Dicationic open-channel blockers of glutamate receptors: clinical prospects (a review)

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

L-глутамат, основной возбуждающий нейропередатчик центральной нервной системы, действует на два основных класса рецепторов: ионотропные (iGluR) и метаботропные, связанные с G-белком (mGluR). В физиологических условиях активация подмножеств этих рецепторов приводит к возбуждающей синаптической передаче и процессам, связанным с синаптической пластичностью, таким как долговременная потенциация и долговременная депрессия, которые лежат в основе парадигмы обучения и памяти [1]. После связывания глутамата ионотропные глутаматные рецепторы опосредуют быструю возбуждающую нейропередачу, что приводит к потоку катионов Na⁺ и K⁺ через плазматическую мембрану и генерации потенциала действия. После проявления своего эффекта глутамат затем удаляется из синаптической щели транспортёрами возбуждающих аминокислот, чтобы прекратить синаптическую передачу и обеспечить последующие потенциалы действия [2].

Известны три группы iGluR, классифицированные по аффинности их специфических агонистов: N-метил-D-аспартатные рецепторы (NMDAR), рецепторы α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (AMPAR) и каинатные (каиновой кислоты) рецепторы [3]. NMDAR обладают более высокой проницаемостью для катионов, особенно Ca²⁺. В состоянии покоя канал NMDAR блокируется Mg²⁺. Активация AMPAR и деполяризация мембраны устраняют опосредованное Mg²⁺-ингибирование NMDAR-канала за счёт снижения сродства к сайту связывания [4].

AMPAR представляют собой тетрамерные комплексы, образованные комбинацией четырёх субъединиц GluA (GluA1–4) гомомерным или гетеромерным образом [5]. В физиологических условиях ген GluA2 подвергается редактированию РНК, в результате которого кодон глутамина преобразуется в кодон аргинина в положении 607 в поре канала. Этот процесс катализируется аденозиндезаминазой, действующей на РНК2, что приводит к образованию GluA2-содержащих AMPAR, непроницаемых для Ca²⁺ [6].

Избыточная активация как NMDAR, так и AMPAR играет существенную роль в механизмах нейродегенерации [7], сопровождающей многие острые и хронические заболевания (ишемия мозга, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона) и возникновение судорожных состояний (эпилепсия). Участие глутаматергических структур в патологии нервной системы вызывает интерес к поиску антагонистов, способных избирательно блокировать разные подтипы глутаматных рецепторов.

Синтезированы и исследованы многочисленные неконкурентные антагонисты NMDA-рецепторов, относящиеся к классу блокаторов открытых каналов [8]. Некоторые высокоактивные антагонисты глутамата этого типа (например, дизоцилпин) прошли предклинические исследования. Однако большинству этих соединений присущи существенные недостатки: при использовании доз, близких к терапевтическим, возникают нежелательные побочные эффекты, выражающиеся в поведенческих и двигательных нарушениях [9]. Многие NMDA-антагонисты глутамата обладают ограниченной избирательностью, например способны блокировать не только NMDA, но и никотиновые рецепторы [10].

Недостаточная избирательность NMDA-блокаторов и возникновение побочных эффектов ограничивают их практическое использование. Тем не менее неконкурентный блокатор NMDAR мемантин сочетает терапевтические свойства с относительно приемлемой переносимостью и предложен для лечения когнитивных расстройств [11].

К настоящему времени показана ведущая роль глутамата в развитии нейродегенеративных изменений нейронов мозга и глиальных клеток при таких патологических состояниях, как инсульт [12], травматические повреждения головного или спинного мозга [13], рассеянный склероз [14], болезнь Альцгеймера (БА) [15] боковой амиотрофический склероз [16], болезнь Паркинсона [17], болезнь Гентингтона [18], аутизм [19], глаукомная оптиконейропатия [20], эпилепсия [21], невропатическая боль [22], депрессия [23], злоупотребление наркотиками [24].

Антагонисты NMDA-рецепторов могут, кроме того, быть полезными при лечении рака головного мозга. Быстро растущие глиомы головного мозга способны убивать соседние нейроны, секретируя глутамат и чрезмерно активируя NMDAR, так что умирающие нейроны освобождают место для растущей опухоли и могут высвобождать клеточные компоненты, которые стимулируют рост опухоли. Исследования показывают, что антагонисты NMDAR [25] и AMPAR [26] могут снижать скорость роста опухоли как in vitro, так и in vivo.

Наш предыдущий обзор был посвящён фундаментальному исследованию структуры и функции ионных каналов, управляемых ацетилхолином и глутаматом [27]. Были выявлены органические катионы, способные их блокировать. Определена топография участков открытого ионного канала, где происходит связывание органических катионов, разработаны принципы дизайна молекул каналоблокаторов с предсказуемой активностью и избирательностью действия.

В данном обзоре упор сделан на те области глутаматной рецепции, которые наиболее значимы в плане оценки клинических перспектив исследуемых соединений. Успех исследований в значительной мере зависит от правильного выбора биологической мишени, на которую воздействуют молекулы потенциального лекарства.

Универсальным и непременным звеном любой патологии является эксайтотоксичность, и этому вопросу посвящена вторая часть обзора. Задача в том, как воспрепятствовать эксайтотоксичности. Один из путей — через модуляцию передачи глутаматных сигналов через NMDA- и AMPA-рецепторы (третья часть), причём AMPAR как терапевтическая мишень представляется более продуктивным (четвёртая часть). Затем решается принципиально важный вопрос — выбор мишени для лиганда: либо активный центр, на который воздействует медиатор (конкурентный блок), либо ионный канал, открываемый глутаматом (неконкурентный блок). Выбор делается в пользу второго варианта.

Далее делается ещё один выбор, касающийся мишени — либо блок рецептора по аллостерическому типу (перампанел и др.), либо блок открытого ионного канала по принципу «пробка в бутылке». Выбирается второй вариант как более избирательный для коррекции патологических влияний, поскольку блокирование открытого канала увеличивается вместе с частотой стимуляции, а также при повышении концентрации глутамата, то есть именно то, что имеет место в патологических процессах. Теоретический анализ завершается пятой частью, посвящённой комбинированным (NMDA + AMPA) глутаматным антагонистам как новому классу перспективных лечебных средств. Далее в обзоре приводятся конкретные примеры, в которых реализована логика, изложенная в предыдущих частях обзора.

ГЛУТАМАТНАЯ ЭКСАЙТОТОКСИЧНОСТЬ КАК ОБЩЕЕ ЗВЕНО НЕРВНЫХ И ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Эксайтотоксичность классически определяется как повреждение нейронов, вызванное чрезмерным высвобождением глутамата и последующей гиперактивацией возбуждающих рецепторов плазматической мембраны. Концентрации внеклеточного глутамата достигают чрезмерно высоких уровней при инсульте [12] и при повреждениях спинного или головного мозга [28]. Ишемический инсульт может вызвать быстрое увеличение концентрации глутамата и чрезмерную активацию NMDAR, что приводит к быстрой перегрузке Ca²⁺ в нейронных клетках и острой эксайтотоксичности в течение нескольких часов и дней [12].

С другой стороны, умеренное повышение активности NMDAR, обычно наблюдаемое в моделях животных и пациентов с БА, не является немедленно цитотоксическим. Устойчивая гиперактивность NMDAR и дисрегуляция Ca²⁺, продолжающиеся от месяцев до лет тем не менее могут быть патогенными для медленно развивающихся явлений, то есть дегенеративной эксайтотоксичности при развитии БА. При БА медленно прогрессирующее накопление внеклеточного глутамата является результатом выброса глутамата, стимулируемого β-амилоидом из нейронов и глиальных клеток [29]. Таким образом, ишемический инсульт и БА имеют общий патогенетический механизм, опосредованный NMDAR и Ca²⁺, который обеспечивает общую мишень для рецепторов для профилактической терапии [30].

Повышенное содержание глутамата также было обнаружено в спинномозговой жидкости пациентов с боковым амиотрофическим склерозом, что может быть обусловлено снижением поглощения глутамата нейронами и глиальными клетками [31]. Астроциты и активированные иммунные клетки являются потенциальными источниками наблюдаемого повышенного содержания глутамата при острых поражениях в случае рассеянного склероза [32].

На мышиной модели болезни Паркинсона концентрации глутамата в чёрной субстанции были значительно увеличены [33]. Возможно, более значимым для заболевания, по крайней мере на моделях паркинсонической дискинезии на животных, является сдвиг в субклеточном распределении рецепторов NMDA в сторону внесинаптических участков [34]. Такое перераспределение NMDAR из синаптических во внесинаптические места лучше всего документировано при болезни Хантингтона [35].

Белое вещество мозга человека составляет около половины его объёма [36], и большинство клеток белого вещества составляют олигодендроциты, которые миелинизируют аксоны и при этом очень уязвимы при гиперактивации глутаматных рецепторов [37]. Олигодендроглиальная эксайтотоксичность вовлечена в патогенез демиелинизирующих заболеваний [38], которые характеризуются разрушением миелина, воспалением и гибелью олигодендроцитов [39]. AMPAR в олигодендроцитах лишены субъединицы GluA2, что делает их проницаемыми для Ca²⁺ и высоко восприимчивыми к эксайтотоксичности [40]. Ишемические инсульты могут индуцировать быструю олигодендроглиальную гибель [41].

Драматичным заболеванием, связанным с гипоксией/ишемией, является церебральный паралич, при котором чаще всего поражается перивентрикулярное белое вещество. Кроме того, выброс глутамата из пораженных клеток и аксонов при травматических и аноксических поражениях в ЦНС также может значительно повредить популяцию олигодендроглии [42].

Рассеянный склероз характеризуется очаговыми поражениями с воспалением, демиелинизацией и гибелью олигодендроглии, что приводит к неадекватной нервной проводимости и появлению неврологического дефицита. Неврологические симптомы при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (модель рассеянного склероза) облегчаются антагонистами AMPAR [38, 43, 44].

Эксайтотоксичность трактуется как общее звено не только нервных, но и инфекционных болезней. Даже в нейродегенеративных состояниях, вызванных инфекциями простейшими паразитами Plasmodium falciparum или Toxoplasma gondii, были выявлены повышенные концентрации глутамата в спинномозговой жидкости, что, как полагают, является основной причиной повреждения головного мозга, связанного с церебральной малярией и токсоплазмозом [45, 46]. Эксайтотоксичность глутамата участвует в индукции паралича у мышей после заражения человеческим коронавирусом с точечной мутацией в его шиповидном белке. При этом ингибирование эксайтотоксичности глутамата с помощью AMPA-антагониста (GYKI-52466) улучшило клинические показатели, связанные с моторными нарушениями и параличом у вирус-инфицированных мышей, а также защищали ЦНС от нейронных дисфункций [46].

Установлено, что вызванная вирусами гибель спинномозговых мотонейронов связана эксайтотоксичностью глутамата. Нейроадаптированный вирус Синдбиса, являющийся прототипом семейства альфа-вирусов, представляет собой нейротропный вирус, способный вызывать гибель спинномозговых моторных нейронов у мышей и крыс, а также паралич задних конечностей или смерть [47]. Эксайтотоксический механизм был подтверждён, когда установили, что блокаторы Са-проницаемых AMPAR CNQX и GYKI-52466 препятствуют гибели моторных нейронов как in vitro, так и in vivo [48].

Сходные результаты были получены в другом исследовании [49], где также было показано, что опосредованная глутаматом эксайтотоксичность является основной причиной гибели нейронов во время энцефаломиелита, вызванной нейротропным вирусом. В моторных нейронах спинного мозга присутствуют Ca²⁺-проницаемые АМРАR [50]. Хотя эти нейроны также имеют NMDAR, только антагонист AMPAR GYKI-52466 защищал двигательные нейроны спинного мозга от повреждения и предотвращал вызванную вирусом Синдбис гибель мышей [49].

В настоящее время ВИЧ инфицировано более 33 млн человек. Среди них у ~ 60% развиваются нейрокогнитивные расстройства, связанные с ВИЧ. У пациентов с ВИЧ наблюдаются повреждения миелина и белого вещества. Рецепторы глутамата являются потенциальной терапевтической мишенью для повреждения белого вещества мозга у пациентов с ВИЧ, поскольку антагонисты рецепторов глутамата (MK-801 и CNQX), как показано в опытах на животных, способны частично или полностью обратить вспять пагубные эффекты [51].

