Effectiveness of combined preparations of antimicrobial peptides against antibiotic-resistant bacteria

Full Text

Обоснование

Одна из острейших проблем современной медицины связана с распространением среди патогенных микроорганизмов резистентности к применяемым антибиотикам. Согласно современным представлениям, антимикробные пептиды (АМП) системы врожденного иммунитета способны стать основой для разработки класса принципиально новых антибиотических препаратов [1]. Среди ключевых преимуществ, привлекающих внимание исследователей к этим молекулам, стоит отметить затрудненное формирование к ним резистентности и наличие иммуномодулирующего действия, не свойственного большинству конвенциональных антибиотиков.

Множество научных коллективов в настоящее время работает над созданием антибиотических препаратов на основе природных АМП многоклеточных организмов, однако широкого применения в прикладной медицине такие пептиды ещё не нашли. Данные о клинических испытаниях средств на основе пептидов животного происхождения пока что немногочисленны, и лишь единичные препараты вышли на рынок (например, «Энтомикс» и «Аллоферон» на основе пептидов насекомых, «Суперлимф» на основе протегринов свиньи). На основе АМП микробного происхождения, в свою очередь, доступно десять антибиотиков: бацитрацин, даптомицин, колистин, грамицидин D, далбаванцин, оритаванцин, полимиксин B, ванкомицин и телаванцин, тейкопланин. Однако АМП животных имеют ряд преимуществ по сравнению с пептидами микроорганизмов. Как уже упоминалось, они обладают дополнительным влиянием на организм пациента: иммуномодулирующей, ранозаживляющей активностью. Кроме того, их механизм действия считается более плюрипотентным, направленным на множественные мишени, что препятствует развитию микробной резистентности [2], тогда как для большинства микробных пептидных антибиотиков случаи появления устойчивости у патогенов уже зафиксированы. Таким образом, разработка подходов к внедрению АМП животных в практическую медицину обладает несомненной актуальностью.

Для практического использования АМП животных существует ряд проблем, включая недостаточную селективность действия наиболее активных пептидов по отношению к бактериальным клеткам, вследствие чего возможно повреждение также и клеток макроорганизма. Одним из путей преодоления этого ограничения является создание синтетических аналогов природных пептидов, имеющих более широкое терапевтическое окно. Работа ведётся также в направлении повышения стабильности пептидов в биологических системах. Важной задачей является налаживание методов широкомасштабного производства модифицированных АМП со сниженной затратностью [3]. Рассматриваются возможности создания пептидомиметиков, комплексов с различными соединениями (полиэтиленгликолями, наноматериалами и др.), использования специальных средств доставки, например, липосом и наноконтейнеров [4]. Другой подход строится на идее использования пептидов в сочетании с другими антимикробными препаратами для синергетического усиления эффекта. Сочетанное применение различных антимикробных агентов является одной из распространённых стратегий для преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов [1, 3]. Кроме того, такой подход позволяет снизить действующие концентрации и, соответственно, как побочные эффекты, так и стоимость, обусловленную пептидной компонентой.

Настоящее исследование построено в рамках последней парадигмы и представляет собой один из этапов разработки многокомпонентного комбинированного препарата на основе АМП животных. Помимо поиска синергизма антимикробного действия АМП с другими агентами на монокультурах бактерий, проведено тестирование сочетаний против смешанной культуры охарактеризованных антибиотикорезистентных штаммов, а затем и против образцов раневого отделяемого больных, у которых инфекционный процесс имел затяжное течение при стандартной терапии.

Большинство тестированных пептидов были ранее открыты в Институте экспериментальной медицины: протегрин-1 (PG-1) [5], мицецилин (MC), рицецилин (RC)  [6], бактенецины ChBac5 [7] и ChBac3.4, а также структурные модификации последнего [8]. Помимо них исследовали АМП шучин-4 (Shu-4) [9] и PR-39 [10].

Исследованные пептиды относятся к двум структурным классам: бета-шпилечные (PG-1, Shu-4, MC, RC) и пролин-богатые (ChBac3.4, его модификации RFR ChBac3.4 (1-14) и RFR ChBac3.4-1-NH₂, фрагмент бактеницина 5 (Bac 5 (20-43)) и PR-39), которые различаются также механизмом действия. Бета-шпилечные пептиды преимущественно действуют на мембраны, а пролин-богатые – на внутриклеточные мишени, нарушая репликацию и синтез белка в бактериальной клетке [11], хотя для некоторых отмечается и мембранолитический механизм действия. При этом АМП, имеющие структуру β-шпильки, являются наиболее активными и стабильными в физиологических условиях среди пептидов животного происхождения, однако их применение лимитируется наличием у большинства некоторой гемолитической активности. В свою очередь, пептиды, относящиеся к структурному классу пролин-богатых АМП, практически лишены токсичности для эукариотических клеток, но имеют менее широкий спектр действия. Активность многих из них ограничивается действием на грамотрицательные бактерии, хотя для ряда пролин-богатых пептидов описаны и эффекты в отношении грамположительных бактерий – к таким АМП относится, например, бактенецин ChBac3.4. Кроме антимикробных свойств для бактенецинов и PR39 описаны и другие виды биологической активности. Так, для бактенецина ChBac5 (20-43) и PR-39 показаны ранозаживляющие эффекты (в отношении неинфицированных кожных ран). PR-39 способен стимулировать ранозаживление и ангиогенез, проявляет хемоаттрактантные свойства, стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов, может регулировать продукцию различных цитокинов иммунными клетками, ингибировать апоптоз [12].

Цель исследования

Изучение возможности повышения антибактериальной активности синтетических аналогов природных пептидов и расширения ее спектра при совместном применении с конвенциональными антибиотиками, антисептиками и наночастицами серебра.

Получение данных о совместном действии является важным этапом разработки эффективного комбинированного антибактериального препарата на основе АМП.

Методы

Исследуемые вещества

Антимикробные пептиды

Пептиды для исследования были синтезированы методом твердофазного пептидного синтеза по Fmoc/tBu-стратегии в лаборатории дизайна и синтеза биологических активных пептидов ФГБНУ «ИЭМ». Их структуры приведены в Таблице 1.

Наночастицы серебра

В числе препаратов наносеребра исследовали:

НЧС-А1 и НЧС-А2 – наночастицы серебра, синтезированные с помощью солей серебра AgOOCCH₃ (НЧС-А1), AgNO₂ (НЧС-А2) и N-ацетил-L-цистеина в качестве стабилизирующего и восстанавливающего агента. Частицы имеют сферическую форму и средний диаметр около 20 нм. Синтезированы научной группой Вишневецкого Д.В., ТвГУ, Тверь.

НЧС-Б – наночастицы серебра, стабилизированные цеолитом β (содержание наночастиц серебра в матрице 5%). Цеолит β – синтетический цеолит; обычно имеет формулу (Na,K)₇[Al₇Si₅₇O₁₂₈]; обладает каталитической активностью в сочетании с термической стабильностью и высокой удельной поверхностью. Средний размер наночастиц серебра в матрице составляет 48 ± 10 нм: внутри пор и каналов цеолита серебро может стабилизироваться в виде кластеров разной нуклеации с размерами до 1 нм; во вторичных порах – частицы со средним размером 10–15 нм, а на поверхности – частицы с размерами 30–50 нм. Исходный цеолит характеризуется сферической формой кристаллов с размером частиц около 1 мкм. Синтезированы научной группой Голубевой О.Ю., Институт химии силикатов им. И.В. Гребенщикова, Санкт-Петербург.

Повиаргол – металлополимерная композиция, содержащая высокодисперсное металлическое серебро, стабилизированное поливинилпирролидоном (ФГУП «СКТБ «Технолог», Россия).

Антибиотики

В сочетаниях тестировали амикацин, гентамицин, эритромицин, офлоксацин, меропенем. Все порошки антибиотиков были приобретены у компании Sigma, США.

Антисептики

Среди антисептиков рассматривали пронтосан (Б.Браун, Германия), хлоргексидин (ООО «ЮжФарм,» Россия), кокамидопропилбетаин (кокобетаин) (Evonik Industries, Германия) и повидон-йод (бетадин) (ЗАО «Фармацевтический завод Эгис», Венгрия).

Бактериальные штаммы

В работе использовали антибиотикоустойчивые клинические изоляты бактерий Pseudomonas aeruginosa MDR 522/17, Staphylococcus aureus 1399/17 , Klebsiella pneumoniae ESBL 344/17, Acinetobacter baumannii 7226/16, E.coli ESBL 521/17, любезно предоставленные д.б.н. А.Г. Афиногеновой (Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера), профиль устойчивости которых сообщался ранее [8]. Escherichia coli ML-35p была передана профессором Р. Лерером (Калифорнийский университет Лос-Анджелеса, США). A. baumannii 16.63 (ВМА) (16) (мультирезистентная, карбапенемчувствительная) – сотрудниками отдела Молекулярной микробиологии ФГБНУ «ИЭМ». Мультирезистентные штаммы Klebsiella spp. 717 и A.baumannii 554, а также неохарактеризованные смешанные культуры микроорганизмов, полученные из раневого отделяемого пациентов, были предоставлены сотрудниками Военно-медицинской академии.

Бактерии выращивали на твердой среде, содержащей 3% триптический гидролизат сои (HiMedia, Индия). При культивировании Escherichia coli ML-35р в среду добавляли 100 мкг/мл ампициллина.

Антимикробный тест

Оценка антимикробной активности исследуемых препаратов проводилась по методу серийных разведений в жидкой питательной среде, содержащей микроорганизмы, описанному в [13]. Бактериальные суспензии, выращенные до логарифмической фазы роста в 2,1% бульоне Мюллера – Хинтон, разбавляли до 10⁶ КОЕ/мл, добавляли к серийно разведенным веществам в 0,01 М натрий-фосфатном буфере с 0,1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) и инкубировали в течение ночи при температуре 37 °C. Наименьшая концентрация, при которой отсутствовал видимый рост бактерий, считалась минимальной ингибирующей концентрацией (МИК). Приведенные МИК представляют собой медианные значения, полученные как минимум из 3 независимых экспериментов, проведенных в трех повторах.

Для оценки совместного микробоцидного действия исследуемых веществ проводили серийные разведения по методу "шахматной доски", также известному как перекрёстное титрование [14, 15]. Вещество (А) разводили по оси ординат, а вещество (В) – по оси абсцисс. В лунки микрокамеры Терасаки вносили по 2,5 мкл соответствующих разведений исследуемых веществ, в крайние лунки вместо второго вещества вносили аналогичный объём буфера. В итоге в каждой лунке микрокамеры получалась определенная комбинацию концентраций исследуемых веществ А и В. Затем в лунки вносили 5 мкл бактериальной суспензии в логарифмической фазе роста и инкубировали в термостате при 37 °С в течение 16–18 часов. Результаты фиксировали на следующий день путем визуального определения наличия или отсутствия роста микроорганизмов в соответствующих лунках. Характер совместного действия веществ А и В определяли по индексу фракционной ингибирующей концентрации (иФИК). Совместный эффект считали синергетическим, если иФИК ≤ 0,5; аддитивным, если 0,5 < иФИК ≤ 1; индифферентным (независимым), если 1 < иФИК ≤ 2 и антагонистическим, если иФИК > 2.

Гемолитический тест

Для оценки токсичности веществ использовали гемолитический тест [13]. Эритроциты выделяли из крови здоровых доноров центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут. Образцы для анализа содержали 2,5% эритроцитов и различные концентрации исследуемых веществ в фосфатно-солевом буфере (PBS). После 30-минутной инкубации при 37 °C образцы центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 4 минут, высвобожденный гемоглобин в супернатанте определяли путем измерения оптической плотности (ОП) при длине волны 540 нм. Процент гемолиза рассчитывали по формуле (ОП_{образца} – ОП_{0% лизис})/(ОП_{100% лизис} – ОП_{0% лизис}) × 100%, где 100% лизис относится к образцам, обработанным 1% раствором Тритона X-100, а 0% лизис - PBS. Проводили три независимых эксперимента, каждый из которых содержал по три опытных и контрольных проб. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение или ИК₅₀ – концентрация, при которой наблюдается лизис 50% эритроцитов.

Дизайн исследования

Характеристика антимикробного действия исследуемых пептидов и их комбинаций с другими антибиотическими соединениями на модели in vitro.

Условия проведения исследования

неприменимо

Критерии соответствия (отбора)

неприменимо

Описание критериев соответствия

неприменимо

Подбор участников в группы

неприменимо

Описание вмешательства

неприменимо

Исходы исследования

Основной исход исследования.

неприменимо

Дополнительные исходы исследования

неприменимо

Методы регистрации исходов

неприменимо

Анализ в подгруппах

неприменимо

Статистические процедуры

Запланированный размер выборки

неприменимо

Статистические методы

Для математической обработки результатов гемолитического теста использовано приложение Microsoft Excel пакета прикладных программ Microsoft Office 2010 (рассчитано среднее арифметическое и стандартное отклонение). Графики построены при помощи пакета программ GraphPad Prism 8.

Результаты

Формирование выборки

Неприменимо

Характеристики выборки

Неприменимо

Основные результаты исследования

Антимикробная активность в отношении монокультур бактерий

Активность пептидов, охарактеризованная в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий, включая антибиотикоустойчивые клинические изоляты, приведена в Таблице 2.

За исключением Shu-4 и ChBac5 (20-43) все тестировавшиеся пептиды показали выраженный противомикробный эффект в отношении монокультур мультирезистентных бактерий. Низкая активность C-концевого участка ChBac5 согласуется с предыдущими данными [16]; пептид интересен в первую очередь ранозаживляющими свойствами нативного ChBac5, способностью стимулировать пролиферацию фибробластов [17]. Потенциал Shu-4 против резистентных клинических изолятов оказался несколько ниже известных по литературе значений МИК (6,25–50 мкМ) в отношении лабораторных штаммов [9]. Поэтому, несмотря на данные о низкой гемолитической активности, в дальнейшем Shu-4 не рассматривался в составе сочетаний. Среднее геометрическое значение МИК, использованное в качестве суммарного показателя, демонстрирует, что наиболее высокую активность проявляют PG-1, PR-39 и, с небольшим отставанием, ChBac3.4. Наиболее активный пептид PG-1, относящийся к классу β-шпилечных, известен также сравнительно низкой селективностью к микробным клеткам в сравнении с клетками млекопитающих и наиболее выраженной гемолитичностью среди всех рассматривавшихся пептидов. Поэтому новые β-шпилечные пептиды цецилий MC и RC, не слишком уступающие ему в активности, но отличающиеся крайне слабым гемолитическим действием, также представляли большой интерес для составления антимикробных комбинаций. Эффективность PR-39, второго по активности в целом и первого из протестированных пролин-богатых АМП, в отношении грамположительной бактерии была значительно снижена, что в целом соответствует представлениям о типичном спектре действия пептидов данного класса. Напротив, для бактенецина ChBac3.4 и его структурных аналогов заметного снижения антимикробных свойств против стафилококка не обнаружено, даже для укороченной модификации RFR ChBac3.4 (1-14), не обладающей мембранолитическими свойствами [8].

Следующим этапом, после выявления перспективных АМП, было тестирование попарных комбинаций с другими антимикробными препаратами для определения среди них тех, что проявляют синергизм наиболее часто. Значительная часть работы в этом направлении уже была выполнена нами ранее. Так, было показано, что пептиды PG-1 и ChBac 3.4 проявляют синергизм антимикробного действия с наночастицами серебра, стабилизированными желатином. Для PG-1, СhBac3.4 и его укороченной модификации RFR ChBac3.4 (1-14) в отношении монокультур мультирезистентных клинических изолятов был продемонстрирован синергизм с рядом антибиотиков (аминогликозидами, макролидами, фторхинолонами) и антисептиков, среди которых наиболее частые случаи синергизма наблюдались пронтосаном, кокобетаином и препаратом коллоидного серебра повиарголом [8, 18-20]. В рамках настоящей статьи для составления общей картины и расширения пула молекул для формирования наиболее эффективных многосоставных комбинаций дополнительно охарактеризованы эффекты АМП в комбинации с НЧС, стабилизированными ацетилцистеином (НЧС-А1 и НЧС-А2) и цеолитом β (НЧС-Б); набор тестировавшихся антисептиков пополнен широко применяемыми хлоргексидином и бетадином (повидон-йодом). Кроме того, оценено совместное действие с антибиотиками не исследованных ранее в этом аспекте пептидов MC и RC, а также аналога бактенецина – RFR ChBac3.4-1-NH_2.

В таблице 3 приведены результаты оценки индивидуальной антимикробной активности используемых в работе НЧС, антибиотиков и антисептиков.

Можно отметить, что среди НЧС, варианты, стабилизированные ацетилцитсеином, показали наиболее выраженный антимикробный эффект. К тестировавшимся антибиотикам, как и ожидалось, изоляты показали высокий уровень устойчивости. Для антисептиков пронтосана и хлоргексидина некоторое снижение активности было заметно лишь в отношении A. baumannii, в особенности штамма 7226/16.

Совместное антимикробное действие с наночастицами серебра было охарактеризовано для наиболее активных АМП: PG-1, ChBac3.4 и PR-39 (Табл. 4).

Полученные результаты подтверждают наши и литературные данные о высокой частоте синергетического усиления активности в сочетаниях АМП с наночастицами серебра. Реже всего синергизм наблюдался в комбинациях с НЧС-Б, чаше всего – с повиарголом. Среди АМП несколько чаще синергизм наблюдался в сочетаниях с PR-39 (14 случаев против 10 для PG1 и ChBac3.4). Интересно, что для обоих пролин-богатых пептидов в отношении грамположительной бактерии синергетическое взаимодействие с наночастицами было более выраженным, чем для PG-1.

Поскольку антибиотики в настоящее время являются золотым стандартом противомикробной терапии, а резистентность к ним – важнейшей проблемой, рассмотрение взаимодействия АМП с антибиотиками, в частности возможности преодоления существующей устойчивости, было особой точкой интереса. Возможность синергизма АМП с антибиотиками широко освещена в литературе, и ранее нами отмечалась тенденция к тому, что наиболее часто синергетическое взаимодействие наблюдается в сочетаниях с антибиотиками, действующими на внутриклеточные мишени, в особенности на рибосомальный синтез белка [20].

Это наблюдение в полной мере подтвердилось в экспериментах с ещё не тестировавшимися в подобном контексте АМП MC, RC и RFR ChBac3.4-1-NH₂ (Табл. 5), где выявлен синергизм их совместного действия с макролидами и аминогликозидами.

Карбапенемустойчивые бактерии возглавляют список приоритетных патогенов Всемирной Организации Здравоохранения. Коллегами из ВМА нам был предоставлен ряд мультирезистентных штаммов Klebsiella spp. и A. baumannii, выделяющихся широким спектром устойчивости в сравнении с тестированными ранее, в частности высокой резистентностью к карбопенемам. В отношении этих штаммов нами была дополнена информация о сочетанном действии с антибиотиками пептидов PG-1, ChBac3.4 и RFR ChBac3.4 (1-14). Кроме того, тестирование проводили в сочетаниях с антисептиками, в частности наиболее широко применяемыми бетадином и хлоргексидином. Результаты представлены в Таблицах 6 и 7.

Среди штаммов Klebsiella spp. для рассмотрения совместной активности был выбран образец 717, устойчивый к наибольшему числу рассматривавшихся антибиотиков. Среди A. baumannii был выбран штамм 554, несколько более устойчивый к АМП.

Анализ совместного действия с антибиотиками укладывается в ранее описанные закономерности [8, 20]. Наибольшее число случаев синергизма наблюдается с макролидом эритромицином и фторхинолоном офлоксацином. Часто действие АМП заметно усиливается в присутствии антибиотиков, к которым у тестируемого штамма имеется выраженная резистентность, что можно трактовать как её частичное преодоление. Хотя, если говорить именно об устойчивости к карбапенемам, для меропенема подобные случаи единичны.

Интерес к взаимодействию АМП с антисептиками связан с тем, что не до конца решённые вопросы фармакокинетики делают наиболее доступной нишей для внедрения препаратов на основе АМП местную терапию, где антисептики широко применяются. Антисептики, как правило, реализуют микробоцидный эффект через менее специфические механизмы, чем антибиотики, за счёт чего менее подвержены угрозе развития к ним микробной резистентности. Однако большинство антисептиков проявляют немалую токсичность для клеток макроорганизма, поэтому их применение не всегда желательно в случае долго не заживающих ран или раневых дефектов большой площади. Возможность применения их в составе комбинированного препарата в сниженных концентрациях может поспособствовать повышению не только эффективности в отношении антибиотикорезистентных микроорганизмов, но и безопасности такого препарата для клеток человека.

Синергизм антимикробного действия с АМП у рассмотренных антисептиков проявлялся даже чаще, чем, у антибиотиков, в особенности у хлоргексидина и кокобетаина. Преимуществом хлоргексидина является его широкое медицинское применение, дешивизна и меньшая гемолитическая активность, чем у кокобетаина (Таблица 13), поэтому именно он далее тестировался в составе многокомпонентных комбинаций с АМП.

Стоит также отметить, что в случае сочетанного действия АМП с другим распространённым антисептиком бетадином (повидон-йодом) ранее высказывавшиеся нами опасения относительно возможного антогонизма АМП с антисептиками с анионной действующей компонентой [18] не оправдались. Согласно имеющимся данным о механизме действия повидон-йода, поливинилпирролидон может способствовать доставке и высвобождению активных форм йода непосредственно на мембране бактерий [21], что, вероятно, снижает риск помешать достижению катионными молекулам АМП поверхности бактериальной клетки. Свой вклад может вносить и то, что наиболее антимикробно активной формой является молекулярный йод, а в виде анионов находится лишь часть препарата.

