Старение и омоложение резидентных стволовых клеток — новый путь к активному долголетию?

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Старение организма характеризуется постепенным упадком многих физиологических функций: снижением метаболической активности, увеличением массы жировой ткани и уменьшением мышечной массы [1], нарушением циркадианных циклов сна/бодрствования и ослаблением иммунной системы [2], снижением когнитивных функций, дисфункцией сетчатки и пр. [3]. Достижения современного здравоохранения увеличили продолжительность жизни в развитых странах, поэтому проблема сохранения высокого качества жизни в процессе старения становится одной из самых актуальных.

Как любой биологический процесс, старение определяется комплексным воздействием генетических программ и факторов внешней среды. Как эндогенные, так и экзогенные воздействия на старение реализуются через биологические механизмы, одним из которых является модификация хроматина, на основании которой разработаны так называемые эпигенетические часы [4]. Концепция эпигенетических часов была создана в 2013 г. G. Hannum и соавт. [5] и S. Horvath [6], показавших, что профиль метилирования ДНК является одним из наиболее точных маркеров клеточного старения. Дальнейшие исследования показали, что существует многоуровневая генетически детерминированная программа, реализующаяся с помощью модификации хроматина путем метилирования динуклеотидов CG или CPG-островков ДНК [7]. Эта программа и определяет эпигенетическое старение клеток и организма в целом.

Метилирование CPG-островков в настоящее время считается, пожалуй, наиболее каноническим эпигенетическим признаком старения [8, 9]. Суммарный уровень метилирования ДНК при этом с возрастом может снижаться, однако островки CpG, особенно в генах-мишенях polycomb-белков, способных ремоделировать хроматин, генов-регуляторов транскрипции, пролиферации и клеточной дифференцировки гиперметилируются [10]. Изменения в метилировании CpG, отражающие эпигенетический возраст, можно анализировать с использованием различных подходов, включая полногеномное секвенирование одиночных клеток, позволяющее анализировать метилом в отдельных клетках в различных тканях и изучать их эпигенетические особенности [6, 11–14].

Эпигенетические часы — это регрессионная модель, связывающая изменение профиля метилирования CpG-островков с биологическим возрастом [5, 15]. В последнее десятилетие такие прогностические модели, основанные на уровнях метилирования ДНК (DNAm), создаются на базе машинного обучения, и эта технология поистине произвела революцию в области изучения старения. Эпигенетические часы, построенные на основе метилирования ДНК, в настоящее время лучше оценивают фактический хронологический возраст, чем любые другие транскриптомные и протеомные данные, включая длину теломер [16]. Эпигенетические часы, изначально созданные для определения хронологического возраста, теперь могут интегрировать и прогнозировать различные показатели биологического старения и риска заболеваний, что определяет их клиническую значимость [16].

Первые эпигенетические часы были разработаны G. Hannum и соавт. [5] на основе оценки 71 CpG из ДНК мононуклеаров периферической крови. Следующие, более точные во многих аспектах пан-тканевые эпигенетические часы были созданы S. Horvath [6] на основе оценки метилирования 353 CpG в ДНК, полученной из нескольких нормальных и опухолевых тканей. Интересно, что недавно было разработано несколько пан-тканевых часов для млекопитающих, которые могут с впечатляющей точностью определять эпигенетический возраст практически в любой ткани млекопитающих [17].

Истинный биологический возраст определяется под воздействием многих внешних и внутренних факторов, поэтому наиболее современные эпигенетические часы либо специализируются по тканям организма, либо основываются на анализе не только профиля метилирования ДНК, но и различных других показателей для более точного определения биологического возраста клеток и скорости старения (например, PhenoAge, GrimAge) [8, 18]. В частности, часы GrimAge помимо анализа профиля метилирования включают определение в сыворотке крови уровень ингибитора активатора плазминогена-1 (PAI-1) и фактора роста и дифференцировки-15 (GDF15), учет курения и коморбидного состояния, что способствует более точному прогнозу продолжительности и качества жизни [18]. В свете развития регенеративной медицины, эпигенетические часы представляют особый интерес, поскольку эти модели могут обнаруживать даже небольшие изменения биологического возраста в результате различных интервенций, направленных на увеличение продолжительности жизни или перепрограммирование клеток [19].

Недавно разработан новый метод анализа профилей DNAm scAge, позволяющий определить эпигенетический возраст отдельных клеток [20]. Этот метод воспроизводит хронологический возраст ткани в среднем, а также раскрывает внутреннюю эпигенетическую гетерогенность, существующую между клетками. В результате авторы обнаружили, что совокупность нескольких прогнозов по отдельным клеткам дает точный средний показатель возраста конкретной ткани. Эти результаты предполагают высокую гетерогенность процесса старения даже в пределах одной ткани в зависимости от многих эпигенетических факторов, типа и биологических особенностей клеток (стволовые, пролиферирующие, терминально дифференцированные и пр.). Авторы исследования также предположили, что некоторые клетки подвергаются ускоренному или замедленному эпигенетическому старению, что ранее было невозможно установить [20]. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что в процессе старения клеток и тканей эпигенетические часы в каждой клетке или группе клеток, вероятно, «тикают» независимо.