NMDAR важны для физиологических процессов, в частности для обучения и памяти [5]. Первоначальное объяснение двойственной роли глутамата заключалось в том, что чрезмерная активация NMDAR убивает нейроны [52], тогда как слабая или умеренная стимуляция вызывает физиологическую пластичность [53].

Открытие дифференциальной передачи сигналов синаптическими и экстрасинаптическими NMDAR предоставило новую и биологически более правдоподобную концептуальную основу для объяснения двойственной роли глутамата [54, 55]. В свете этого нового взгляда на эксайтотоксичность экстрасинаптические NMDAR трактуются как сходящаяся точка на пути к смерти, которая разделяется этиологически различными нейродегенеративными заболеваниями.

Гипотеза локализации утверждает, что последствия активации NMDAR строго зависят от локализации. Если NMDAR имеют синаптическую или экстрасинаптическую локализацию, будут задействованы пути про-выживания (pro-survival) или про-смерти (pro-survival) соответственно [56]. Избирательная активация синаптических NMDAR способствует индукции генов выживания и подавлению генов, связанных со смертью, в то время как активация внесинаптических NMDAR способствует противоположному эффекту [54].

Другой гипотезой, объясняющей активацию NMDAR, является гипотеза состава субъединиц, согласно которой NMDAR, содержащие GluN2B, обладают эксайтотоксичностью, тогда как NMDAR, содержащие GluN2A, оказывают нейропротекторное действие [57]. GluN2A обычно связан с каскадами про-выживания, тогда как GluN2B — с механизмами про-смерти [58]. Токсичность подтипа GluN2B была подтверждена на мышиной модели с нокаутом, где С-концевые домены Glu2NA и GluN2B поменяли местами [59].

Сравнительный анализ цитозольных переходных процессов с кальцием показал, что сигналы кальция, инициируемые внесинаптическими NMDAR, вызывают быструю потерю потенциала митохондриальной мембраны, тогда как сигналы, запускаемые синаптическими NMDAR, совсем не повреждают митохондрии [60]. Это различие коррелирует с динамикой митохондриального кальция: внесинаптические NMDAR вызывают устойчивый рост митохондриального кальция, тогда как рост кальция в ответ на активацию синаптических NMDAR является временным из-за быстрого процесса клиренса кальция, опосредованного в основном Na/Ca/Li-обменником [61].

В доклинических моделях было показано, что специфические антагонисты (ифенпродил, Ro25-6981) могут ингибировать внесинаптическую, а не синаптическую активность NMDAR, демонстрируя улучшение поведенческой функции и восстановление дендритного повреждения после инсульта [62]. Напротив, NVP, антагонист GluN2A, вызывает нарушение синаптической пластичности in vivo и in vitro и блокирует защитные эффекты NMDAR [63].

Другие исследования, однако, показали, что селективное ингибирование внесинаптического NR2B может по-прежнему противодействовать синаптическому NR2A из-за того факта, что локализация изолированных субъединиц, содержащих NMDAR, в синапсе и вне синапса не является абсолютной, и было обнаружено, что GluN2A и GluN2B присутствуют в синапсе [64]. Некоторые данные свидетельствуют, что синаптические и экстрасинаптические NMDAR имеют одинаковую чувствительность к ифенпродилу [65]. В целом, эффективность исследований, изображающих двойную идентичность NMDAR, всё ещё обсуждается, и появляется всё больше доказательств того, что ингибирование экстрасинаптической NMDAR может быть необходимым, но недостаточным условием нейропротекторной терапии.

Популяции нейронов, экспрессирующих Ca²⁺-проницаемые AMPAR (CP-AMPAR), также склонны к эксайтотоксичности [5]. Введение 1-нафтилацетилспермина, блокатора CP-AMPAR, выявило значительный нейропротекторный эффект при постишемическом повреждении нейронов гиппокампа СА1 [66].

Теория эксайтотоксичности основывается на избыточном высвобождении глутамата, приводящем к гипервозбуждению нейронов и их повреждению. Недавно предложена альтернативная гипотеза, суть которой в том, что эксайтотоксичность при развитии острого поражения является следствием распространяющейся деполяризации (spreading depolarization, SD), которая сама по себе является причиной последующего повреждения нейронов [67]. Ишемия истощает пул аденозинтрифосфата, что приводит к отказу насоса Na⁺/K⁺ и создаёт фронт клеточной деполяризации, который распространяется со скоростью 1–9 мм/мин через ишемизированное серое вещество мозга. Полагают, что SD, возможно, вызвана открытием ещё не идентифицированного канала, который обычно неактивен в здоровом, неишемизированном сером веществе [68]. Распространение SD было полностью заблокировано антагонистами NMDAR, но не антагонистами AMPAR как in vivo, так и in vitro [69].

В целом, блокаторы глутаматных рецепторов представляют интерес как потенциальные лечебные средства широкого спектра действия, поскольку как нервные, так и инфекционные болезни имеют общее патологическое звено — эксайтотоксичность, которому они противодействуют.

СТРАТЕГИЯ ПОИСКА ПЕРСПЕКТИВНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ БЛОКАТОРОВ

У рецепторов есть два наиболее доступных для воздействия ингибиторами участка. Первый — это узнающий центр, где ингибитору приходится вступать в конкуренцию с ионами глутамата за обладание этим центром. Здесь прямая конкуренция: чем выше концентрация глутамата, тем выше должна быть концентрация конкурентного антагониста. Другой участок — ионный канал рецептора, где имеет место неконкурентное действие. Ингибиторы входят в уже открытый канал, подобно проникающим ионам, и связываются с определёнными сайтами на его стенках, что приводит к блокаде проводимости через этот канал.

В терапевтических дозах конкурентные антагонисты подавляют нормальную физиологическую активность глутаматергических систем сильнее, чем патологическую, поэтому конкурентные антагонисты мало перспективны в качестве средств лечения нейродегенеративных заболеваний. В частности, защитные функции конкурентных антагонистов NMDAR, таких как D-2-амино-5-фосфонопентаноат (AP5) или 3-(2-карбоксипиперазин-4-ил)пропил-l-фосфонат (CPP), могут быть ослаблены высокими концентрациями синаптического и экстрасинаптического глутамата во время эпилептических припадков, тогда как неконкурентные антагонисты, такие как дизоцилпин (МК-801) и кетамин, не имеют таких ограничений [21, 70]. Исследование на животных показало, что неконкурентный антагонист MK-801 превосходит конкурентный антагонист CPP в прекращении экспериментального эпилептического статуса [71].

Блокада каналов ионотропных глутаматных рецепторов, в особенности открытого состояния этих каналов, стратегически более правильна, поскольку ингибитор не воздействует на покоящийся канал, но существенно снижает суммарный глутамат-вызванный ионный ток с самого начала его генерации. Следовательно, поиск нужно вести среди неконкурентных блокаторов, в частности блокаторов открытого канала ионотропных глутаматных рецепторов. Тем не менее пока только один лекарственный препарат, обладающий таким механизмом действия — блокатор глутаматных рецепторов NMDA-типа мемантин, — нашёл применение в клинической практике, преимущественно при лечении БА [9].

Синтезированы и опубликованы структуры сотен блокаторов NMDAR, но все они не удовлетворяют в полной мере требованиям клиники. Меллор, автор обширного обзора по глутаматным блокаторам, отмечает, что удивительно мало клинически доступных лекарств, нацеленных на ионотропные глутаматные рецепторы, учитывая их распространённость в ЦНС и участие во многих важных процессах [72]. В то же время именно их многофункциональность создаёт проблемы, связанные с побочными эффектами, что делает эту область исследований лекарств особенно сложной.

Вплоть до настоящего времени задача решается в значительной мере методом бессистемного поиска. Реальный выход таких работ крайне мал по сравнению с затратами. Основной причиной этой ситуации являются существующие пробелы в понимании фундаментальных связей между структурой блокатора и механизмом его воздействия на канал-мишень и между действием блокатора на канал и его эффектом в сложных физиологических системах.

Нами разработана и применяется стратегия рационального поиска перспективных антагонистов глутамата, основанная на фундаментальном подходе к проблеме [27, 73, 74]. Поиск комплексный и включает как непременное условие получение детального знания о молекулярном строении мишени, то есть структуре канала. Это делает правомочной трактовку результатов исследования связи между строением синтезируемых блокаторов и их активностью. Как правило, требуется синтезировать гомологические серии новых соединений и применять адекватные методы их тестирования. Следующий этап — сопоставление результатов тестирования наиболее интересных соединений в опытах на нескольких моделях патологических состояний нервной системы экспериментальных животных, поскольку ни одна модель не воспроизводит полностью заболевания человека.

Опыты, проведённые на рекомбинантных глутаматных рецепторах, экспрессированных в ооцитах X. laevis и на изолированных нейронах мозга крысы, выявили органические катионы, способные блокировать открытые каналы NMDAR и АМРАR [75, 76]. Создана библиотека, содержащая около 100 соединений, которые синтезированы в отделе нейрофармакологии Института экспериментальной медицины и исследованы в лаборатории биофизики синаптических процессов Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова. Анализ связи между строением и действием блокаторов показал, что NMDA-каналы блокируются как моно-, так и дикатионными соединениями, в то время как АМРА-каналы можно эффективно блокировать только дикатионными соединениями определённой длины. В результате был создан новый класс веществ, способных избирательно блокировать ионные каналы подтипа АМРАR (Са-проницаемых), а главное, разработаны принципы дизайна молекул каналоблокаторов с предсказуемой активностью и избирательностью действия [10, 27, 73, 74].

На основе экспериментальных данных с помощью методов молекулярной механики были созданы модели каналов NMDAR и АМРАR [77]. Модели способствовали существенному уточнению наших представлений о строении каналов глутаматных рецепторов, выявили особенности строения каналов NMDA- и АМРА-подтипов и, соответственно, помогли сформулировать требования к структуре блокаторов. Это взаимозависимый процесс — дизайн и последующий синтез потенциального инструмента исследования или лекарства, здесь исследователи опираются на знание о структуре мишени. В свою очередь, результаты экспериментального исследования связи между строением и действием гомологических серий синтезированных соединений обогащают существующие представления о молекулярном строении мишени.

Были проведены исследования механизмов действия блокаторов на каналы NMDAR и АМРАR. Выявлены структурные детерминанты феномена «ловушки» молекул блокатора в канале NMDAR. Показано, что блокаторы АМРА-каналов способны ускользать из «ловушки» путём проникновения в цитоплазму, когда канал находится в закрытом состоянии [78]. Это позволило уточнить положение ворот в структуре канала. Сделан вывод, что особенности молекулярных механизмов блокады в значительной степени определяют действие фармакологических препаратов в физиологических и патологических условиях.

В частности, в условиях синаптической активации сочетание механизма ловушки с возможностью прохождения блокатора внутрь клетки должно приводить к зависимости действия блокатора от частоты стимуляции синапса. Частотная зависимость действия может оказаться очень полезным свойством для практического использования блокаторов каналов АМРАR. При невысокой частоте синаптической активности, которая в нормальных условиях чаще имеет место, блокада выражена слабо. А при высокочастотной активации, которая наблюдается в эпилептоформных процессах, действие блокатора усиливается.

Непосредственным продолжением поиска и детального изучения механизма действия каналоблокаторов стали исследования их способности предупреждать развитие патологического проявления повышенной активности глутаматергических систем в опытах на экспериментальных животных. Работа велась на нескольких моделях судорожного синдрома, вызываемого разными методами: внутрижелудочковым введением в мозг мышей агонистов глутамата (NMDA или каината) [79–81], однократным или хроническим введением коразола [82], действием никотина [79], ареколина [83]; на модели атаксии, вызываемой у крыс галоперидолом [80, 84]; в опытах на линейных крысах, генетически предрасположенных к развитию судорожного синдрома в ответ на звуковое воздействие [85]; в опытах на мышах, подвергаемых действию углового ускорения [86].