Действие исследуемых препаратов на смешанные культуры микроорганизмов

При различных инфекционных процессах, включая раневые инфекции, абсцессы, а также инфекционные болезни органов дыхания и мочевыводящих путей, возникшая инфекция часто имеет полиэтиологическую природу, когда причиной заболевания становится несколько видов бактерий. Взаимодействие между микроорганизмами при этом может усиливать их патогенные свойства и способствовать развитию устойчивости к применяемым антимикробным средствам. Для эффективного лечения обычно требуется комбинированная антибиотикотерапия, которая охватывает широкий спектр возбудителей и учитывает особенности их чувствительности. Таким образом, активность против полибактериальных инфекций представляется значимым фактором для оценки при разработке новых препаратов.

Вначале мы провели оценку антимикробной активности самих исследуемых веществ в отношении трехкомпонентной культуры антибиотикорезистентных бактерий, исходно полученных из инфицированных ран пациентов стационаров: K. pneumoniae ESBL 521/17 (2.5 × 10⁸ КОЕ/мл) + S. aureus 1399/17 + (2.5 × 10⁸ КОЕ/мл) + P.aeruginosa MDR 522/17 (2,5 × 10⁸ КОЕ/мл) (Табл. 8).

Для многих соединений, проявлявших активность в отношении бактерий-компонентов по отдельности, (RC, MC, RFR ChBac3.4-1-NH₂, повиаргола, пронтосана) эффективные концентрации против трёхкомпонентной культуры не превышали наибольшего МИК против составляющих её штаммов в монокультуре. PG-1, ChBac3.4, хлоргексидин и препараты серебра НЧС-А1, НЧС-А2, НЧС-Б показали не более чем двукратное превышение этого значения, что в условиях серийных разведений находится в пределах погрешности. Хотя стоит заметить, что для RFR ChBac3.4 (1-14) и PR-39 падение антимикробной активности при сокультивации трёх бактерий оказалось боле существенным.

Комбинации, включающие 5 компонентов – два АМП, два антибиотика, антисептик

Далее против смешанной культуры бактерий тестировали эффекты в более сложных комбинациях, помимо пептида включающих антибиотики, антисептик хлоргексидин, антисептик и антибиотики одновременно, а также пролин-богатые АМП с описанными ранозаживляющими эффектами PR-39 и ChBac5 (20-43) (Табл. 9).

Добавление каждого дополнительного компонента, кроме не проявлявшего собственной антимикробной активности фрагмента ChBac5 (20-43), усиливало эффект комбинации. Возрастание активности при этом очевидно обеспечивается не только наиболее активными составляющими: АМП и хлоргексидином. Используя индивидуальные МИК, представленные в Таблице 8, можно рассчитать иФИК для многосоставных комбинаций по Таблице 9. Например, для сочетания, исходно включавшего 10 мкМ MC, по 50 мкМ амикацина и эритромицина и 100 мкг/мл хлоргексидина, при учёте того, что ингибирование роста бактерий наблюдается вплоть до разбавления в 128 раз, действующие концентрации в долях от индивидуальных МИК составляют для МС – 0,0195 (10/128 к 4 мкМ), для амикацина и эритромицина – менее 0,0039 (50/128 минимум к 100 мкМ), для хлоргексидина – 0,0976 (100/128 к 8 мкг/мл), что даёт суммарный иФИК менее 0,125. Интересно отметить, что добавление к PR-39, использовавшемуся в концентрации ниже МИК, комбинации амикацина и эритромицина, к которым бактерии также были в высокой степени устойчивы, снижало активную концентрацию пептида против трёхкомпонентной культуры до значения (30/128 = 0,23 мкМ), соответствовавшего его МИК против отдельных грамм-отрицательных штаммов (Таблица 2).

Смешанные культуры микроорганизмов, полученные из инфицированных ран

Также было исследовано совместное действие пептидов с антибиотиками и антисептиками в отношении смешанных культур микроорганизмов, полученных непосредственно в результате посева из раневого отделяемого пациентов с раневыми инфекциями. Определены минимальные ингибирующие концентрации для антибиотиков, антисептиков и АМП (Табл. 10), с помощью расчета фракционных ингибирующих концентраций определены эффекты совместного антимикробного действия пептидов и антибиотиков/антисептиков (Табл. 11).

Как видно из таблицы 10 бактерии в составе Культуры 2 устойчивы к пептидам, а также антибиотикам, в исследуемом диапазоне концентраций. Однако, при использовании пептидов в комбинации с антибиотиками, как и с антисептиками, наблюдались случаи выраженного синергизма.

C хлоргексидином по сравнению с другими антисептиками выявлено наибольшее количество случаев синергизма, поэтому именно его включили в состав многосоставных комбинаций. Пример эффектов пептидов в многосоставных комбинациях против культуры бактерий из раневого отделяемого представлен в таблице 12. Концентрации веществ в комбинациях соответствовали МИК в отношении каждой бактерии (Табл. 10), а в случаях, когда данные концентрации не были установлены в исследуемом диапазоне концентраций, за МИК принимали 16 мкМ для PG-1, 32 мкМ для ChBac3.4 и RFR ChBac3.4 (1-14), 62,5 мкМ для комбинации амикацин-эритромицин.

Все полученные значения меньше единицы, поэтому совместный эффект может оцениваться минимум как аддитивный. Таким образом, комбинации, состав которых подобран главным образом на основе общих статистических закономерностей проявления синергизма, оказываются достаточно эффективны против встречающихся в медицинской практике полибактериальных культур с заранее не исследованными компонентами.

Оценка безопасности препаратов для клеток человека исследуемых веществ

Гемолитическая активность веществ

Токсичность исследуемых образцов в отношении эукариотических клеток определяли при помощи гемолитического теста. В таблице 13 приведены концентрации, которые вызывают лизис 50% эритроцитов – ИК_50.

Совместное действие веществ на эритроциты человека

Как упоминалось и демонстрируется в таблице 13, среди тестировавшихся АМП только PG-1 обладает выраженным мембранолитическим эффектом как в отношении бактерий, так и в отношении эритроцитов. Исследованные наночастицы практически не проявляли гемолитических эффектов. Поэтому при рассмотрении комбинаций АМП с серебросодержащими препаратами внимание было уделено оценке эффекта добавления НЧС-А1, НЧС-А2 и НЧС-Б на гемолитическую активность именно PG-1 (Рис. 1). Случаев усиления гемолитического действия PG-1 не обнаружено; интересно, что в присутсвии НЧС-А1 наблюдалось даже выраженное снижение лизиса эритроцитов.

При комбинировании антибиотиков с пролин-богатыми пептидами гемолитическая активность практически не проявлялась. Гемолитическая активность комбинаций, включающих 5 компонентов – два АМП, два антибиотика, антисептик – дана в Таблице 14.

С учётом кратность разведения, при которой данные комбинации потенциально сохраняют антимикробный эффект против смешанных бактериальных культур (Таблица 9), можно заключить, что при комбинированном использовании имеется значительный концентрационный диапазон между целевым (противомикробным) и токсическим действием.

Дополнительные результаты исследования

Не имеется

Нежелательные явления

Не имеется

Обсуждение

Резюме результатов исследования

Выявлены наиболее частые синергетические эффекты для комбинаций пептидов PG-1, ChBac3.4 и PR-39 и НЧС-А1, НЧС-А2 и повиарголом; RC, MC, RFRChBac3.4-1-NH2 с антибиотиками амикацином, гентамицином и эритромицином; PG-1, ChBac3.4 и RFR ChBac3.4(1-14) с антисептиками амидопропилбетаином и хлоргексидином в отношении антибиотикоустойчивых бактерий. Показано, что антимикробная активность антимикробных пептидов с добавлением каждого компонента (антибиотик, антисептик, ранозаживляющий пептид) повышается в 2-4 раза, что приводит к значительному возрастанию антимикробной активности пептидов в многосоставных комбинациях. Также показана эффективность двойных и многосоставных комбинаций против смешанных культур микроорганизмов, полученных из раневого отделяемого пациентов. С использованием гемолитического теста продемонстрирована безопасность исследуемых комбинаций в концентрациях, существенно превышающих антимикробные.

Интерпретация результатов исследования

Известно, что в природе АМП часто действуют в сочетании друг с другом и с другими эффекторными компонентами иммунной системы. При этом совместное действие считают одной из причин затруднённой выработки резистентности к ним со стороны микроорганизмов. Так, например, в работе Panteleev et al, 2018 [22] описан синергетический эффект между природными кателицидинами ChMAP-28 (мембранолитический α-спиральный амфипатический пептид) и mini-ChBac7.5Nα (богатый пролином пептид). ChMAP-28 повреждает наружную мембрану бактерий, облегчая проникновение mini-ChBac7.5Nα, воздействующего на бактериальную рибосому. При длительном селективном давлении синергетическая комбинация сохраняет высокую активность против Escherichia coli, в отличие от используемого отдельно mini-ChBac7.5Nα и референсного антибиотика полимиксина B. Присутствие субингибирующих концентраций ChMAP-28 восстанавливает активность mini-ChBac7.5Nα в отношении этого штамма. Сочетанное применение с другими антимикробными агентами, таким образом, представляется естественным путём эффективного использования АМП в сфере практического здравоохранения.

Хотя работы, направленные на внедрение в медицину препаратов АМП в форме монотерапии, весьма многочислены, в большинстве случаев клинические исследования таких препаратов, к сожалению, не имели успеха. Так, пексиганан, аналог пептида магаинина, который был испытан в качестве крема для местного применения для лечения инфицированных язв стопы у больных диабетом, не показал более высокую эффективность по сравнению с существующими методами лечения. Исеганан, аналог пептида протегрина, который использовали в качестве раствора для обработки ротовой полости при оральном мукозите у онкологических больных, прошедших химиотерапию, не продемонстрировал значимой эффективности. Клинические испытания мурепавадина, синтетического циклического β-шпилечного пептидомиметика на основе протегрина 1, предназначенного для внутривенного введения при бактериальной пневмонии, были прекращены из-за повышения уровня сывороточного креатинина у пациентов, что свидетельствует об остром почечном повреждении [23].

В то же время многочисленные данные литературы, наши собственные ранние исследования и полученные в данной работе результаты свидетельствуют о высокой перспективности применения комбинированных препаратов, включающих антимикробные пептиды, антибиотики, наночастицы серебра и антисептики, для повышения эффективности антибактериальной терапии. Продемонстрирован высокий потенциал комбинаций не только против планктонных бактерий, но и формирующихся и сформированных биоплёнок [24].

В текущем исследовании дополнена информация о синергетическом взаимодействии АМП с наночастицами серебра. Выраженные случаи синергизма были зафиксированы как в случае β-шпилечного пептида PG-1, так и линейных пролин-богатых пептидов ChBac3.4 и PR-39 в комбинации с наночастицами серебра, стабилизированными ацетилцистеином, и с повиарголом. Ранее нами были описаны синергетические эффекты НЧС, стабилизированных ацетилцистеином, с другими β-шпилечными пептидами: с RС против A. baumannii 7226/16 (иФИК = 0.5) и c Shu-4 против E. coli ML-35p (иФИК = 0.28), а для PG-1  было показано усиление активности также в присутствии НЧС, стабилизированных олеатом натрия, в отношении P. aeruginosa 522/17 MDR (иФИК=0,5) [25]. Сообщалось, что комбинированное действие PG-1 с наночастицами серебра, стабилизированными желатином, носило синергетический характер против E. coli ML-35, MRSA ATCC 33591, M. luteus CIP A270, A. baumannii кл.из (иФИК = 0,38), однако ChBac3.4 в сочетании с такими наночастицами проявлял преимущественно аддитивный эффект [20]. Таким образом, в данной работе, в сравнении с предыдущими, продемонстрировано, что и пролин-богатые пептиды могут широко проявлять синергизм с препаратами серебра.

В вопросе взаимодействия с антисептиками, в настоящей работе установлены синергетические эффекты практически во всех случаях при использовании пептидов PG-1, ChBac3.4 и RFR ChBac3.4 (1-14) совместно с имеющим широкое применение хлоргексидином. В ряде случаев синергизм отмечен и в сочетании с другим популярным антисептиком бетадином (повидон-йодом), несмотря на потенциальное участие в реализации его свойств анионных форм йода.

Для новых β-шпилечных АМП — MC и RC, и синтетического аналога бактенецина RFRChBac3.4-1-NH₂ подтверждена тенденция к частому синергетическому действию с аминогликозидами и макролидами. Отдельно следует подчеркнуть, что наблюдалось многократное повышение антимикробной активности даже при комбинировании АМП с антибиотиками, к которым микроорганизмы демонстрировали низкую чувствительность. Этот факт подтверждает перспективность стратегии комбинированного применения АМП для преодоления микробной резистентности к традиционным антибиотикам.

Учитывая полибактериальную природу большинства инфекций, важным развитием предыдущих исследований в данной работе является проведённая комплексная оценка активности исследуемых веществ, в частности в сложносоставных сочетаниях, в отношении трёхкомпонентной культуры, полученной смешением антибиотикорезистентных бактериальных штаммов, выделенных из инфицированных ран пациентов стационаров. Продемонстрировано, что комбинирование каждого из антибиотиков или антисептиков с АМП синергично повышает антимикробную активность комбинации, а при использовании многокомпонентной смеси эффект многократно возрастает. Для подтверждения отсутствия антагонизма при его добавлении в состав многокомпонентной смеси, тестировался также малоактивный пептид ChВас5 (20-43), который применяли с учетом его ранозаживляющих свойств, определяющих перспективность использования пептида в качестве компонента ранозаживляющего антимикробного средства. Установлено, что при внесении ChВас5 (20-43) антимикробная активность сохраняется на уровне исходных значений практически во всех случаях.

Активность исследуемых комбинаций также подтверждена в отношении смешанных культур бактерий, выделенных из раневого отделяемого пациентов с инфекциями, плохо поддававшимися стандартной противомикробной терапии. Результаты показали, что комбинированные препараты обладают более высокой эффективностью по сравнению с отдельными компонентами, демонстрируя аддитивные и синергетические эффекты. При этом они проявляют антимикробную активность даже в случаях, когда отдельные вещества, входящие в состав комбинаций, не обнаруживают эффективного действия, что особенно заметно на примере культуры №2, устойчивой не только к антибиотикам, но и к применяемым концентрациям пептидов.

