SOVREMENNYE VOZMOZhNOSTI SISTEMNOGO IZUChENIYa BOLEZNI DVIGATEL'NOGO NEYRONA IN VITRO, IN VIVO I IN SILICO

Abstract



Full Text

Болезнь двигательного нейрона (БДН), которая чаще всего манифестирует в форме бокового амиотро- фического склероза, представляет собой тяжелое нейродегенеративное заболевание с вовлечением различных уровней двигательной системы, приводящее к вялым параличам скелетной мускулатуры, обычно в сочетании со спастичностью, нарушению дыхания и глотания, неизбежной смерти через 2-5 лет от момента манифестации симптомов [1]. Ввиду фатального характера заболевания и отсутствия эффективных методов лечения большое значение придается изучению молекулярного патогенеза БДН на генетическом, клеточном уровне, а также с при- влечением методов компьютерного моделирования. Около 10 % случаев БДН характеризуются менделевским наследованием. Семейные формы БДН явля- ются генетически гетерогенными и связаны с мутациями в гене супероксиддистумазы (SOD1), а также в генах метаболизма РНК, клеточного процессинга, нейротрофических и ряда других биохимических каскадов [2]. Поэ- тому для внедрения в будущем персонализированного подхода к терапии БДН необходимо четкое молекулярное профилирование пациентов, с определением поврежденных генов и их белковых продуктов. В настоящее время такой генетический скрининг в группе с большим числом вовлекаемых генов предполагает применение техноло- гий массового параллельного секвенирования в формате панельного, экзомного или полногеномного секвениро- вания [3]. Проведенный нами детальный анализ генетической структуры БДН в российской популяции показал, что суммарная частота выявленных мутаций в обследованной когорте пациентов с БДН (свыше 400 больных) составила 9,5 % [4, 5]. Наиболее частыми оказались повреждения в генах SOD1 (24 % при семейном БАС и 4,6 % при спорадической форме заболевания) и C9orf72 (патологическая экспансия гексануклеотидных повторов в нем обнаружена в 1,8 % случаев БАС, все случаи спорадические) [4, 5]. Мутаций в гене TARDBP обнаружено не было, однако в группе БАС значимо чаще по сравнению с контролем встречалась делеция c.715-126delG, локализованная в 5-м интроне TARDBP - 38 % vs. 26,6 % (χ2=13,17; р=0,002). Мутации в гене ANG выявлены у 1,05 % обследо- ванных больных БАС (все случаи - спорадические). В одном спорадическом случае (0,35 %) выявлена мутация G1082A в гене DCTN1. В обследованной группе значимо чаще по сравнению с контролем встречается носительство рискового аллеля гена ATXN2 с «промежуточным» (28-33) числом копий GAC-повторов - 5 % vs. 1,7 % (χ2=3,89; р=0,0486). У российских пациентов с БАС выявлена ассоциация болезни с носительством рискового А-аллеля и гомозиготного генотипа А/А по полиморфизму -2578С/А в гене VEGF (соответственно, χ2=7,14; р=0,008 и χ2=13,46; р=0,001 при сравнении частот у больных и в контроле), что подтверждается анализом отношения шансов [4]. Нами показано, что на клеточном уровне различные мутации в генах БДН могут сопровождаться вовле- чением процессов аутофагии [6]. Это звено патогенеза БДН открывает определенные перспективы для внедрения новых биомаркеров нейродегенеративного процесса у пациентов с БДН, а также для изучения терапевтических возможностей соответствующих биологически активных соединений, воздействующих на клеточные аутофаго- цитарные механизмы. Чрезвычайно ценным инструментом в исследовании механизмов нейродегенеративных заболеваний, в том числе БДН, является генетическое репрограммирование с получением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из фибробластов или других зрелых соматических клеток [7]. В дальнейшем ИПСК могут быть дифференцированы в нейроны различной эргичности, например - в ацетилхолинэргические мото- нейроны спинного мозга. В наших исследованиях задачей была разработка протокола дифференцировки ИПСК в мотонейроны и астроциты, при этом для культивирования использовались фибробласты кожи пациентов, стра- дающих семейной формой БАС [7, 8]. Использование в исследованиях ИПСК, полученных от пациентов, имеет ряд преимуществ перед другими клеточными моделями, так как полученные из них мотонейроны идентичны по генетическому составу клеткам пациента и наиболее точно демонстрирует протекающие патогенетические собы- тия («персонализированная» клеточная модель заболевания). От двух пациентов с мутацией SOD1-Asp90Ala и от пациента с мутацией С9ORF72 нами были получены биоптаты кожи, а от одного пациента с мутацией Asp90Ala - мононуклеарные клетки крови с Целью сравнения фибробластов и лимфоцитов как источников клеточного реп- рограммирования. Свойства полученных линий ИПСК были подтверждены путем оценки морфологии и окраски на щелочную фосфатазу. Полученные из ИПСК нейрональные предшественники демонстрировали характерную спонтанную активность на мультиэлектродной матрице. Эффективность репрограммирования была сходной для производных фибробластов и мононуклеаров крови и для носителей различных мутаций в генах БДН. Основные морфологические и морфохимические свойства нейрональных культур, полученных из данных источников, также оказались сходными и подтвердили дифференцировку ИПСК в мотонейроны (рис. 1). Сложной проблемой при выявлении новых мутаций в генах является доказательство их патогенетичес- кой значимости. С Целью оценки патогенетической значимости выявленных нами кодирующих точковых мутаций в гене SOD1 был выполнен анализ in silico [9]. Молекулярное моделирование включало анализ нативного белка SOD1 и сравнение его с белком после внесения каждой из мутаций. Нами была вычислена и проанализирована трехмерная модель белка SOD1 с мутированными остатками, выявленными в ходе исследования [9]. Все обнару- женные нами мутации (рис. 2) приводили к умеренному или значительному (≥10 ккал/моль) изменению энергии белка в результате стерических конфликтов, привносимых мутацией. Одна из мутаций в непосредственной близости к активному центру - His48Arg - приводила к повы- шению энергии белка, что соответствует ухудшению конформационной стабильности. Исследование выявило существенное отличие энергии остатков Н48 (норма) и R48 (мутант): -25,9 vs. -15,1 ккал/моль. Вклад в изменение энергии остатка вносили как ван-дер-ваальсова, так и электростатическая компоненты энергии (-21,3 vs. -12,9 ккал/моль и -4,2 vs. -1,8 ккал/моль, соответственно). Несмотря на тот факт, что мутированный остаток расположен несколько в стороне от активного центра, энергия взаимодействия с ионом цинка у дикого и мутированного белка отличалась: -0,6 vs. 1,1 ккал/моль. Положительное значение энергии указывает на дестабилизирующий характер мутации в отношении взаимодействия с ионом металла в активном центре. Остальные изученные мутации при- водили к снижению энергии белка и, следовательно, - к повышению стабильности белковой молекулы SOD1. При этом максимально стабильными являлись молекулы белка с внесенными заменами Leu84Val, Asp90Ala, Glu133Gly и Leu144Phe. Такое изменение энергии белка по данным молекулярного моделирования, как правило, сопровож- дается повышенной склонностью «инертной» мутантной молекулы к мисфолдингу и внутриклеточной агрегации, что подтверждает принадлежность БАС к классу конформационных болезней центральной нервной системы, или протеинопатий [1, 10]. Таким образом, сочетанное применение исследовательских методов in vitro, in vivo, in silico позволяет эффективно изучать тонкие механизмы формирования нейродегенеративных изменений у пациентов с БДН, при- чем такая исследовательская стратегия наиболее эффективна при генетических формах заболевания. Раскрытие ключевых звеньев патогенеза может способствовать установлению новых мишеней для осуществления таргетной терапии заболевания.