В результате были выявлены новые блокаторы NMDAR, превосходящие мемантин по эффективности и отсутствию проявлений побочного действия, а также впервые синтезированы два новых класса глутаматных блокаторов: 1) избирательные блокаторы Са-проницаемых открытых каналов АМРАR, в частности, ИЭМ-1460; 2) комбинированные (NMDA + AMPA) глутаматные блокаторы, в частности, ИЭМ-1913, сочетающие высокую эффективность с низкой токсичностью и значительной широтой терапевтического эффекта. Поиск избирательных NMDAR и AMPAR дикатионной структуры имел два идейных источника. Первый — полиаминный (яды ос и пауков) [87], второй — результат скрининга в ряду диметониевых соединений с общей формулой Me₃N⁺–(CH₂)_n–N⁺Me₃ [88]. Наши поиски глутаматных блокаторов основывались на втором из этих источников [27] и были связаны с поиском избирательных блокаторов симпатических и парасимпатических ганглиев путём варьирования состава двух катионных групп дикатионной молекулы и длины метиленовой цепочки, соединяющей эти группы. Этот же подход послужил методической основой для синтеза NMDA- и AMPA-глутаматных блокаторов дикатионной структуры, содержащих радикалы адамантана и 1-фенилциклогексила в составе катионных групп [27]. В частности, был синтезирован новый глутаматный блокатор ИЭМ-1460 [73, 89], который вошёл в мировые каталоги (Tocris и др.) под шифром IEM-1460 с формулировкой: «Селективный блокатор открытых каналов АМРАR, который блокирует Са-проницаемые рецепторы мозга, лишённые GluR2-субъединицы, более эффективно, чем содержащие GluR2-субъединицу (значения IC50 составляют 2,6 и 1102 мкМ соответственно). Противосудорожное средство in vivo» (позже термин «GluR2» заменили на «GluA2») (рис. 1).

Рис. 1. Химическая структура глутаматного блокатора ИЭМ-1460.

Fig. 1. Chemical structure of the glutamate blocker IEM-1460.

Полиаминные блокаторы, входящие в состав природных токсинов ос и пауков, представляют собой алифатические полиметиленовые цепочки, включающие в себя три атома азота или более, разделённых тремя или четырьмя метиленовыми группами. Наиболее известным их представителем является филантотоксин, PhTX-343 [87] (рис. 2).

Рис. 2. Химическая структура филантотоксина PhTX-343.

Fig. 2. Chemical structure of philanthotoxin PhTX-343.

Было синтезировано большое число полиаминных аналогов всевозможной структуры и с различной степенью NMDA- и AMPA-избирательности, включая аналоги с фрагментом адамантана [90], но в практическую медицину они не попали вследствие неприемлемых побочных эффектов, что отчасти может быть связано с чрезмерно высоким сродством к рецептору.

Мы в наших исследованиях взяли за основу не полиаминный, а диаминный принцип, сократив число атомов азота в составе полиметиленовой цепи от четырёх до двух. Этим достигались две основных цели. Во-первых, существенно облегчался анализ связи структуры и активности. Оказалось, что максимум активности дикатионных блокаторов лежит в области пента- и гексаметиленовых структур, что позволяло сузить границы поиска, а варьирование лишь одной из двух катионных групп облегчало анализ связи структуры и активности [27]. Во-вторых, дикатионные блокаторы проявили быструю кинетику, что потенциально должно способствовать уменьшению уровня побочных эффектов, большей широте терапевтического эффекта, «терапевтического окна». Например, широта терапевтического эффекта монокатионного NMDA-блокатора мемантина лежит в диапазоне от 2 до 7, тогда как его дикатионного аналога — комбинированного (NMDA + AMPA) блокатора ИЭМ-1913 — в диапазоне 1600–6430. При этом наблюдается рост эффективности лекарства: величина ЕД50 в тесте судорог, вызванных введением пентразола (pentylenetetrazol, PTZ), составляет для мемантина 10 мг/кг, а для ИЭМ-1913 — 0,03 мг/кг. Сходная зависимость наблюдается при сравнении мемантина с другими дикатионами — ИЭМ-2121, ИЭМ-2127, ИЭМ-2062.

AMPA-РЕЦЕПТОРЫ КАК ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ МИШЕНИ

Разработка антагонистов рецептора AMPA первоначально была вызвана интересом к этим агентам как к нейропротекторным альтернативам антагонистам рецептора NMDA [91]. Были идентифицированы и исследованы два типа глутаматных AMPA-блокаторов: конкурентные и неконкурентные AMPA-антагонисты. Конкурентные AMPA-антагонисты проявляют свое блокирующее действие, конкурируя за связывание агониста в сайте узнавания глутамата. Их прототипом был хиноксалиндион NBQX. Блокаторы этого класса обладали нейропротективным действием в широком диапазоне животных моделей острого повреждения головного мозга [92]. Однако у хиноксалиндионов были серьёзные фармацевтические проблемы, которые препятствовали клиническому развитию, включая плохую растворимость и склонность к преципитации в почках.

Первым поколением неконкурентных AMPAR-антагонистов были производные 2,3-бензодиазепина, которые обладали лучшими фармацевтическими свойствами по сравнению с аналогами хиноксалиндиона [93]. Эти соединения действуют посредством отрицательной модуляции путём связывания с аллостерическим сайтом и обладают преимуществом сохранения хорошей эффективности независимо от уровня глутамата. Первым ингибитором этого класса соединений был 1-(4'-аминофенил)-4-метил-7,8-метилендиокси-5Н-2,3-бензодиазепин (GYKI 52466).

Доклинические исследования выявили ряд потенциальных терапевтических возможностей антагонистов AMPAR, и были получены положительные клинические данные при мигрени и невропатической боли, а также против симптомов бокового амиотрофического склероза [94]. Наиболее интенсивно AMPA-антагонисты исследовались как потенциальные антиэпилептики.

Эпилепсия — это повторение неспровоцированных припадков, вызванных ненормальным, высокосинхронным возбуждением нейронов в ограниченной области или полушарии головного мозга или распространённым на весь мозг. Антагонисты AMPAR подавляют приступы в широком спектре доклинических моделей, и за последнее десятилетие был впервые одобрен антагонист AMPAR перампанел для лечения различных форм эпилепсии [95].

Гиперактивация глутаматных рецепторов (эксайтотоксичность) вносит вклад в нейродегенерацию как при острых состояниях, таких как инсульт, так и при хронических нейродегенеративных состояниях, таких как боковой амиотрофический склероз. Тем не менее терапевтические исследования, которые в основном были направлены на глутаматные каналы NMDA-типа с высокой проницаемостью для Ca²⁺, до настоящего времени не смогли продемонстрировать впечатляющую эффективность. В то время как большинство глутаматных каналов AMPA-типа являются непроницаемыми для Ca²⁺, все больше доказательств подтверждают, что проницаемые для Ca²⁺ каналы AMPA могут быть решающими факторами, способствующими травме в этих условиях [96]. Эти каналы преимущественно экспрессируются в отдельных нейронных субпопуляциях, и их количество повышено при боковом амиотрофическом склерозе и инсульте. Кроме того, в отличие от каналов NMDA, каналы AMPA, проницаемые для Ca²⁺, не блокируются Mg²⁺, но обладают высокой проницаемостью для другого потенциально вредного эндогенного катиона — Zn²⁺ [97].

В то время как относительно мало проницаемых для Ca²⁺ каналов AMPA обычно присутствует в пирамидных нейронах гиппокампа, число этих каналов может резко возрастать после ишемии. Увеличение числа Ca²⁺ проницаемых AMPA-каналов способствует замедленной нейродегенерации [98]. Напротив, двигательные нейроны, которые избирательно поражаются при боковом амиотрофическом склерозе, обычно обладают значительным количеством проницаемых для Ca²⁺ каналов AMPA, число которых ещё больше увеличивается в ходе болезни.

Другой способ, которым проницаемые для Са²⁺ каналы AMPA могут опосредовать повреждение, заключается в том, чтобы служить путями входа для двухвалентного катиона Zn²⁺, который совместно с глутаматом выделяется в определённых возбуждающих синапсах. Zn²⁺ накапливается в пирамидных нейронах гиппокампа при ишемии и эпилепсии, состояниях, при которых хелаторы Zn²⁺ являются нейрозащитными [99].

Каналы AMPA, проницаемые для Ca²⁺, обладают высокой проницаемостью для Zn²⁺ и, таким образом, могут быть основным путём для входа в синапс Zn²⁺ [100, 101]. Как и в случае с Ca²⁺, Zn²⁺ вызывает повреждение с помощью ряда механизмов, включая индукцию фермента, выработку активных форм кислорода и активацию поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP) [102]. Zn²⁺ является гораздо более мощным средством нарушения митохондриальной функции по сравнению с Ca²⁺, что повышает вероятность того, что митохондриальные эффекты вносят значительный вклад в дегенерацию, вызванную сильным внутриклеточным накоплением Zn²⁺ [99–101]. Присутствие блокатора Са-проницаемых каналов AMPA рецептора 1-нафтилацетилспермина или внеклеточного хелатора Zn²⁺ EDTA существенно уменьшало накопление Zn²⁺ в пирамидных нейронах [101, 102].

После многолетних интенсивных исследований NMDAR в области синаптической и нейрональной эксайтотоксичности выявилось несколько веских причин для переключения внимания с NMDAR на AMPAR, особенно на Са-проницаемые AMPAR (CP AMPAR) [66, 94, 103].

1. В то время как антагонисты NMDAR ингибируют формы синаптической пластичности, лежащие в основе обучения и памяти, антагонисты AMPAR не ухудшают синаптическую пластичность и не препятствуют формированию или восстановлению памяти [95].
2. Потенциально полезная особенность AMPA-блокаторов открытых каналов заключается в том, что этот тип антагониста зависит от активности, будучи наиболее эффективным, когда AMPAR очень активны из-за повышенного уровня агониста [94]. Частотная зависимость действия может оказаться очень полезным свойством для практического использования блокаторов каналов АМРАR.
3. В отличие от NMDAR, которые обычно неактивны при мембранном потенциале покоя из-за блокады канала Mg²⁺, CP-AMPAR не блокируются внеклеточными катионами и обеспечивают доступ Ca²⁺ при любом уровне активации рецептора. Количество CP-AMPAR значительно увеличивается при болезненных состояниях, и они проницаемы для Zn²⁺, что может вызвать митохондриальную дисфункцию и гибель клеток [104].
4. В ряде случаев решающий вклад в лечебный эффект вносят именно AMPA-блокаторы. Например, у зрелых мышей популяции нейронов, наиболее восприимчивых к инфекции, находятся в гиппокампе и переднем роге спинного мозга. Инфекция гиппокампа приводит к длительному дефициту памяти у мышей, которые выживают, в то время как инфекция двигательных нейронов ведёт к параличу и смерти. Антагонист NMDAR МК-801 защищал нейроны гиппокампа, но не двигательные нейроны, мыши были парализованы и умирали. Антагонисты AMPAR талAMPAнел и GYKI-52466 защищали как гиппокампальные, так и моторные нейроны и предотвращали паралич и смерть [49]. То есть только блокада AMPAR предотвращала повреждение моторных нейронов спинного мозга и защищала мышей от паралича и смерти из-за инфекции. Как видно, фатальный исход заболевания в основном связан с инфекцией двигательных нейронов, а не нейронов гиппокампа [45, 46].
5. Антагонисты NMDA эффективны в фокальных моделях ишемии, но малоэффективны в глобальных моделях ишемии, где AMPA-антагонисты более эффективны [105]. В животных моделях церебральной ишемии антагонисты рецептора NMDA эффективны против ишемического повреждения только при введении до или вскоре после ишемического инсульта [106]. Однако антагонист AMPAR NBQX эффективен в уменьшении ишемического повреждения у крыс, подвергшихся глобальной ишемии, даже при введении через несколько часов после ишемического инсульта [107].

Было продемонстрировано в исследованиях in vivo, что AMPAR, а не NMDAR, вовлечены в отсроченную ишемическую гибель нейронов [108, 109]. Полагают, что активация AMPA-рецепторов может быть критически вовлечена в позднюю патофизиологическую стадию глутамат-индуцированного повреждения нейронов, что позволяет проводить фармакологическое вмешательство в то время, когда блокада рецепторов NMDA становится менее эффективной [105].

Нацеливание на AMPA-передачу может быть многообещающей стратегией преодоления рефрактерности и фармакорезистентности к бензодиазепинам при эпилептическом статусе [110]. В модели пилокарпин-индуцированной эпилепсии, резистентной к диазепаму, неконкурентные антагонисты AMPA перампанел и GYKI52466 были эффективны для купирования приступов [21, 95, 111].