Показано, что АМП и антибиотики усиливают антимикробные эффекты друг друга, но не усиливают побочные цитотоксические эффекты в отношении нормальных клеток человека. В более сложных комбинациях, включающих АМП, антибиотики и антисептики, гемолитический эффект не превышал 20%, тогда как коммерческие антисептики вызывают 80-90% лизиса эритроцитов. При сочетании наночастиц серебра (НЧС-А1, НЧС-Б) с мембранолитическим пептидом PG-1 наблюдается снижение гемолитической активности пептида, что подтверждает перспективность таких комбинаций. Предположительно, это связано с образованием комплексов наночастиц с пептидом, учитывая, что поверхность частиц НЧС-А1 несет отрицательный заряд.

Таким образом, комбинированное применение пептидов PG-1, MC и RFR ChBac3.4 (1-14) с антибиотиками, хлоргексидином и ранозаживляющими пептидами способствует значительному усилению антимикробного действия, что позволяет снизить действующие концентрации препаратов и уменьшить токсические эффекты. Кроме того, воздействие на множественные мишени снижает риск развития резистентности, усложняя адаптацию микроорганизмов к комбинированной терапии.

Данные факторы подтверждают высокую перспективность использования таких сочетаний для борьбы с мультирезистентными патогенами. Учитывая присутствие в комбинации пептида с ранозаживляющей активностью, можно предположить хорошие перспективы внедрения этих препаратов в клиническую практику.

Ограничения исследования

Неприменимо

Заключение

Результаты работы подтверждают высокую перспективность комбинированного применения антимикробных пептидов, антибиотиков, наночастиц серебра и антисептиков для эффективного усиления антибактериальной активности. Синергетические взаимодействие компонентов в препаратах позволяет снижать дозировки и уменьшать токсичность препаратов. Комбинированные препараты демонстрируют эффективное действие против мультирезистентных смешанных бактериальных культур, трудно поддающихся стандартной терапии, и способствуют снижению риска развития резистентности благодаря множественному воздействию на различные мишени. Отсутствие усиления цитотоксических эффектов при комбинированном использовании подтверждает безопасность данных подходов. Всё это обосновывает целесообразность создания и внедрения в клиническую практику таких комбинированных препаратов на основе PG-1 и PR-39, MC и PR-39, RFR Bac 3.4 (1-14) и Bac 5 (20-43) для лечения трудноизлечимых бактериальных инфекций, а именно раневых инфекций.

 

 

 

Дополнительная информация

Вклад авторов

·         Владимирова Е.В. – проведение экспериментов, обработка и анализ полученных результатов, написание черновика рукописи;

·         Жаркова М.С. – проведение экспериментов, анализ полученных результатов, корректировка рукописи;

·         Комлев А.С. – проведение синтеза антимикробных пептидов;

·         Гончаров А.Е. – культивирование бактерий; 

          Серговенцев А.А. - обработка и анализ полученных результатов

·         Шамова О.В. – разработка концепции, интерпретация результатов, корректировка рукописи.

Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируют надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Благодарности*

Этическая экспертиза

Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (протокол № 1/20 от 27.02.2020). От всех добровольцев было получено письменное информированное согласие.

Согласие на публикацию

неприменимо

Источники финансирования

Исследование выполнено в рамках государственного задания ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» № 075-00397-25-00.

Раскрытие интересов

Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими организациями), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Заявление об оригинальности

При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным

Все данные, полученные в настоящем исследовании, доступны в статье.

Генеративный искусственный интеллект

При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование

Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре.

Дисклеймер*

 

 

Приложения

Информация об авторах

Владимирова Елизавета Васильевна; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6576-9844; eLibrary SPIN: 8068-4141; e-mail: vladymyrovaliza18@mail.ru	Elizaveta V. Vladimirova; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6576-9844; eLibrary SPIN: 8068-4141; e-mail: vladymyrovaliza18@mail.ru
Жаркова Мария Сергеевна, к.б.н.; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3352-8197; eLibrary SPIN: 3966-6347; e-mail: zharkova.ms@yandex.ru	Maria S. Zharkova, Cand. Sci. (Biology); ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3352-8197; eLibrary SPIN: 3966-6347; e-mail: zharkova.ms@yandex.ru
Комлев Алексей Сергеевич; https://orcid.org/0000-0001-9111-0755; eLibrary SPIN: 5921-6703; e-mail: komlev1420@yandex.ru	Aleksey S. Komlev; https://orcid.org/0000-0001-9111-0755; eLibrary SPIN: 5921-6703; e-mail: komlev1420@yandex.ru
Гончаров Артемий Евгеньевич д.м.н., https://orcid.org/0000-0002-5206-6656; eLibrary SPIN: 7909-5446; e-mail: phage1@yandex.ru	Artemy E. Goncharov Dr. Sci. (Medicine), https://orcid.org/0000-0002-5206-6656; eLibrary SPIN: 7909-5446; e-mail: phage1@yandex.ru
Серговенцев Александр Александрович https://orcid.org/0009-0003-6986-6072; eLibrary SPIN: 7519-4702; e-mail: 3hospital@mil.ru	Alexander A. Sergoventsev https://orcid.org/0009-0003-6986-6072; eLibrary SPIN: 7519-4702; e-mail: 3hospital@mil.ru
* Шамова Ольга Валерьевна, д.б.н., член-корреспондент РАН; (почтовый рабочий адрес с индексом); телефон: (номер городского телефона);  https://orcid.org/0000-0002-5168-2801; eLibrary SPIN: 2913-4726; e-mail: oshamova@yandex.ru	Olga V. Shamova, Dr. Sci. (Biology), Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences; https://orcid.org/0000-0002-5168-2801; eLibrary SPIN: 2913-4726; e-mail: oshamova@yandex.ru

 

 

 

Таблицы

Таблица 1. Структура антимикробных пептидов

Пептид	Аминокислотная последовательность
PG-1	RGGRLCYCRRRFCVCVGR-NH2
Shu-4	KAYSTPRCKGLFRALMCWL
MC	ACLRIRVCNRYYCYVFLRCF
RC	FCIRVRVCNHYFCFYALRCF
ChBac3.4	RFRLPFRRPPIRIHPPPFYPPFRRFL-NH2
RFR ChBac3.4 (1-14)	RFRRFRLPFRRP PIRIH-NH2
RFR ChBac3.4-1-NH2	RFRRFRLPFRRIHPPPFVRIHPPPFYRRFL-NH2
ChBac5 (20-43)	RPPVRPPFRPPFRPPFRPPIGPFP-NH2
PR-39	RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP-NH2

 

Таблица 2. Минимальные ингибирующие рост микроорганизмов концентрации АМП

Бактерия	Минимальная ингибирующая концентрация, мкМ
	PG-1	Shu-4	RС	MС	ChBac3.4	RFR ChBac 3.4 (1-14)	RFR ChBac 3.4-1-NH2	PR-39	ChBac5 (20-43)
A. baumannii 7226/16	0,5	4-8	2-4	2	0,5	8	8	0,25	32
E. coli ML-35p	0,12-0,25	16-32	2-4	2-4	1	1	4	0,25	˃128
P. aeruginosa 522/17 MDR	0,25-0,5	˃64	2-4	4	2	16	16	0,25	˃128
K. pneumoniae ESBL 344/17	0,25	˃64	2	2	4	8	4-8	0,12-0,25	˃128
S. aureus 1399/17	0,25	64	2	1-2	2-4	4	4-8	32	˃128
Сред. геом. МИК	0,29	>32,76	2,55	2,35	1,64	5,28	7,13	0,62	>97,01