About the authors

A V Rossokhin


A S Vetchinova


E V Lysogorskaya


N Yu Abramycheva


I A Kochergin


Yu A Shpilyukova


S N Illarioshkin


S M Zakiyan


V G Skrebitskiy


M N Zakharova


References

  1. Ralli, M. Amyotrophic lateral sclerosis: pathogenic mechanisms, clinical features, and therapeutic perspectives / Ralli M., Lambiase A., Artico M., de Vincentiis M., Greco A. // Isr. Med. Assoc. J. - 2019. - Vol. 21. - P. 438-443.
  2. Ingre, C. Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis / Ingre C., Roos P.M., Piehl F., Kamel F., Fang F. // Clin. Epidemiol. - 2015. - Vol. 7. - P. 181-193.
  3. Project MinE ALS Sequencing Consortium. Project MinE: study design and pilot analyses of a large-scale whole-genome sequencing study in amyotrophic lateral sclerosis // Eur. J. Hum. Genet. - 2018. - Vol. 26. - P. 1537-1546.
  4. Lysogorskaia, E.V., Genetic studies of Russian patients with amyotrophic lateral sclerosis / Lysogorskaia E.V., Abramycheva N.Y., Zakharova M.N., Stepanova M.S., Moroz A.A., Rossokhin A.V. et al. // Amyotroph. Lateral Scler. Frontotemporal Degener. - 2016. - Vol. 17. - P. 135-141.
  5. Abramycheva, N.Y. C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion in ALS patients from the Central European Russia population / Abramycheva N.Y., Lysogorskaia E.V., Stepanova M.S., Zakharova M.N., Kovrazhkina E.A., Razinskaya O.D. et al. // Neurobiol. Aging. - 2015. - Vol. 36. - P. 2908.e5-2908.e9.
  6. Кочергин, И.А. Влияние мутаций в генах SOD1 и C9orf72 на процессы аутофагии в лимфомоноцитах при боковом амиотрофическом склерозе / Кочергин И.А., Шпилюкова Ю.А., Лысогорская е.В., Абрамычева Н.Ю., Захарова М.Н., Иллариошкин С.Н. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2019. - №5. - С. 612-615.
  7. Ustyantseva, E.I. Aplatformforstudyingneurodegenerationmechanismsusinggeneticallyencodedbiosensors/ Ustyantseva E.I., Medvedev S.P., Vetchinova A.S., Minina J.M., Illarioshkin S.N., Zakian S.M. // Biochemistry (Mosc). - 2019. - Vol. 84. - №3. - Р.299-309.
  8. Честков, И.В. Система для изучения бокового амиотрофического склероза на основе пациент-специфических индуцированных плюрипотентных стволовых клеток / Честков И.В., Васильева Е.А., Иллариошкин С.Н., Лагарькова М.А., Киселев С.Л. // Acta Naturae. - 2014. - Том 6. - №1. - С. 58-66.
  9. Лысогорская, е.В. Мутации в гене SOD1 при боковом амиотрофическом склерозе: возможности метода молекулярного моделирования / Лысогорская е.В., Россохин А.В., Абрамычева Н.Ю., Захарова М.Н., Иллариошкин С.Н. // Мол. биология. - 2013. - №5. - С. 861-867.
  10. Иллариошкин С.Н. Конформационные болезни мозга. М.: Янус-К, 2003.

Statistics

Views

Abstract - 29

Cited-By


PlumX

Dimensions

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2019 Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies