязь между СПКЯ и их появлением в яичниках крыс при TP03-индуцированной овуляции. Такие дефектные лютеинизированные фолликулы были выявлены как у пациенток с СПКЯ, ассоциированным с гиперандрогенией и низким уровнем прогестерона, при их стимуляции препаратами ФСГ и аналогом гонадолиберина [36], так и у мышей с эндометриозом, у которых была ослаблена сигнализация через рецептор ЛГ в яичниках [37].

Одной из причин появления ЛНФ может быть значительное снижение в яичниках ДГЭА-крыс экспрессии генов, кодирующих металлопротеиназу ADAMTS-1 и ростовой фактор VEGF-A. Металлопротеиназа ADAMTS-1 играет ключевую роль как в осуществлении поздних стадий фолликулогенеза, так и в индукции овуляции, осуществляя необходимый для этого процесс ремоделирования внеклеточного матрикса, который опосредуется через сигнальные пути, зависимые от прогестерона [38, 39]. Нокаут гена Adamts-1 приводит к бесплодию у мутантных самок мышей, что обусловлено неспособностью зрелого ооцита выйти из фолликула и, как следствие, образованием ЛНФ [40], подобных тем, которые были идентифицированы в настоящем исследовании. У крыс с СПКЯ отмечали как значительное снижение базальной экспрессии гена Adamts-1, так и ослабленную ее стимуляцию при обработке TP03, которая даже не достигала уровня экспрессии этого гена в яичниках здоровых животных. Следует отметить, что через 16 ч после стимуляции здоровых неполовозрелых самок крыс с помощью ХГ человека и TP4/2, структурного гомолога TP03, экспрессия гена Adamts-1 в яичниках повышалась в сравнении с контролем в 2.5–3 раза [14]. Поскольку экспрессия гена регулируется через овариальные рецепторы к прогестерону, то одной из ключевых причин ее ослабления является снижение как базального уровня прогестерона у СПКЯ-крыс, так и снижение стимулирующего эффекта на него TP03. Согласно нашим ранним исследованиям, через 16 ч после обработки здоровых неполовозрелых самок крыс с помощью TP03 средний уровень прогестерона в крови животных превышал 50 нмоль/л [15], при обработке TP4/2 – 40 нмоль/л [14]. В настоящем исследовании при обработке TP03 крыс с СПКЯ он был существенно ниже и составил 31.36±3.18 нмоль/л.

VEGF-A, как фактор, регулирующий проницаемость сосудов, контролирует в яичниках локальные потоки жидкости и, тем самым, изменяет гидростатическое давление внутри фолликула, играя решающую роль в процессе разрыва стенки фолликула во время овуляции [41]. Вследствие этого не удивительно, что снижение экспрессии гена Vegf-a в яичниках СПКЯ-крыс ассоциировано с нарушением у них процесса овуляции, в том числе с нарушением разрыва стенки лютеинизированного фолликула [42]. Нами показано значимое снижение экспрессии гена Vegf-a у не стимулированных СПКЯ-крыс и лишь частичное ее восстановление при обработке животных TP03. При этом экспрессия гена Vegf-b, который кодирует фактор VEGF-B, проявляющий свойства конкурентного антагониста VEGF-A [43], при стимуляции крыс TP03 не менялась. В то же время ранее при изучении TP4/2-индуцированной стимуляции здоровых неполовозрелых крыс нами было показано снижение экспрессии гена Vegf-b в несколько раз, что предопределяло усиление VEGF-A-сигналинга и было еще одним механизмом повышения эффективности разрыва фолликулов у здоровых животных [14].

В яичниках СПКЯ-крыс нами определен значительно повышенный уровень экспрессии гена Cox-2, кодирующего циклооксигеназу 2 типа, которая превращает арахидоновую кислоту в ее производные, включая биоактивные простагландины с провоспалительной активностью. Повышенный уровень экспрессии и активности фермента COX-2 продемонстрирован в яичниках пациенток с СПКЯ и тесно ассоциирован с усилением в них воспаления, опосредуемого простагландинами [44]. У животных с моделями СПКЯ также отмечено значительное усиление активности COX-2 и обусловленное этим изменение баланса биоактивных производных арахидоновой кислоты [45]. Так повышенная экспрессия гена Cox-2 обнаружена у самок крыс с СПКЯ, индуцированным летрозолом [46] и эстрадиола валератом [47]. Как показано нами ранее, стимуляция здоровых самок крыс различными агонистами рецептора ЛГ – ХГ человека и TP4/2, приводит к предовуляторному повышению экспрессии гена Cox-2 через 4 ч, а через 16 ч она снижается до контрольного уровня и даже ниже [14]. В случае СПКЯ-крыс повышенный уровень экспрессии этого гена, который превосходил таковой даже в группе PO, был отмечен через 16 ч, что может быть обусловлено продолжающимся воспалительным процессом. Нельзя исключить того, что выявленные нами особенности временной динамики изменения экспрессии гена при СПКЯ могут быть каким-то образом связаны с образованием ЛНФ, для которых характерна незавершенность процесса овуляции. Изучение причинно-следственных связей между активностью COX-2 и нарушением овуляции при СПКЯ является интригующей задачей, требующей дальнейших исследований.

Ограничения исследования

Используемая модель СПКЯ, индуцированная обработкой ДГЭА, не приводит к существенным изменениям массы тела и уровня глюкозы, что не позволяет использовать ее для оценки метаболических нарушений при СПКЯ, что, однако, и не входило в задачи настоящего исследования. В работе исследовали только одну временную точку после обработки животных TP03 (16 ч), которая была выбрана, как наиболее подходящая для мониторинга показателей индукции овуляции, на основе предыдущих исследований по стимулирующему влиянию аллостерических агонистов рецептора ЛГ на овуляцию у здоровых неполовозрелых самок крыс. Однако нельзя исключить, что при ДГЭА-индуцированном СПКЯ временная динамика изменения этих показателей в ходе стимуляции может меняться, как это показано нами для экспрессии гена Cox-2, что требует дополнительных исследований.

Заключение

Выявлен широкий спектр гормональных и функциональных нарушений в яичниках инфантильных крыс с СПКЯ, индуцированным обработкой ДГЭА, что необходимо для использования этой модели для оценки этиологии и патогенеза СПКЯ, обусловленного гиперандрогенией, являющейся ключевым фактором развития СПКЯ у женщин. Впервые, с использованием TP03, разработанного авторами низкомолекулярного аллостерического агониста рецептора ЛГ, исследована способность активаторов этого рецептора индуцировать овуляцию у крыс с ДГЭА-индуцированным СПКЯ. Установлено, что введение TP03 инфантильным крысам, предварительно обработанных Фоллимагом, приводит к появлению у них желтых тел нового цикла, но при этом также индуцирует образование ЛНФ. Такие фолликулы выявлены у женщин с СПКЯ, но на экспериментальных моделях СПКЯ обнаружены впервые. Изучение профиля экспрессии овариальных генов позволяет предположить, что одной из причин образования ЛНФ является снижение стероидогенного ответа на стимуляцию СПКЯ-крыс агонистом рецептора ЛГ и, как следствие, снижение экспрессии генов двух ключевых белков, вовлеченных в процесс овуляции – металлопротеиназы ADAMTS-1 и ростового фактора VEGF-A.

 

Дополнительная информация

Вклад авторов

Деркач К.В. — анализ данных, администрирование проекта, разработка методологии, написание рукописи;

Печальнова А.С. — проведение исследования, визуализация, работа с данными, написание черновика рукописи;

Морина И.Ю. — проведение исследования, визуализация, работа с данными, написание черновика рукописи;

Федорчук И.В. — проведение исследования, визуализация, работа с данными;

Зорина И.И. — проведение исследования, визуализация, работа с данными, написание черновика рукописи;

Нагорнюк К.Я. — проведение исследования, визуализация, работа с данными

Романова И.В. — проведение исследования, визуализация, работа с данными, написание черновика рукописи;

Шпаков А.О. — определение концепции, обеспечение исследования, руководство исследованием, написание рукописи.

Авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируют надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Благодарности*

Для получения масс-спектров высокого разрешения для TP03 использовано оборудование ресурсного центра СПбГУ «Методы анализа состава вещества».

Этическая экспертиза

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ, принципам Базельской декларации и рекомендациям комиссии по биоэтике ИЭФБ РАН (протокол № 1- 4 / 2025 заседания №1 от 30.01.2025 г.).

Согласие на публикацию

Неприменимо

Источники финансирования

Исследование проведено при финансовой поддержке Российского Научного Фонда (проект № 19-75-20122).

Раскрытие интересов

Отношения, деятельность и интересы за последние 36 месяцев с третьими лицами (физическими и юридическими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи, отсутствуют.

Заявление об оригинальности

Использованы впервые собранные или созданные сведения.

Доступ к данным

Все данные представлены в статье.

Генеративный искусственный интеллект

Все данные представлены в статье.

Рассмотрение и рецензирование

Рукопись направлена в редакцию журнала в инициативном порядке.

Дисклеймер*

Приложения

About the authors

Kira V. Derkach

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: derkatch_k@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-6555-9540
SPIN-code: 6925-1558
Russian Federation, St.-Petersburg, Russia

Alena S. Pechalnova

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук

Email: pechalnova.alena@gmail.com
ORCID iD: 0009-0002-4240-4604

Irina Yu. Morina

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences

Email: irinamorina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2252-0088
SPIN-code: 3489-8842

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Irina V. Fedorchuk

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences

Email: fedorchuk1969@mail.ru
ORCID iD: 0009-0004-7997-0081
Russian Federation, St. Petersburg, Russia

Inna I. Zorina

Email: zorina.inna.spb@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7328-2120
SPIN-code: 3195-4135

Kristina Ya. Nagornyuk

Email: kristy-nagornuk@bk.ru
ORCID iD: 0009-0002-4067-6673

Irina V. Romanova

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences

Email: irinaromanova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0348-0631
SPIN-code: 8891-8186

Dr. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Alexander O. Shpakov

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences

Email: alex_shpakov@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-4293-3162
SPIN-code: 6335-8311

Dr. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

References