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 3. Индивидуальные минимальные ингибирующие рост микроорганизмов концентрации исследуемых антимикробных агентов

Бактерия / образец	МИК против бактерий
	Грам (–)						Грам (+)
	E. coli ML-35p	K.pneumoniae ESBL 344/17	P. aeruginosa 522/17 MDR	A. baumannii 7226/16	A. baumannii 16.63 (ВМА) (16)	E.coli ESBL 521/17	S. aureus 1399/17
Препараты наночастиц серебра, мкг/мл
НЧС-А1	2,53	10,12	1,26	2,53	10,12	2,53	5,06
НЧС-А2	2,53	5,06	2,53	5,06	5,06	1,26	5,06
НЧС-Б	125	125	125	62,5	62,5	3,9	125
Повиаргол	31,25	31,25	31,25	15,6	15,6	7,8	62,5
Антибиотики, мкМ
Амикацин	0,5	0,5	1	50	>125	2	>125
Офлоксацин	0,062	0,125	>100	25	16	62,5	125
Эритромицин	100	125	>125	>100	>125	>125	>125
Меропенем	4	125	>100	>100	>32	0,08	>125
Гентамицин	0,625	0,125	4	1	>64	1	>125
Антисептики, мкг/мл
Пронтосан	0,5	2	4	32	0,25	0,5	1
Хлоргексидин	0,125	1	4	16	8	0,5	0,5

 

Таблица 4. Минимальные индексы фракционной ингибирующей рост микроорганизмов концентрации для сочетаний пептидов c исследуемыми наночастицами серебра

Бактерия	Минимальный индекс фракционной ингибирующей концентрации
	Вещество 1	Вещество 2
		PG-1	ChBac3.4	PR-39
E.coli ML-35p	НЧС-А1	0,5	0,62	0,56
	НЧС-А2	0,5	0,56	0,5
	НЧС-Б	0,38	1,25	0,75
	Повиаргол	0,38	0,75	0,5
K. pneumoniae ESBL 344/17	НЧС-А1	1	0,51	1,5
	НЧС-А2	0,5	1	0,75
	НЧС-Б	1	0,62	0,75
	Повиаргол	0,56	0,5	0,5
P. aeruginosa 522/17 MDR	НЧС-А1	0,5	0,52	0,38
	НЧС-А2	0,75	0,62	0,5
	НЧС-Б	0,62	0,75	0,75
	Повиаргол	0,75	0,5	0,31
A. baumannii 7226/16	НЧС-А1	0,38	0,5	0,5
	НЧС-А2	0,38	0,5	0,5
	НЧС-Б	1	0,5	0,19
	Повиаргол	0,38	0,38	0,38
S. aureus 1399/17	НЧС-А1	0,51	0,26	0,5
	НЧС-А2	0,75	0,31	0,19
	НЧС-Б	0,75	0,38	0,25
	Повиаргол	0,38	0,31	0,28

 

Таблица 5. Минимальные индексы фракционной ингибирующей рост микроорганизмов концентрации для сочетаний пептидов c антибиотиками

Бактерия	Вещество 1	Минимальный индекс фракционной ингибирующей концентрации
		Вещество 2
		Офлоксацин	Эритромицин	Меропенем	Гентамицин	Амикацин
A. baumannii 16.63 (ВМА) (16)	RС	0,75	1	1,12	0,62	1,12
E. coli ML-35p		1	0,56	1,12	0,38	0,75
A. baumannii 7226/16		0,62	1,12	1,12	0,62	0,56
P. aeruginosa 522/17 MDR		1,12	1,12	1,12	0,75	1,12
A. baumannii 16.63 (ВМА) (16)	MС	1,12	1,12	1,12	1,12	1,12
E. coli ML-35p		1	0,27	0,56	0,75	0,5
A. baumannii 7226/16		1	1,12	1,12	0,75	0,5
P. aeruginosa 522/17 MDR		1	0,5	1	≤0,56	1,12
E.coli ESBL 521/17	RFR ChBac3.4-1-NH2	0,75	0,5	0,51	1,12	1,12
A. baumannii 7226/16		0,56	0,75	1,12	0,38	0,62
K. pneumoniae ESBL 344/17		0,75	0,27	1,12	0,62	0,5
P.aeruginosa 522/17 MDR		0,75	0,31	0,51	0,31	1
S. aureus 1399/17		1	0,51	1,12	1,12	0,51

 

Таблица 6. Минимальные ингибирующие концентрации для антимикробных пептидов и антисептиков против карбапенемрезистентных штаммов микроорганизмов

Вещество	МИК в отношении бактерий (мкМ)
	Klebsiella spp. 748	Klebsiella spp. 717	Klebsiella spp. 688	A.baumannii 553	A.baumannii 554
	АМП и антибиотики (мкМ)
PG-1	2	0,5	1	1	2
ChBac3.4	16	8	4	1	2
RFR-ChBac3.4 (1-14)	64	16	32	2	2
эритромицин	>125	>125	>125	31,1	31,1
офлоксацин	>100	>100	>100	>100	>100
меропенем	>100	>100	>100	>100	>100
амикацин	25	>50	3,1	>50	>50
	Антисептики (мкг/мл)
пронтосан	1	1	0,5	1	2
кокобетаин	25 000	25 000	25 000	390,6	97,6
хлоргексидин	2	3,9	3,9	7,8	7,8
бетадин	1 562	390,6	781,2	390,6	781,2

 

Таблица 7. Минимальные индексы фракционной ингибирующей рост микроорганизмов концентрации для сочетаний пептидов c антисептиками

	Минимальные иФИК в отношении бактерий
	Klebsiella spp. 717			A.baumannii 554
АБ\АМП	PG-1	ChBac3.4	RFR ChBac3.4 (1-14)	PG-1	ChBac3.4	RFR ChBac3.4 (1-14)
офлоксацин	0,5	0,38	0,38	1	0,56	0,62
меропенем	1,12	0,38	1,12	1	0,56	0,62
амикацин	1	0,62	0,31	1,12	0,62	0,5
эритромицин	1	0,38	0,25	0,38	0,38	0,19
АС\АМП	PG-1	ChBac3.4	RFR ChBac3.4 (1-14)	PG-1	ChBac3.4	RFR ChBac3.4 (1-14)
хлоргексидин	0,5	0,62	0,38	0,5	0,31	0,38
бетадин	0,56	0,62	1,12	0,38	0,31	0,75
пронт	1,12	0,38	0,19	0,5	0,62	0,38
кокобетаин	0,5	1,12	0,25	0,38	0,31	0,5

 

Таблица 8. Минимальные ингибирующие концентрации исследуемых веществ против смешанной культуры бактерий P. aeruginosa 522/17 MDR+ S. aureus 1399/17 + K. pneumoniae ESBL 344/17

АМП, мкМ
PG-1	Shu-4	RС		MС	ChBac3.4		RFR Ch.Bac3.4 (1-14)	RFR ChBac3.4 -1-NH2		PR-39	ChBac5 (20-43)
0,5-1	˃64	4		4	8		32-64	16		128	˃128
Наночастицы серебра, мкг/мл
НЧС-А1			НЧС-А2			НЧС-Б			Повиаргол
20,25			10,12			250			62,5
Антисептики, мкг/мл						Антибиотики, мкМ
Пронтосан			Хлоргексидин			Амикацин			Эритромицин
0,78			8			>100			>100

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 9. Наибольшая кратность разведения антимикробной комбинации, до которой визуально наблюдается полное подавление роста смешанной культуры бактерий P. aeruginosa 522/17 MDR + S. aureus 1399/17 + K. pneumoniae ESBL 344/17

Пептид	Концентрация, мкМ	Индивидуальное действие	В составе комбинированного препарата, включающего:
			+ А&Э 50 мкМ	+ ХГ		+ А&Э 50 мкМ		ChBac5 (20-43) 30 мкМ + А&Э 50 мкМ		PR-39 30 мкМ + А&Э 50 мкМ
				50 мкг/ мл	100 мкг/ мл	+ ХГ 50 мкг/ мл	+ ХГ 100 мкг/ мл	+ ХГ 50 мкг/ мл	100 мкг/ мл	50 мкг/ мл	100 мкг/ мл
PG-1	3	2-4	16	32	64	64 -128	128	128-256	128-256	256-512	1024
	5	4-8	32	32	64	64	256	128	128	512-1024	1024
MC	10	1-2	2	32	32	64	128	128	128	256	512
	20	2-4	32	32	64	128	256	128	256	512	512
RFR ChBac 3.4 (1-14)	30	1	64	32	64-128	256	512	256-512	512-1024	-	-
PR-39	30	>1	128	64-128	128-256	128	512	-	-	-	-

А - амикацин, Э -эритромицин, ХГ – хлоргексидин.

 

 

Таблица 10. Антимикробная активность пептидов и антимикробных агентов против смешанных культур микроорганизмов, полученных из раневого отделяемого пациентов

Соединение	МИК против бактерий из раневого отделяемого
	Культура 1	Культура 2	Культура 3
	АМП и антибиотики (мкМ)
PG-1	0,125	>32	2
ChBac3.4	8	>64	0,5
RFR ChBac3.4 (1-14)	8	>64	1
Амикацин	>125	>125	7,8
Эритромицин	125	>125	125
Амикацин + эритромицин (А-Э)	>62,5	>62,5	7,8
	Антисептики (мкг/мл)
Повиаргол	125	250	15,62
Пронтосан	4	8	0,12
Хлоргексидин	1	4	4

 

Таблица 11. Минимальные индексы фракционной ингибирующей рост микроорганизмов концентрации для сочетаний пептидов c антибиотиками и антисептиками

Комбинация с	Раневое отделяемое	иФИК
		PG-1	ChBac 3.4	RFR ChBac 3.4 (1-14)
Амикацин и Эритромицин (А-Э)	№ 1	1,25	0,62	0,5
	№ 2	0,12	0,38	-
	№ 3	0,75	0,75	0,62
Повиаргол	№ 1	0,62	0,62	0,19
	№ 2	1,5	0,75	1,5
	№ 3	0,62	0,5	0,62
Пронтосан	№ 1	0,75	1	0,62
	№ 2	1,5	1	1
	№ 3	0,75	0,75	0,75
Хлоргексидин	№ 1	0,31	0,62	0,5
	№ 2	1,5	1,5	1,5
	№ 3	0,5	0,62	0,56

 

 

Таблица 12. Активность многокомпонентных комбинаций с антибиотиками и антисептиками в отношении смешанных культур бактерий, полученных из раневого отделяемого пациентов с раневыми инфекциями

Пептид или комбинация веществ	Комбинированные препараты, где каждое вещество взято в концентрации, равной МИК или в концентрации, указанной выше (когда МИК не получили) Приведены наибольшие разведения препаратов, ингибирующие рост бактерий
	Культура № 1	Культура № 2	Культура № 3
PG-1 + А-Э + ХГ	1/2	1/2	1/16
ChBac3.4 + А-Э + ХГ	1/2	1/2	1/8
RFR ChBac3.4 (1-14) + А-Э + ХГ	1/4	1/2	1/16

 

Таблица 13. ИК₅₀ исследуемых веществ в гемолитическом тесте

Вещество	ИК50, мкг/мл	Вещество	ИК50, мкМ
НЧС-А1	˃ 32,4	PG-1	7,2
НЧС-А2	˃ 32,4	ChBac3.4	˃100
НЧС-Б	˃5000	RFR ChBac3.4(1-14)	˃100
Повиаргол	2900	RFR ChBac3.4-1-NH2	˃100
Пронтосан	500	Shu-4	˃100
Хлоргексидин	260	RС	˃100
кокамидопропилбетаин	32	MС	˃100
повидон-йод	н/д	PR-39	˃100
-	-	ChBac5 (20-43)	˃100

 

Таблица 14. Гемолитическая активность многосоставных комбинаций

Комбинация	Концентрация	% гемолиза
PG-1 (3 мкМ) + PR-39 (30 мкМ) + Хлоргексидин (50 мкг/мл) + Амикацин (50 мкМ) + Эритромицин (50  мкМ)	х1	17,9±2,7
	х1/2	14,6±2,4
MC (10 мкМ)  + PR-39 (30 мкМ) + Хлогесидин (50 мкг/мл) + Амикацин (50  мкМ)  + Эритромицин (50  мкМ)	х1	10,6±1,9
	х1/2	7,5±0,3
RFR Bac 3.4(1-14) (30 мкМ) + Bac 5(20-43) (30 мкМ)  + хлогексидин (50 мкг/мл) + Амикакцин (50 мкМ)  + Эритромицин (50 мкМ)	х1	7,0±1,5
	х1/2	7,8±0,5

 

 

Рисунки

 

Рисунок 1. Совместная гемолитическая активность в соотношениях концентраций, характерных для синергетического эффекта А) PG-1 и НЧС-А1, НЧС-А2; Б) PG-1 и НЧС-Б

About the authors

Elizaveta V. Vladimirova

Institute of Experimental Medicine

Email: vladymyrovaliza18@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6576-9844

Researcher at the Laboratory of Design and Synthesis of Biologically Active Peptides

Russian Federation, St. Petersburg

Maria S. Zharkova

Institute of Experimental Medicine

Email: manyvel@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3352-8197
SPIN-code: 3966-6347

Cand. Sci. (Biology), Head of the Laboratory of Anticancer Peptide Drugs of the Department of General Pathology and Pathophysiology

Russian Federation, Saint Petersburg

Aleksey S. Komlev

Institute of Experimental Medicine

Email: komlev1420@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9111-0755

Researcher at the Laboratory of Design and Synthesis of Biologically Active Peptides

Russian Federation, St. Petersburg

Artemiy E. Goncharov

Институт экспериментальной медицины

Email: phage1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5206-6656

Alexander A. Sergoventsev

Main Military Medical Directorate of the Russian Defense Ministry

Email: 3hospital@mil.ru
ORCID iD: 0009-0003-6986-6072

заслуженный врач РФ, кандидат медицинских наук, генерал-майор медицинской службы

Russian Federation

Olga Shamova

Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg

Author for correspondence.
Email: oshamova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5168-2801

Associate Professor, Dr. Sci. (Biol.), Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Head of the Department of General Pathology and Pathological Physiology

Russian Federation

References