Представляет интерес нейрозащитный потенциал антагонизма AMPA при черепно-мозговой травме. В модели на крысах AMPA-блокатор перампанел уменьшал отёк мозга и объём ушиба, уменьшал апоптоз и окислительный стресс, а также предотвращал неврологические последствия за счёт противовоспалительной активности [112]. AMPA-антагонист перампанел является препаратом, потенциально эффективным для противодействия ишемическому повреждению [113]. Антагонисты AMPAR могут иметь важные преимущества, потому что в отличие от антагонистов NMDA они проявляют мощную противосудорожную активность без сопутствующего поведения, подобного NMDA-блокатору фенциклидину [114].

Фармакологические особенности антагонистов AMPAR у киндлинговых крыс говорят об их потенциале в лечении парциальных припадков. В срезах латеральной миндалины у людей с некупируемой височной эпилепсией блокада AMPAR, но не NMDAR, отменяла спонтанную межприступную активность, что указывает на роль AMPAR в аномальной активности электрической сети эпилептического мозга [115].

AMPA-блокатор перампанел сокращает продолжительность послеразряда при повышенной интенсивности стимуляции в модели киндлинга миндалины, в то время как такие антиэпилептики, как леветирацетам, лакосамид, ламотриджин и карбамазепин, не показали этого эффекта [116]. Перампанел, но не антагонист NMDAR амантадин, замедлял развитие спонтанных рецидивирующих припадков при пилокарпин-индуцированном эпилептическом статусе, а также уменьшал вызванные им поздние поведенческие последствия [117].

Определённый интерес представляет избирательный GluA1 AMPA-глутаматный блокатор ИЭМ-1460, который, в отличие от перампанела, не блокирует рецепторы GluA2 и поэтому лишён связанных с этим побочных эффектов. ИЭМ-1460 проявил свойства как NMDA, так и AMPA позитивного модулятора. Он является прямым агонистом GluA2 AMPAR на пирамидах [118], а также усиливает возбуждающий постсинаптический потенциал в пирамидах вследствие блокирования GluA1 AMPAR в интернейронах, подобно природному полиаминному агонисту спермину [73, 119, 120].

Таким образом, имеет место двойное облегчающее влияние как спермина, так и ИЭМ-1460 на передачу в пирамидах — блок AMPAR в интернейронах и прямая активация AMPAR и NMDAR пирамид. Это важно в формировании длительной потенциации, а следовательно, в улучшении памяти и обучения под действием ИЭМ-1460 и спермина, что получило экспериментальное подтверждение [121].

Опыты на целом животном подтвердили свойства ИЭМ-1460 как полиаминного агониста [122]. В экспериментах на интактных крысах и мышах установлено, что как природный агонист полиаминового участка связывания спермин, так и ИЭМ-1460 усиливают анальгезию и судороги, вызванные NMDA, и устраняют анальгезию, вызванную никотином и каинатом. Аркаин, конкурентный полиаминовый антагонист, в одной и той же дозе устраняет как активирующие, так и блокирующие эффекты спермина и ИЭМ-1460. Полагают, что ИЭМ-1460, подобно спермину, является агонистом полиаминового участка связывания NMDA, АМРА и никотинового рецепторов [122].

На модели tail-flick у крыс было показано, что сочетание стимуляции полиаминного сайта NMDAR и блокады АМРАR, вызванное системным введением ИЭМ-1460, потенцирует анальгезирующее действие очень малых доз анальгина и фентанила [1/120–1/150 минимальной эффективной дозы (МЭД)] до уровня максимальных эффектов, вызываемых МЭД анальгина и фентанила при самостоятельном применении. Этот потенцирующий эффект ИЭМ-1460 полностью снимается полиаминным антагонистом аркаином. Комбинированное внутримышечное введение фентанила с ИЭМ-1460 и спермином в пороговых дозах уменьшает МЭД фентанила в составе комбинации с ИЭМ-1460 в 150 раз, а в составе комбинации со спермином — в 15 раз [123]. В связи с этим возникает перспектива уменьшения клинически используемых доз фентанила, анальгина и других анальгетиков при комбинированном введении с GluA1 AMPA-блокаторами типа ИЭМ-1460.

В работе [124] сообщается об уникальном сочетании в одной молекуле ИЭМ-1460 трёх эффектов (GluA1 AMPA-блокирующего, н-холинблокирующего и GluA2-стимулирующего действия), что позволяет говорить о высоком нейрозащитном потенциале данного препарата. ИЭМ-1460 существенно улучшает когнитивную функцию [176, 121], устраняет дискинезию, вызванную леводопой [125, 126], устраняет МК- и фенциклидин-вызванную токсичность на соответствующих моделях шизофрении [127], предложен для лечения хронической воспалительной боли [128], гиперальгезии, диабетической невропатической боли [129–131], эпилепсии [132, 133], аддикции [124, 134], для предотвращения вызванной шумом улитковой синаптопатии, что актуально для военнослужащих, позволяя защитить слух от шумового повреждения при сохранении способности слышать нужные команды [135].

Широкий ассортимент нейрозащитных свойств блокаторов открытых ионных каналов AMPAR, продемонстрированный на примере ИЭМ-1460, стимулирует дальнейший поиск селективных GluA1 AMPA-блокаторов, более активных и избирательных, чем эталонный ИЭМ-1460, который производит неполный (~ 60–80%) блок даже при относительно высоких концентрациях (10 или 100 мкМ) [136].

В отделе нейрофармакологии Института экспериментальной медицины был получен ряд новых AMPA-блокаторов, более высокоактивных и избирательных, чем ИЭМ-1460. Наибольшую AMPA-активность и избирательность проявил ИЭМ-2131, который на порядок активнее ИЭМ-1460 по AMPA-блокирующей активности (концентрация, вызывающая 50% ингибирующий эффект на ионных каналах глутаматных рецепторов — ИК50; 0,29 и 3 мкм соответственно) и в 5 раз — по AMPA-избирательности (101 и 500 раз соответственно) [137] (рис. 3). Обнаружение антиаддиктивных свойств у GluA1 AMPA-блокаторов типа ИЭМ-1460 открывает новое направление при поиске новых лечебных средств в области наркологии и других болезней ЦНС [124].

Рис. 3. Химическая структура ИЭМ-2131.

Fig. 3. Chemical structure of IEM-2131.

КОМБИНИРОВАННЫЕ (NMDA + AMPA) ГЛУТАМАТНЫЕ АНТАГОНИСТЫ КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ЛЕЧЕБНЫЕ СРЕДСТВА

Комбинации антагонистов NMDAR и AMPAR могут обеспечивать более эффективное терапевтическое действие, чем введение отдельных антагонистов, что представляет особый клинический интерес. Исследования, проведённые K. Lippert и соавт. [105, 138], продемонстрировали сверхаддитивный эффект комбинированного лечения NMDA-блокатором дизоцилпином (МК-801) и AMPA-блокатором NBQX в культуре нейронов гиппокампа крыс, подвергшихся глутамат-индуцированному повреждению. Одновременное введение дизоцилпина и NBQX также оказывало выраженное нейропротекторное действие in vivo у мышей, перенёсших очаговую ишемию головного мозга, и у крыс с глобальной ишемией переднего мозга. Это предполагает, что такая комбинация может иметь терапевтическое значение.

Обработка антагонистом AMPAR тезAMPAнелом (LY293558) крыс, подвергшихся воздействию боевого отравляющего вещества нервнопаралитического действия зомана, прекращает эпилептический статус с ограниченным повторением приступов, значительно защищает от повреждения мозга и предотвращает долгосрочные поведенческие дефициты, даже если LY293558 вводится через 1 ч после воздействия. Более благоприятные эффекты и полная нейрозащита достигаются, когда введение LY293558 сочетается с NMDA-блокатором карамифеном. Авторы предлагают комбинированную терапию тезAMPAнел + карамифен для использования на людях [139].

Одновременное введение NMDA-антагониста мемантина и AMPA-антагониста NBQX приводит к синергетическому увеличению противосудорожной активности [140]. Как полагают авторы, комбинации антагонистов NMDAR и AMPAR или разработка препарата, действующего на оба типа ионотропных глутаматных рецепторов, могут быть новой стратегией лечения лимбических судорог.

Комбинированная блокада AMPAR и NMDAR низкими (неэффективными) дозами антагонистов, нацеленных на каждый тип рецепторов, облегчает леводопа-вызванную дискинезию как у крыс, так и у приматов [141], что позволяет предположить, что слабая, но одновременная блокада этих типов рецепторов глутамата может представлять собой жизнеспособный вариант для уменьшения дискинезий [142].

Конкурентные антагонисты AMPAR CNQX и NBQX ингибировали двигательную активность крыс. Напротив, конкурентный антагонист NMDAR CGP-37849 индуцировал двигательную гиперактивность, которая снижалась под действием CNQX и NBQX. Следовательно, как полагают авторы, двигательная гиперактивность, свойственная NMDA-блокаторам, будет подавляться при использовании комбинированных (NMDA + AMPA) блокаторов [143].

Нарушение миелинизации ЦНС является основным признаком многих состояний, от ишемии и церебрального паралича у младенцев до инсульта и рассеянного склероза у взрослых [144]. Блокирование только AMPAR или только NMDAR во время ишемии не сохраняло потенциалы аксонов в миелинизированном зрительном нерве [145], и только комбинированный блок AMPAR и NMDAR соответствующими антагонистами (NBQX + MK-801) эффективно защищал от последствий ишемического инсульта [146].

В работе Y. Hokama и соавт. [147] установлено, что максимальный потенциал нейропротекции после травмы спинного мозга может быть достигнут при использовании одновременного блока NMDAR и AMPAR соответствующими антагонистами (MK-801 + NBQX).

Чтобы оценить вклад обоих типов рецепторов глутамата в патогенез изменений моторного ответа, связанных с дофаминергической терапией, F. Bibbiani и соавт. [141] изучали способность селективного антагониста рецептора AMPA GYKI-47261 и селективных антагонистов рецептора NMDA MK-801 и амантадина смягчать эти эффекты на моделях болезни Паркинсона на грызунах и приматах. Эффекты GYKI-47261 и амантадина (или MK-801) по отдельности и в комбинации сравнивали по их способности изменять дискинезии, вызванные леводопой. У крыс одновременное введение подпороговых доз антагонистов рецепторов AMPA и NMDA полностью снимало дискинезию, вызванную длительным лечением леводопой. У приматов антагонисты глутамата GYKI-47261 и амантадин, вводимые совместно в низких (пороговых) дозах, снижали дискинезии, вызванные леводопой, на 51%. Таким образом, одновременная блокада рецепторов AMPA и NMDA обеспечивает значительно большее снижение изменений ответа, вызванных леводопой, чем ингибирование одного из этих рецепторов [141].

Результаты предполагают, что механизмы, опосредованные обоими ионотропными рецепторами глутамата, вносят независимый вклад в патогенез этих изменений моторной реакции. Кроме того, комбинация NMDA- и AMPA-блокаторов может облегчить эти осложнения при более низких и, следовательно, более безопасных дозах блокаторов. Действительно, комбинированные (NMDA + AMPA) глутаматные антагонисты проявили себя как эффективные антиэпилептики с высоким терапевтическим индексом.

В исследовании T. Hanada [148] комбинированное введение неэффективной дозы антагониста AMPAR NBQX и NMDA-антагониста глицинового сайта L-701,324 вызывало значительное увеличение порога электростимуляции, необходимого для индукции судорог, тогда как ни один из препаратов не проявлял никаких противосудорожных эффектов при введении отдельно, что указывает на синергетическое взаимодействие.

Наиболее впечатляющий нейропротекторный синергизм наблюдался при совместном применении AMPA-блокатора GYKI-52466 с NMDA-блокатором MK-801 [149]. Выживаемость ишемизированных срезов гиппокампа при таком комбинированном лечении была значительно выше, чем у срезов, обработанных одним из соединений. При сочетании самых высоких концентраций этих антагонистов нейропротекторный эффект был сравним с эффектом, полученным при удалении внеклеточного кальция, что указывает на то, что эксайтотоксический эффект чрезмерной стимуляции рецепторов глутамата может быть объяснён исключительно притоком кальция. Интересно, что этот эффект был получен при совместном применении двух неконкурентных антагонистов. Неконкурентные антагонисты, связываясь с сайтом, отличным от сайта связывания эндогенного лиганда, имеют то преимущество, что они относительно неуязвимы для подавляющей концентрации внеклеточного глутамата, вызванной ишемическими состояниями.

Было также показано, что блокаторы NMDAR усиливают защитные эффекты антагонистов AMPAR, и в свою очередь антагонисты AMPAR усиливают антиконвульсивное действие антагонистов NMDAR [92]. Таким образом, одновременная блокада глутамат-опосредованного возбуждения по более чем одному подтипу ионотропных рецепторов приводит к выраженному противосудорожному эффекту, причём без дальнейшего усиления неблагоприятных эффектов. Авторы полагают, что комбинация антагонистов AMPAR и NMDAR может лечь в основу новой стратегии лечения эпилептических припадков [92, 150, 151].

Возможная альтернатива комбинациям лекарств — создание молекул, которые могут поражать несколько мишеней; они известны как многоцелевые лиганды (multi-target-directed ligands, MTDL) [152]. MTDL привлекают всё большее внимание сообщества разработчиков лекарств. Стратегия воздействия на два или более белков с помощью одного соединения может обеспечить терапевтический эффект, превосходящий эффекты селективного лекарственного средства [153]. Комбинированные (NMDA + AMPA) глутаматные антагонисты, воздействующие одновременно на две мишени, являются по сути MTDL-лигандами.

MTDL имеют ряд потенциальных преимуществ по сравнению с коктейлями или многокомпонентными препаратами. К ним относятся следующие: (1) снижение неопределённости в клинической разработке, поскольку предсказать фармакокинетику отдельного соединения намного проще, чем для коктейля лекарств; (2) улучшенная эффективность благодаря синергетическому эффекту одновременного ингибирования нескольких мишеней; (3) повышенная безопасность за счёт уменьшения побочных эффектов, связанных с нагрузкой коктейля лекарств, с уменьшенным риском взаимодействия лекарств друг с другом; (4) упрощённый терапевтический режим [152].

Монокатионные NMDA-блокаторы типа мемантина ингибировали NMDAR in vitro и соответственно предупреждали вызываемые NMDA судороги in vivo, но были лишены способности ингибировать АМРАR и предупреждать каинатные судороги. Мы синтезировали дикатионные глутаматные блокаторы открытых каналов, способные одновременно ингибировать как NMDA, так и AMPA глутаматные рецепторы. Синтезированные нами дикатионные комбинированные (NMDA + AMPA) глутаматные блокаторы, такие как ИЭМ-1754, ИЭМ-1925, ИЭМ-2062, ИЭМ-1913, ингибируя как NMDAR, так и АМРАR, высокоэффективно предупреждали каинатные судороги и превосходили соответствующие монокатионы по способности предупреждать судороги, вызванные NMDA [81]. Их противосудорожная активность превышает активность эталонного блокатора NMDAR мемантина, при этом они практически лишены побочного действия, свойственного избирательным NMDA-антагонистам.

В ряде предклинических исследований в опытах на крысах нами было показано, что комбинированная блокада AMPAR и NMDAR мозга устраняет клонические и клонико-тонические коразоловые судороги без развития атаксии [154], устраняет острые каинатные судороги и хроническую каинатную летальность [155], максимально эффективно подавляет развитие коразолового киндлинга [156] и уменьшает тяжесть неврологических нарушений и длительность течения экспериментального аллергического энцефаломиелита [43].

Четыре дикатионных антагониста отобраны из большой группы глутаматных дикатионных антагонистов по той причине, что они исследованы не только в острых, но и в хронических опытах, что улучшает их клинические перспективы. Но в ряду комбинированных (NMDA + AMPA) антагонистов выявилось немало других высокоактивных соединений, например ИЭМ-1754, структурно близкий к ИЭМ-1913 (рис. 4; об ИЭМ-1913 пойдёт речь в следующем разделе).

Рис. 4. Химическая структура соединения ИЭМ-1754.

Fig. 4. Chemical structure of the compound IEM-1754.

ИЭМ-1754 превосходит по анальгетической активности мемантин в 400 раз (устранение NMDA-вызванной анальгезии в тесте отдергивания хвоста), по устранению коразоловых судорог — в 280 раз, по предупреждению NMDA-вызванной летальности у мышей — в 815 раз, по противогипоксическому действию (гемическая гипоксия) — в 506 раз, по противоишемическому действию (тотальная ишемия мозга) — в 350 раз [157].

Вопросам глутаматной рецепции посвящено множество работ. Большинство из них связано с исследованиями на молекулярном и клеточном уровне. Значительно меньше работ посвящено исследованиям на целом животном, хотя именно эта ступень является решающей для перехода к клиническим исследованиям. Последующие разделы обзора посвящены исследованиям на целых животных с целью оценить клиническую перспективность дикатионных блокаторов открытых каналов глутаматных рецепторов. В этом плане наиболее существенным, интегральным показателем являются данные об эффективности и терапевтической широте исследованных веществ именно в опытах in vivo, и этому аспекту уделено особое внимание в работах, излагаемых далее.

ИЭМ-1913 как перспективный антиэпилептик с большой широтой терапевтического эффекта

Комбинированный (NMDA + AMPA) блокатор глутаматных рецепторов ИЭМ-1913 был получен путём замещения водорода в аминогруппе 1-аминоадамантана на 4-аминобутильный радикал. Аминоадамантан (амантадин) известен как NMDA-блокатор. Это монокатионная структура, не обладающая AMPA-блокирующей активностью, которая появляется только у дикатионных блокаторов типа ИЭМ-1913. ИЭМ-1913 был исследован на модели PTZ-судорог, при этом в качестве эталона сравнения был использован мемантин как единственный NMDA-блокатор, допущенный к клиническому применению. Эксперименты показали, что ИЭМ-1913 значительно превосходит мемантин по противосудорожной активности на модели коразоловых судорог в широком диапазоне доз 0,3–3,0 мг/кг и мало токсичен, вызывая у 50% крыс атаксию лишь в дозе 30 мг/кг, которая в 2000 раз превышает его эффективную противосудорожную дозу ЕД50, равную 0,015 мг/кг [154]. Мемантин вызывает у 50% крыс атаксию в дозе 35 мг/кг, которая лишь в 3,5 раза превышает его противосудорожную дозу ЕД50, равную 10 мг/кг. Таким образом, соответствующий терапевтический индекс ИЭМ-1913 превышает таковой у мемантина в 2000 / 3,5 = 570 раз [154].

Исследование противосудорожной активности ИЭМ-1913 было дополнено исследованием противопаркинсонического, антидепрессивного, анальгезирующего действия, а также острой токсичности [158, 159]. При инъекционном введении ИЭМ-1913 обладает сходной с мемантином противопаркинсонической активностью, но в дозах в 30–100 раз меньших, чем мемантин. В отличие от мемантина, эффективного только в высокой дозе 10 мг/кг, ИЭМ-1913 вызывает статистически значимый противопаркинсонический эффект в широком диапазоне доз 0,01–1,0 мг/кг [158].

В тесте Порсолта ИЭМ-1913 при инъекционном введении крысам в дозе 0,3 мг/кг (в 50 раз меньшей, чем у мемантина) вызывает в 1,6 раза более сильный по сравнению с мемантином антидепрессивный эффект. В отличие от мемантина, эффективного только в максимальной дозе 15 мг/кг, ИЭМ-1913 вызывает антидепрессивный эффект в дозах 0,1–0,3 мг/кг [158].

ИЭМ-1913 вызывает максимально возможный анальгезирующий эффект (в тесте отдергивания хвоста, tail flick) в дозе в 53 раза меньшей, чем мемантин (0,4 и 21 мг/кг соответственно) [158].

Мемантин при внутрибрюшинном (в/бр) введении вызывает гибель 50% мышей (ЛД50) в дозе 79 мг/кг, а коразоловые судороги при внутримышечном введении устраняет у 50% крыс (ЕД50) в дозе 10 мг/кг. Поэтому мемантин имеет низкий терапевтический индекс, равный 79 / 10 = 7,9, свидетельствующий о недостаточной безопасности применения мемантина. ЕД50 ИЭМ-1913 в тесте коразоловых судорог (при в/бр введении) устраняет коразоловые судороги у 50% крыс (ЕД50) в дозе 0,03 мг/кг, а величина ЛД50 (острая токсичность у мышей, мг/кг, в/бр) составляет 193 мг/кг [158]. Терапевтическая широта ИЭМ-1913 (как отношение ЛД50/ЕД50) соответствует 193/0,03 = 6430. Таким образом, ИЭМ-1913 при инъекционном введении имеет терапевтический индекс в 814 раз выше, чем у мемантина (6430/7,9 = 814), а следовательно, в отличие от мемантина, является соединением, более безопасным для применения.

Для оценки клинических перспектив препарата особый интерес представляют данные не только острых, но и хронических экспериментов и особенно при пероральном введении. Общепринятой хронической доклинической моделью темпоральной лобной эпилепсии является коразоловый киндлинг [160]. Киндлинг обычно считается полезной моделью сложных парциальных припадков, наиболее распространённого типа эпилепсии у людей [161]. Киндлинг моделируется путём повторного введения крысам коразола в дозе, не вызывающей судорожных состояний. Такое воздействие вызывает постепенное повышение судорожной «готовности» мозга к действию конвульсанта. Это выражается в том, что недействующие ранее субконвульсивные дозы коразола вызывают судороги, тяжесть которых нарастает с течением времени и завершается генерализованным клонико-тоническим приступом. Это состояние, называемое киндлингом («раскачка»), имитирует эпилептический статус, наблюдаемый у больных в период, предшествующий очередному эпилептическому припадку [140, 160]. Считается, что коразоловая судорожная модель наиболее близка по механизмам патогенеза к некоторым формам эпилептогенеза у человека (генерализованные абсенсы и миоклонические судороги) [162].

Способность PTZ вызывать судороги и соответственно приводить к состоянию киндлинга связана с его влиянием на освобождение и постсинаптическое действие ГАМК [163]. Следствием этого является растормаживание множества синаптических механизмов, опосредованных активацией ионотропных глутаматных рецепторов трёх основных типов — AMPA, NMDA и каинатных. В ходе развития киндлинга наблюдается гибель нейронов в гиппокампе [164] с последующим нарушением процессов обучения и памяти [165]. Установлено наличие корреляции между числом судорог 4-й стадии у крыс и числом повреждённых клеток в поле СА4 гиппокампа [166].

В работе W. Löscher и соавт. [114] было показано, что эффекты AMPA-блокатора NBQX в модели киндлинга усиливаются при предварительной обработке низкими дозами NMDA-антагониста МК-801, на основании чего авторы полагают, что как AMPAR, так и NMDAR критически вовлечены в состояние киндлинга. Поэтому особый интерес в этом плане представляют комбинированные (NMDA + AMPA) глутаматные блокаторы, способные одновременно блокировать оба типа глутаматных рецепторов. Из этого ряда блокаторов первым на киндлинговой модели был исследован ИЭМ-1913 [167], показавший ранее высокие лечебные свойства в острых опытах на моделях эпилепсии, боли, паркинсонизма и депрессии [154, 158]. Эффективность комбинированных (NMDA + AMPA) глутаматных блокаторов в модели киндлинга ещё не оценивалась.

В хроническом эксперименте с оральным введением ИЭМ-1913 у крыс с коразоловым киндлингом в качестве эталонов сравнения были использованы мемантин (селективный NMDA-блокатор), селективный AMPA-блокатор ИЭМ-1676 и вальпроат натрия как эталонный противоэпилептик [167]. Сравнение противосудорожной активности и безопасности NMDA-блокатора мемантина и AMPA-блокатора ИЭМ-1676 с ИЭМ-1913, блокирующим оба типа глутаматных рецепторов, имело цель выяснить вклад каждого из подтипов глутаматных рецепторов в противосудорожную активность (рис. 5).

Рис. 5. Химические структуры мемантина, ИЭМ-1913 и ИЭМ-1676.

Fig. 5. Chemical structure of memantine, IEM-1913, and IEM-1676.

Известно, что селективный блокатор NMDA-рецепторов мемантин при хроническом в/бр введении замедляет развитие коразолового киндлинга и существенно уменьшает тяжесть генерализованных клонико-тонических киндлинговых судорог только в высокой дозе 10–20 мг/кг, вызывающей развитие моторных нарушений у крыс и мышей [168]. В работе [169] у полностью киндлинговых крыс, то есть на модели фокальных припадков с вторичной генерализацией, мемантин уменьшал тяжесть и продолжительность припадков при дозе 10 мг/кг, в/бр. В дозе 20 мг/кг мемантин вызывал у крыс спонтанные двигательные припадки, гиперактивность, атаксию и стереотипию, которые могут быть связаны с дофаминомиметическими свойствами препарата.

Вальпроат натрия при хроническом профилактическом введении подавляет развитие коразолового киндлинга у крыс и мышей, но значительно слабее уменьшает тяжесть повторных клонико-тонических судорог у животных с уже развившимся киндлингом [170]. В основе противоэпилептического действия вальпроата лежит активация тормозных ГАМКергических механизмов [171], недостаточно эффективно ослабляющих токсическое действие глутамата на NMDAR и AMPAR при киндлинге, поэтому для лечения киндлинговых судорог вальпроат приходится применять в высоких дозах, вызывающих не только противосудорожный, но и побочный седативный эффект, так же связанный со стимуляцией рецепторов ГАМК [168, 171].

Исследование противосудорожной активности при хроническом оральном введении у крыс с коразоловым киндлингом показало, что селективный блокатор АМРАR ИЭМ-1676 и комбинированный блокатор NMDAR и АМРАR ИЭМ-1913 уменьшают тяжесть киндлинговых коразоловых судорог, а также число крыс с полным киндлингом на 20–40% сильнее, чем эталонный противоэпилептик вальпроат натрия и селективный блокатор NMDAR мемантин [167]. ИЭМ-1913 и ИЭМ-1676 вызывают противосудорожные эффекты в широком диапазоне доз, соответственно 0,03–1 и 3–40 мг/кг, тогда как мемантин и вальпроат натрия эффективны только в узком диапазоне доз, соответственно 12–20 и 100–200 мг/кг.

Вальпроат натрия, мемантин и ИЭМ-1676 вызывают значительные нарушения моторной функции у интактных крыс в дозах, вызывающих противосудорожный эффект у киндлинговых крыс. В то же время ИЭМ-1913 вызывает нарушения моторной функции у интактных крыс только в очень высокой дозе — 90 мг/кг, в 270 раз превышающей дозу, вызывающую максимальный противосудорожный эффект у киндлинговых крыс (0,33 мг/кг).

Вальпроат натрия, мемантин и ИЭМ-1676 имеют низкий терапевтический индекс (ТД50/ЕД50), равный соответственно 1,7, 2,0 и 8,0, свидетельствующий о высокой хронической токсичности и низкой безопасности их применения. ИЭМ-1913 имеет терапевтический индекс 80/0,05 = 1600, который в 800 раз выше, чем у мемантина и вальпроата, и в 200 раз выше, чем у ИЭМ-1676, что свидетельствует о низкой токсичности и высокой безопасности хронического применения ИЭМ-1913 [167, 166].

Таким образом, селективная блокада AMPAR, вызванная ИЭМ-1676, достаточна для достижения максимального противосудорожного эффекта у крыс с коразоловым киндлингом, однако только комбинированный блок NMDAR и AMPAR обеспечивает как максимальную противосудорожную активность, так и безопасность применения ИЭМ-1913 в широком диапазоне эффективных доз.

Известен синергетический эффект совместного применения NMDA-блокаторов (МК-801, мемантин) и AMPA-блокатора (NBQX) в киндлинговой модели эпилепсии, причём синергетическое увеличение противосудорожной активности не сопровождалось каким-либо заметным увеличением побочных эффектов, что свидетельствует о том, что комбинации антагонистов AMPAR и NMDAR обеспечивают новую стратегию лечения эпилептических припадков [114, 140]. Поскольку ИЭМ-1913 является комбинированным NMDA- и AMPA-антагонистом, то нельзя исключить фактор синергизма для ИЭМ-1913 в киндлинговой модели эпилепсии.

Можно полагать, что высокая противопаркинсоническая, антидепрессивная, анальгезирующая и противосудорожная активность и низкая токсичность ИЭМ-1913 объясняется комбинированным блоком NMDAR и AMPAR мозга, а также быстрой кинетикой [119]. Возможно также большее сродство ИЭМ-1913, как это показано для мемантина, к экстрасинаптическим рецепторам («рецепторам смерти») по сравнению с синаптическими [55], которые различаются по субъединичному составу, но это требует специального исследования.

В целом, в отличие от мемантина, применяемого только для лечения БА, ИЭМ-1913 может быть предложен в качестве высокоэффективного и безопасного средства для лечения эпилепсии, паркинсонизма, боли и депрессии.

Нейрозащитные свойства ИЭМ-1913 на модели рассеянного склероза

Выше была отмечена важность экспериментов на хронических моделях, позволяющих более полно оценить клиническую перспективность препарата. Таковой является модель рассеянного склероза на крысах.

Рассеянный склероз у человека — тяжёлое аутоиммунное демиелинизирующее заболевание, представляющее серьёзную медико-социальную проблему, поскольку поражаются преимущественно люди трудоспособного возраста, происходит быстрая инвалидизация заболевших. Общепризнанной моделью рассеянного склероза является экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) у лабораторных животных, поскольку он имеет сходные с рассеянным склерозом клинические проявления и патогенетические механизмы [172]. Характерными признаками этих заболеваний являются увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), воспаление в ЦНС, а также последующая демиелинизация нервных волокон и гибель нейронов [38, 173].

Основную роль в токсическом поражении нейронов, миелина и особенно олигодендроцитов играет глутамат, образующийся в больших количествах в мозге под влиянием провоспалительных цитокинов (IL-1β, TNF-α) и энцефалитогенных Т-лимфоцитов, индуцирующих воспаление в ЦНС при рассеянном склерозе и ЭАЭ [174]. Причина глутаматной эксайтотоксичности — массивное поступление кальция внутрь нейронов и олигодендроцитов через Са-проводящие каналы глутаматных рецепторов NMDA и GluA1 AMPA-типов [174]. Важную роль в индукции воспаления при рассеянном склерозе и ЭАЭ играет повышение проницаемости ГЭБ для энцефалитогенных Т-лимфоцитов и цитокинов, вызванное активацией NMDAR в клетках, формирующих ГЭБ, под действием эндогенного глутамата [173].

Блокаторы NMDAR, такие как мемантин и МК-801, снижают выраженность неврологических нарушений у животных с ЭАЭ в результате подавления дегенерации нейронов головного и спинного мозга, вызванной токсическим действием глутамата, а также уменьшают воспаление в ЦНС вследствие уменьшения проницаемости ГЭБ для цитокинов и Т-лимфоцитов [173]. Тем не менее даже в максимальных дозах NMDA-блокаторы, как правило, не предотвращают развитие демиелинизации спинного мозга и лишь частично уменьшают выраженность неврологических нарушений у крыс с ЭАЭ [173, 174]. С другой стороны, такие известные блокаторы AMPAR, как NBQX и GYKI 52488, при в/бр введении более эффективны, чем NMDA-блокаторы, устраняют неврологические нарушения у мышей и крыс с ЭАЭ [38]. Однако AMPA-блокаторы практически не влияют на развитие воспаления в ЦНС у крыс с ЭАЭ, вероятно, потому, что они не уменьшают проникновение цитокинов и энцефалитогенных Т-лимфоцитов через ГЭБ, нарушенный вследствие активации NMDAR в ГЭБ эндогенным глутаматом [38, 173].

Известно, что комбинированное применение блокаторов NMDAR и AMPAR более эффективно устраняет дегенерацию нейронов, аксонов и нейроглии при ишемии мозга и эпилепсии, чем использование этих блокаторов в отдельности [114, 149, 150]. Кроме того, поскольку активация NMDAR происходит после активации AMPAR, можно ожидать, что комбинированный подход был бы более выгодным [175]. Однако, вещества, способные одновременно блокировать как NMDAR, так и AMPAR, не были исследованы на моделях рассеянного склероза.

Результаты исследования комбинированного (NMDA + AMPA) глутаматного антагониста ИЭМ-1913 в сравнении с эталонным NMDA-блокатором мемантином привели к следующим выводам [44]. Курсовое введение мемантина в дозе 10 мг/кг уменьшает средний кумулятивный индекс в 1,4 раза, число тяжело заболевших животных — в 1,1 раза, тогда как введение ИЭМ-1913 в дозе 1 мг/кг уменьшает средний кумулятивный индекс в 3,1 раза, а число тяжело заболевших животных — в 2,5 раза. Длительность течения ЭАЭ (число дней) мемантин в дозе 10 мг/кг уменьшает в 1,4 раза, а ИЭМ-1913 в дозе 1 мг/кг — в 3 раза. Таким образом, лечебная активность ИЭМ-1913 в тесте ЭАЭ существенно превышает таковую у мемантина, причём в дозе, меньшей на порядок [44].

Высокая эффективность ИЭМ-1913 на модели ЭАЭ у крыс связана, по-видимому, с его нейропротективным и противовоспалительным действием, обусловленным, с одной стороны, комбинированным блоком GluA1 AMPAR и NMDAR мозга, а с другой — уменьшением проницаемости ГЭБ для энцефалитогенных Т-лимфоцитов вследствие блокады NMDAR в ГЭБ. На сегодняшний день в клинических испытаниях не удалось продемонстрировать какого-либо значимого влияния NMDA-блокатора мемантина на пациентов с рассеянным склерозом [176], причём в нескольких исследованиях сообщалось о побочных эффектах. Высокая лечебная активность комбинированного (NMDA + AMPA) блокатора ИЭМ-1913 в тесте ЭАЭ наряду с его низкой токсичностью создают хорошие предпосылки для использования ИЭМ-1913 в качестве средства для лечения рассеянного склероза.

ВАРИАЦИИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ ДИКАТИОННЫХ ГЛУТАМАТНЫХ АНТАГОНИСТОВ КАК ПУТЬ К НОВЫМ ЛЕКАРСТВАМ

Молекулы дикатионных антагонистов типа ИЭМ-1913 могут быть модифицированы путём вариации длины полиметиленовой цепочки, соединяющей катионные группы, либо путём вариации структуры катионных групп. Введение двух метильных групп в положения 3, 5 кольца 1-аминоадамантана (переход от амантадина к мемантину) ведёт к резкому увеличению NMDA-блокирующей и противосудорожной активности, что послужило стимулом для получения соответствующих аналогов ИЭМ-1913 с двумя метильными группами в положениях 3, 5 адамантильного кольца (ИЭМ-2127 и ИЭМ-2121) (рис. 6).

Рис. 6. Химические структуры ИЭМ-1913, ИЭМ-2127 и ИЭМ-2121.

Fig. 6. Chemical structures of IEM-1913, IEM-2127 and IEM-2121.

Исследование на нейронах мозга крысы обнаружило у ИЭМ-2127 и ИЭМ-2121 не только высокую NMDA-блокирующую активность, но и высокую AMPA-блокирующую активность, отсутствующую у монокатионных глутаматных блокаторов типа мемантина или дизоцилпина (МК-801). В опытах in vitro на срезах гиппокампа крысы величина ИК50 составила для ИЭМ-2127 7,8 мкМ для NMDA и 1,1 мкМ для AMPA-рецепторов, а для ИЭМ-2121 3,4 мкМ для NMDA и 0,46 мкМ для AMPA-рецепторов [177].

Результаты исследования в опытах на интактных животных показали, что соединения ИЭМ-2121 и ИЭМ-2127 имеют равную с мемантином противопаркинсоническую, противосудорожную и антидепрессивную активность, но превосходят мемантин по противогипоксической и анальгезирующей активности, а также, по сравнению с мемантином, являются малотоксичными и более безопасными для применения соединениями. В отличие от мемантина, эффективного только в одной максимальной дозе 15–20 мг/кг, ИЭМ-2121 и ИЭМ-2127 вызывают значимые фармакологические эффекты в более широком диапазоне доз, соответственно 0,03–1 и 0,3–3 мг/кг [158, 178]. Низкий уровень побочных эффектов ИЭМ-2121 и ИЭМ-2127 может быть связан с более быстрой кинетикой дикатионов по сравнению с монокатионами [76].

В эксперименте с хроническим оральным введением комбинированного (NMDA + AMPA) глутаматного блокатора ИЭМ-2121 у крыс с коразоловым киндлингом в качестве эталона сравнения был использован вальпроат натрия как эталонный противоэпилептик. Известно, что селективная блокада NMDAR или AMPAR недостаточна для предупреждения локальных клонических киндлинговых судорог [168, 179, 180]. Результаты хронического эксперимента с оральным введением ИЭМ-2121 у крыс с коразоловым киндлингом показали, что комбинированная блокада AMPAR и NMDAR максимально эффективно подавляет эпилептогенез не только генерализованных клонико-тонических, но и локальных клонических киндлинговых судорог. ИЭМ-2121 в дозе 10 мг/кг обладает более высокой, чем у вальпроата натрия в дозе 200 мг, противосудорожной активностью, так как уменьшает среднюю тяжесть коразоловых киндлинговых судорог в 1,5 раза сильнее, чем вальпроат натрия, а также предупреждают клонические киндлинговые судороги у 87% крыс по сравнению с 57% при применении вальпроата натрия [156].

Самостоятельный интерес представляет модель судорог, вызываемых не коразолом, а каинатом, избирательно активирующим AMPAR. Известно, что первичная каинатная дегенерация лежит в основе острых клонико-тонических каинатных судорог и острой каинатной летальности, а вторичная глутаматная дегенерация ведёт к развитию острых и повторных клонических каинатных судорог, а также является причиной хронической каинатной летальности [181]. Селективные блокаторы AMPAR эффективно устраняют первичную каинатную дегенерацию и поэтому полностью устраняют острые клонико-тонические каинатные судороги и летальность в первые 4 ч после введения каината, однако они менее эффективно подавляют вторичную дегенерацию интернейронов и пирамид гиппокампа, связанную с гиперактивацией не только AMPAR, но и NMDAR в результате массивного выброса эндогенного глутамата с 3-го по 14-й день после введения каината [182]. NMDA-блокаторы значительно слабее, чем AMPA-блокаторы, уменьшают тяжесть клонико-тонических каинатных судорог, поскольку ослабляют лишь вторичную глутаматную дегенерацию интернейронов и пирамид гиппокампа [182].

Влияние AMPA- и NMDA-блокаторов на клонический компонент острых каинатных судорог, а также хроническую каинатную летальность было исследовано на примере комбинированного (NMDA + AMPA) глутаматного блокатора ИЭМ-2121 [155]. Поскольку ИЭМ-2121 обладает как NMDA-, так и AMPA-блокирующей активностью, представляло интерес сравнить его в одной серии экспериментов с избирательными блокаторами NMDA (мемантин) и AMPA (NBQX). Было исследовано влияние ИЭМ-2121 на каинатные судороги и каинатную летальность у крыс в сравнении с NBQX и мемантином [155].

AMPA-блокатор NBQX полностью подавляет эпилептогенез острых генерализованных клонико-тонических каинатных судорог, но только незначительно ослабляет развитие клонических каинатных судорог, а также не обеспечивает выживание 100% крыс с каинатной токсичностью. NMDA-блокатор мемантин лишь частично подавляет эпилептогенез острых генерализованных клонико-тонических каинатных судорог и не предупреждает хроническую каинатную летальность, связанную с активацией преимущественно AMPAR мозга [182, 183].

ИЭМ-2121, блокирующий как NMDAR, так и AMPAR мозга, в отличие от мемантина и NBQX подавляет развитие не только клонико-тонических, но и клонических каинатных судорог, а также предупреждает хроническую каинатную летальность у 100% крыс, по-видимому, в результате максимально полного устранения не только первичной каинатной дегенерации, но и вторичной глутаматной дегенерации нейронов гиппокампа. ИЭМ-2121, обладающий комбинированной NMDA- и AMPA-блокирующей активностью, можно рассматривать в качестве нового поколения высокоэффективных противосудорожных и нейропротекторных средств для лечения эпилепсии, а также тяжёлых ишемических и нейродегенеративных заболеваний ЦНС, в основе которых лежит токсическое действие глутамата на AMPAR и NMDAR мозга.

Первые комбинированные (NMDA + AMPA) глутаматные антагонисты включали в себя две катионные группы, одна из которых содержала радикал адамантана. Монокатионные адамантан-содержащие соединения, например, амантадин (1-аминоадамантан) и мемантин (3,5-диметил-1-аминоадамантан), обладали NMDA-блокирующей активностью, тогда как AMPA-блокирующая активность, как оказалось, требовала наличия второй катионной группы в молекуле антагониста, обычно незамещённой аминогруппы. Адамантан-содержащие дикатионы составили первую группу комбинированных (NMDA + AMPA) антагонистов.

Вторая группа комбинированных глутаматных антагонистов отличается от первой наличием 1-фенилциклогексильного радикала в молекуле дикатиона. Замена адамантильного радикала на 1-фенилциклогексильный радикал ведёт к резкому возрастанию как NMDA-, так и AMPA-блокирующей активности, при этом NMDA-активность преобладает. В опытах in vitro на срезах гиппокампа крысы величина ИК50 составила в случае ИЭМ-2018 10 мкМ для NMDAR и 12,7 мкМ для AMPAR, а в случае ИЭМ-2062 — 0,24 мкМ для NMDAR и 1,7 мкМ для AMPAR [177] (рис. 7).

Рис. 7. Химическая структура соединений ИЭМ-2018 и ИЭМ-2062.

Fig. 7. Chemical structure of compounds IEM-2018 and IEM-2062.

В результате впервые был получен глутаматный блокатор комбинированного типа с наиболее высокой как NMDA-, так и AMPA-блокирующей активностью среди всех дикатионов.

В связи со столь высокой комбинированной активностью ИЭМ-2062 в опытах in vitro встал вопрос об исследовании его фармакологической активности и безопасности, чтобы оценить клинические перспективы препарата. Результаты исследования в острых опытах показали, что ИЭМ-2062 по совокупности свойств обладает существенными преимуществами перед использующимся в клинике мемантином, так как значительно превосходят мемантин по антигипоксической, противосудорожной, антидепрессивной и анальгезирующей активности, имеет равную с мемантином противопаркинсоническую активность, а также имеет намного более низкую токсичность и большую безопасность применения по сравнению с мемантином. В отличие от мемантина, эффективного только в одной максимальной дозе 15–20 мг/кг, ИЭМ-2062 вызывает статистически значимые фармакологические эффекты в более широком диапазоне доз 0,3–3 мг/кг [184].

Было проведено также предклиническое исследование противосудорожного действия ИЭМ-2062 в хроническом опыте. В киндлинговой коразол-индуцированной (PTZ-induced) модели эпилепсии специфическое увеличение связывания как [3H]AMPA [185], так и [3H]MK801 [186] наблюдалось у киндлинговых животных в области гиппокампа и в височной коре через 1 нед. после последней инъекции PTZ и сохранялось в течение длительного времени. Авторы заключают, что в основе гипервозбудимости киндлинговых животных лежит активация глутаматных рецепторов как AMPA, так и NMDA. Следовательно, в качестве противоэпилептических препаратов наиболее перспективны комбинированные (NMDA + AMPA) глутаматные блокаторы типа ИЭМ-2062.

Изучение противосудорожного действия ИЭМ-2062 проведено на хронической доклинической модели эпилепсии у крыс (коразоловый киндлинг) [187]. Для выработки коразолового киндлинга крысам вводили в/бр коразол PTZ. Исследуемые вещества вводили перорально внутрижелудочно металлическим зондом. В качестве эталонов сравнения были использованы вальпроат натрия как эталонное противоэпилептическое средство и мемантин как эталонный NMDA-блокатор, используемый в клинике.

Эксперименты показали, что селективная блокада NMDAR, вызванная хроническим оральным введением мемантина, не только недостаточна для развития максимальной противосудорожной активности у киндлинговых крыс, но и ведёт у них к развитию гиперкинезии и атаксии. Максимальный противосудорожный эффект вальпроата натрия в дозе 200 мг/кг сопровождается побочным седативным действием у 100% крыс (терапевтическое окно равно 1,0).

ИЭМ-2062 вызывают нарушение двигательной активности только в очень высокой дозе (92 мг/кг), соответственно, в 30,7 раз превышающей дозу, вызывающую максимальный противосудорожный эффект у киндлинговых крыс (3 мг/кг). ИЭМ-2062 уменьшает тяжесть киндлинговых судорог в 1,7–1,9 раза сильнее и в 30,7 раза безопаснее, чем вальпроат натрия и мемантин. ИЭМ-2062 вызывает противосудорожные эффекты в максимально широком диапазоне доз (1–48 мг/кг), который значительно больше, чем у мемантина (12–20 мг/кг) и вальпроата натрия (100–200 мг/кг) [187].

Широта терапевтического эффекта ИЭМ-2062 в остром опыте составила 164 (отношение ЛД50 в тесте коразоловых судорог крыс к ЕД50 в тесте острой токсичности у мышей) [184], тогда как на модели киндлинга — 30,7 (отношение минимальной дозы, вызывающей нарушение локомоторной функции, к минимальной дозе, вызывающей максимальный противосудорожный эффект) [187].

В работе [188] изучали блокирующее действие ближайшего гомологического аналога ИЭМ-2062 (ИЭМ-1925), на возбуждающие постсинаптические токи в неостриатальных и корковых тканях крыс (рис. 8).

Рис. 8. Химическая структура соединений ИЭМ-1925 и ИЭМ-2062.

Fig. 8. Chemical structure of compounds IEM-1925 and IEM-2062.

Установлено, что блокирование токов Cа-проницаемых AMPAR дикатионом ИЭМ-1925 увеличивалось вместе с частотой стимуляции, а также при повышении концентрации глутамата, то есть именно то, что имеет место в патологических процессах. И наоборот, минимальная активность блокирования токов Cа-проницаемого AMPAR наблюдалась для нечастой (физиологической) активации канала. Это согласуется с главным требованием для клинически эффективного лекарства — чтобы его эффективность возрастала по мере увеличения числа активированных рецепторов, иначе говоря, чтобы их ингибирующее действие было минимальным в условиях нормальной физиологической активности глутаматергических систем, но было бы направлено на очаги патологически избыточного освобождения и действия глутамата [188].

В табл. 1 представлены четыре глутаматных антагониста (ИЭМ-1913, 2062, 2127, 2121), которые проявляют отмеченный выше спектр лечебных эффектов. В качестве эталона сравнения выбраны два глутаматных блокатора, которые вышли на мировой рынок лекарственных средств — мемантин (NMDA-блокатор) и перампанел (AMPA-блокатор). Как видно из табл. 1, широта их терапевтического эффекта («терапевтическое окно») на порядки уступает четырём ИЭМ-антагонистам по результатам предклинических исследований.

Таблица 1. Шифры, формулы, противосудорожная активность in vivo на PTZ-модели эпилепсии и лечебная активность соединений in vivo

Table 1. Codes, formulas, in vivo anticonvulsant activity in the PTZ model of epilepsy, and in vivo therapeutic activity of the compounds

Шифр	Формула	PTZ-вызванные судороги, ED50, мг/кг	Лечебная активность in vivo	Терапевтический индекс1
ИЭМ-1913		0,031 [158]	Эпилепсия [154, 158, 167], паркинсонизм [158], боль [158], рассеянный склероз [44], депрессия [158]	20002 [154], 64303 [158], 16004 [167]
ИЭМ-2062		0,75 [184]	Эпилепсия [184, 187], паркинсонизм [184], гипоксия [184], боль [184], депрессия [184]	1643 [184], 305 [187]
ИЭМ-2121		0,1 [159]	Эпилепсия [178, 155, 156], паркинсонизм [159], гипоксия [159], боль [159], депрессия [159]	7503 [178]
ИЭМ-2127		0,15 [178]	Эпилепсия [178], паркинсонизм [159], гипоксия [159], боль [159], депрессия [159]	7003 [178]
Мемантин		10,0 [158]	–	7,93 [158], 2,04 [167], 3,52 [154]
Перампанел		0,94 [92]	–	1,16 [195], 3,87 [195], 1,98 [195]

Примечание. ¹Ссылки на литературу. ²Острый опыт, в/м. Терапевтический индекс веществ (ТД50/ЕД50), рассчитанный как отношение токсической дозы, вызывающей атаксию у 50% крыс (ТД50), к дозе, предупреждающей клонико-тонические коразоловые судороги у 50% крыс (ЕД50). ³Острый опыт, в/м. Терапевтический индекс веществ (ЛД50/ЕД50), рассчитанный как отношение токсической дозы, вызывающей гибель 50% мышей (ЛД50) к дозе, предупреждающей клонико-тонические коразоловые судороги у 50% крыс (ЕД50). ⁴Хронический опыт, per os. Терапевтический индекс ТД50/ЕД50 — отношение токсической дозы, на 50% уменьшающей число интактных крыс, способных удерживать равновесие на вращающемся стержне в течение 100 с (ТД50), к дозе, уменьшающей число крыс с полным киндлингом на 50% (ЕД50). ⁵Хронический опыт, per os. Терапевтический индекс, рассчитанный как отношение минимальной дозы, вызывающей нарушение локомоторной функции, к минимальной дозе, вызывающей максимальный противосудорожный эффект. ⁶Острый опыт, per os, мыши. Терапевтический индекс веществ (TD50/ED50), рассчитанный как отношение дозы TD50 в ротарод-тесте (rotarod test) к дозе ED50 в MES-индуцированном судорожном тесте (maximal electroshock, MES). ⁷Острый опыт, per os, мыши. Терапевтический индекс веществ (TD50/ED50), рассчитанный как отношение дозы TD50 в ротарод-тесте к дозе ED50 для аудиогенных судорог. ⁸Острый опыт, per os, мыши. Терапевтический индекс веществ (TD50/ED50), рассчитанный как отношение дозы TD50 в ротарод тесте к дозе ED50 для PTZ-индуцированных судорог.

Малая широта терапевтического эффекта мемантина (как и других избирательных NMDA-антагонистов) связана с косвенной дофаминомиметической активностью (атаксия и двигательная гиперактивность). Что касается избирательных AMPA-антагонистов аллостерического типа действия, таких как перампанел или GYKI 52466, то их малая терапевтическая широта может быть связана с тем, что они блокируют одновременно как GluA1 (Са-проницаемые), так и GluA2 (Са-непроницаемые) глутаматные рецепторы.

В работе, поддержанной Министерством обороны США, было установлено, что избирательный антагонист Са-проницаемых AMPAR ИЭМ-1460 блокирует только GluA1-содержащие рецепторы, препятствуя тем самым эксайтотоксичности, но не блокирует GluA2, что позволяет сохранить нормальную нейропередачу. Это даёт возможность военнослужащим защитить слух от шумового повреждения при сохранении способности слышать нужные команды [135].

GluA2 AMPAR важны для памяти и обучения [189], тогда как эксайтотоксичность связана с гиперфункцией GluA1 AMPAR [190, 191], которые и следует блокировать, либо с избирательными GluA1 AMPA-блокаторами типа ИЭМ-1460, либо комбинированными (NMDA + AMPA) блокаторами (см. табл. 1).

Характерной чертой дикатионных блокаторов открытого ионного канала является высокая скорость как образования, так и распада комплекса блокатора с каналом, что, как полагают, объясняет большую широту их терапевтического эффекта [157]. Кроме того, важен фактор дикатионности. Переход от моно- к дикатионным структурам ведёт к существенному уменьшению уровня побочных эффектов и большей широте терапевтического эффекта, «терапевтического окна». Эффективность мемантина, относящегося к монокатионным блокаторам NMDA-рецепторов, в тесте судорог, вызываемых PTZ, была сравнительно невелика, тогда как ИЭМ-1913, сочетающий в себе свойства блокатора обоих подтипов глутаматных рецепторов (NMDA + AMPA) по противосудорожной активности, был существенно активнее мемантина, а его терапевтическая широта (разность между токсической и минимально действующей дозами) превышала показатель 1600. Более того, ЕД50 по показателю антагонизма к PTZ для мемантина составляла 10 мг/кг, а для ИЭМ-1913 — только 0,03 мг/кг. Аналогичные закономерности высокой фармакологической активности наблюдали и для других аналогов дикатионов — соединений ИЭМ-2121, ИЭМ-2127 и ИЭМ-2062.

Представленные в табл. 1 четыре дикатионных глутаматных блокатора позиционируются прежде всего как потенциальные противоэпилептики с большой широтой терапевтического эффекта. Вместе с тем все четыре соединения проявили себя как антидепрессанты (тест Порсолта). Например, внутримышечное введение ИЭМ-2062 в дозе 3 мг/кг в 6,2 раза по сравнению с контролем уменьшает иммобилизацию крыс в тесте Порсолта (снижает длительность иммобилизации со 181 до 29 с) [184]. Молекула ИЭМ-2062 имеет элементы сходства с кетамином (1-фенилциклогексиловый фрагмент). Кетамин, блокатор каналов глутаматных NMDAR, проявил быстродействующие и устойчивые антидепрессивные эффекты при резистентной к лечению депрессии (рис. 9).

Рис. 9. Химическая структура соединения кетамина и ИЭМ-2062.

Fig. 9. Chemical structure of the compound ketamine and IEM-2062.

Связываясь с ионным каналом NMDAR, кетамин ингибирует приток ионов кальция, тем самым снижая возбудимость нейронов. Этот механизм является центральным для его анестезирующего и анальгезирующего действия. Однако фармакологический профиль кетамина выходит за рамки антагонизма NMDAR. Блокада NMDAR приводит к увеличению синаптического высвобождения глутамата, который преимущественно активирует AMPAR. Стимулируя активность AMPAR, кетамин усиливает синаптическую передачу и повышает общий возбуждающий тонус в мозге [192]. Согласно другой гипотезе, клинические эффекты кетамина связаны с его воздействием на участки ионного канала, отличные от тех, с которыми связываются NMDA-блокаторы типа МК-801 или мемантина [193].

Однако широкое применение кетамина в качестве антидепрессанта ограничивают его психозомиметические эффекты и наркогенный потенциал. Антидепрессанты дикатионной структуры (см. табл. 1) лишены наркогенных и психомиметических побочных эффектов, свойственных кетамину и отличаются большой широтой терапевтического эффекта.

Ещё одна особенность четырёх ИЭМ-антагонистов (см. табл. 1) в том, что все они проявили себя как высокоактивные анальгетики. Препараты ненаркотических анальгетиков для купирования сильной и средней боли являются относительно новым направлением фармацевтики. Их внедрение в качестве альтернативы опиатам весьма актуально. Однако число реальных кандидатов крайне ограничено.

По данным Министерства обороны США, размещенным в сети Интернет, примерно половина военнослужащих, выводимых из зон вооруженных конфликтов, требует кратковременной медикаментозной поддержки в связи с болевым синдромом. Около 10% ветеранов испытывают хронический болевой синдром, требующий использования фармпрепаратов в течение длительного времени, часто в течение всей жизни. Номенклатура используемых в РФ анальгетиков в несколько раз меньше по сравнению с США и странами ЕС.

Наибольший практический интерес представляют сильнодействующие ненаркотические анальгетики, действующие на центральную и периферическую системы передачи нервного импульса у человека. Данные вещества обладают рядом преимуществ: 1) не входят в списки особо контролируемых лекарств, что не создаёт немедицинские проблемы для врачей и пациентов в РФ; 2) низкие терапевтические дозы не ограничивают разнообразие возможных лекарственных форм; 3) минимальные побочные эффекты не оказывают принципиального воздействия на работоспособность, то есть наиболее пригодны для экономически активной и трудоспособной части населения; 4) не вызывают эйфории, физиологической и психологической зависимости.

Как отмечают участники СВО, в их среде весьма популярен диклофенак (входит в аптечку бойца), который сравнительно быстро и эффективно устраняет боль. Механизм действия — торможение биосинтеза простагландинов, которые играют важную роль в генезе воспаления и боли. Диклофенак входит в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств, однако специалисты предлагают полностью запретить его из-за увеличения (примерно на 40%) риска инфарктов, а также множества других побочных эффектов.

Глутаматные антагонисты (см. табл. 1), отличаются высокой эффективностью в качестве анальгетиков и вместе с тем низкой токсичностью. Важной находкой явился резкий рост активности наряду с уменьшением токсичности (и как следствие расширение терапевтического индекса) при переходе от монокатионных структур к дикатионным. Глутаматные антагонисты GluA1 AMPA-типа лишены опиоид-подобных свойств и связанных с этим побочных эффектов. Более того, AMPA-антагонисты ИЭМ-1460 и ИЭМ-2131 предложены в качестве потенциальных лечебных средств против аддикции и других болезней ЦНС [124].

Кроме того, имеется возможность усилить анальгетические свойства ИЭМов (см. табл), причём не только анальгетические. Установлено, что эффективные дозы глутаматных блокаторов ИЭМ-1913, ИЭМ-2062 и ИЭМ-2121 могут быть уменьшены (на порядок и более) в составе композиций с пороговой дозой водорастворимого аналога пальмитоилэтаноламида (ИЭМ-1875), что было показано на моделях эпилепсии, паркинсонизма, боли и депрессии. Сходные результаты показаны также для клинически используемого NMDA-блокатора мемантина, что может послужить примером перепрофилирования лекарства для новых областей использования [194].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итоги, следует отметить широкий ассортимент лекарственных эффектов комбинированных (NMDA + AMPA) глутаматных антагонистов, которые оказались эффективны на моделях эпилепсии, паркинсонизма, боли, депрессии, гипоксии и рассеянного склероза. Общей чертой данной группы соединений является их способность препятствовать эксайтотоксичности, которая наблюдается при этих патологических процессах. Кроме того, для данного класса антагонистов характерна избирательность действия на патологические очаги болезни при минимальном влиянии на нормальные физиологические функции.

Комбинированные (NMDA + AMPA) блокаторы имеют широкие возможности вариации терапевтического эффекта, поскольку допускают выбор антагониста с нужным соотношением вклада NMDA и AMPA для конкретной терапевтической цели. Например, для ИЭМ-2062 NMDA-активность примерно на порядок превышает AMPA-активность, тогда как для ИЭМ-2121, наоборот, AMPA-активность на порядок превышает NMDA-активность [177]. Это соотношение активностей можно менять в широких пределах путём варьирования структуры молекулы, создавая возможности для оптимизации терапевтической стратегии и подбора антидепрессантов с различным профилем фармакологических свойств.

В отличие от мемантина, применяемого только для лечения БА, комбинированные (NMDA + AMPA) глутаматные блокаторы могут оказаться полезными для лечения эпилепсии, паркинсонизма, депрессии, боли и рассеянного склероза.

Комбинированные глутаматные антагонисты проявили высокий защитный эффект в тестах на противосудорожную активность не только в острых, но и хронических опытах in vivo — наиболее важных предклинических моделях (коразоловый киндлинг, пероральное введение), и представляют интерес как потенциальные противоэпилептики с большой широтой терапевтического эффекта.

В итоге, можно заключить, что представленный в данном обзоре новый класс комбинированных (NMDA + AMPA) глутаматных антагонистов обладает комплексом свойств, перспективных для клинической разработки.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад автора. В.Е. Гмиро — определение концепции, проведение исследования, написание черновика рукописи, пересмотр и редактирование рукописи. Автор одобрил рукопись (версию для публикации), а также согласился нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Источники финансирования. Исследование выполнено в рамках государственного задания Минобрнауки России FGWG-2025-0020 «Поиск молекулярных мишеней для фармакологического воздействия при аддиктивных и нейроэндокринных нарушениях с целью создания новых фармакологически активных веществ, действующих на рецепторы ЦНС».

Раскрытие интересов. Автор заявляет об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими организациями), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При проведении исследования и создании настоящей статьи автор не использовал ранее полученные и опубликованные сведения (данные, текст).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, представлены в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали один внешний рецензент, член редакционного совета и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFO

Author contributions: V.E. Gmiro, conceptualization, investigation, writing — original draft, writing — review & editing. The author approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Funding sources: The study was part of State Assignment FGWG-2025-0020 "Search for molecular targets for pharmacological intervention in addictive and neuroendocrine disorders to create new pharmacologically active substances acting on CNS receptors" of the Ministry of Education and Science of Russia.

Disclosure of interests: The author has no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text or data) was used in this study or article.

Data availability statement: All data obtained in this study are available in the article and its supplementary material.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer-review: This article was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer-review process involved one external reviewer, a member of the Editorial Council, and the in-house science editor.

About the authors

Valery E. Gmiro

Author for correspondence.
Email: gmiro2119@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2093-8552
SPIN-code: 1526-2154

Cand. Sci. (Chemistry)

References