«ЖИЗНЬ НЕВОЗМОЖНО ПОВЕРНУТЬ НАЗАД, И ВРЕМЯ НИ НА МИГ НЕ ОСТАНОВИШЬ»?

Сохранение молодости и продление активной жизни всегда было актуально для человечества. Развитие концепции эпигенетических часов позволило на новом уровне исследовать процессы старения как для отдельных клеток и тканей, так и для организма в целом. Обнаружено, что определенные терапевтические воздействия могут изменять показания эпигенетических часов в сторону уменьшения биологического возраста (при неизменном хронологическом) и увеличения предсказанной продолжительности жизни. В частности, в исследовании TRIIM (Thymus Regeneration, Immunorestoration, and Insulin Mitigation) показано, что терапия в течение нескольких месяцев рекомбинантным гормоном роста человека (recombinant human growth hormone, rhGH) вместе с дигидроэпиандростероном (dehydroepiandrosterone, DHEA) и метформином у практически здоровых мужчин 51–65 лет способствует замедлению старения, что в итоге сопровождается достоверным уменьшением эпигенетического возраста по данным предиктора GrimAge [21].

В недавнем исследовании на крысах [22] с помощью шести различных эпигенетических часов, разработанных на основе данных о метилировании ДНК, было показано, что инфузия компонентов плазмы от молодых крыс старым в течение 5 мес приводит к нормализации биохимических параметров старых крыс, приближая их к показателям молодых животных, при этом эпигенетический возраст крови и тканей печени и сердца уменьшился почти в 3 раза (с возраста 25 мес до возраста 7 мес). Другие показатели клеточного старения, не связанные с эпигенетическими часами, также достоверно уменьшались при переливании компонентов плазмы, что свидетельствовало об эффекте «омоложения».

Несмотря на то, что приведенные выше результаты выглядят весьма впечатляющими, остается дискутабельным вопрос, насколько подобные подходы могут влиять на эпигенетический возраст организма в целом, и не являются ли такие эффекты обратимыми при отмене фармакологической поддержки. Этот вопрос особенно актуален с учетом выраженной гетерогенности процессов старения в различных тканях, что во многом обусловлено особенностями функционирования резидентных стволовых клеток. Именно наличие ниш стволовых клеток определяет регенеративный потенциал органов и тканей, а их функциональное состояние, несомненно, оказывает влияние на эпигенетический возраст. В этой связи старение стволовых клеток, равно как и подходы по их «омоложению», требуют отдельного рассмотрения.

РЕЗИДЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И СТАРЕНИЕ

Регенерация почти всех органов и тканей осуществляется при участии резидентных стволовых клеток (СК), характеризующихся способностью к самообновлению и дифференцировке в различные клеточные типы за счет асимметричного деления. Первоначально считалось, что СК не подвержены репликативному старению, однако в настоящее время накоплено достаточно данных о том, что они, как и другие клетки, с возрастом накапливают метаболические и генетические повреждения и подвергаются воздействию возрастных эпигенетических факторов [23]. Кроме того, критерием старения органов и тканей является уменьшение доли стволовых клеток в соответствующих нишах [23].

Рассмотрим подробнее старение основных видов стволовых клеток.

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) находятся в костном мозге взрослых млекопитающих и отвечают за кроветворение. В процессе старения ГСК снижается их клональное разнообразие за счет уменьшения интенсивности пролиферации отдельных клонов, что приводит к обеднению клонального состава всех последующих клеточных генераций [24]. Несмотря на то, что общая доля ГСК не изменяется или даже увеличивается, обеднение клонального состава свидетельствует об уменьшении количества функционально активных клонов ГСК [25, 26]. Другой определяющей характеристикой старения ГСК является смещение профиля их дифференцировки в сторону миелоидного ряда за счет уменьшения лимфоидного ряда [27]. Эти данные хорошо согласуются с представлениями об иммунологическом старении, сопровождающемся снижением адаптивного клеточного иммунитета вследствие обеднения репертуара TCR-лимфоцитов [21]. Возрастные изменения, затрагивающие все звенья лимфоидного ростка, и смещение дифференцировки в сторону миелогенеза определяют, в частности, более высокую частоту миелобластных лейкозов у лиц старшего возраста [28, 29]; эти же изменения, вероятно, являются причиной возрастного роста онкологической патологии вообще.

Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (МСК) находятся в костном мозге, жировой ткани и ряде других органов и тканей взрослого человека и дифференцируются во множество клеточных типов, таких как фибробласты, костные, хрящевые, жировые, мышечные клетки и другие клетки стромы, и играют важную роль в регенерации перечисленных тканей [30, 31]. Функционально старение МСК характеризуется уменьшением их пролиферативной активности и, как следствие, снижением их доли в костном мозге и других тканях, а также снижением их способности к дифференцировке [32]. Признаки старения МСК включают появление гранулярной морфологии на фоне снижения секреции различных молекул, что называется секреторным фенотипом, связанным со старением, или SASP (senescence-associated secretory phenotype) [33]. Кроме того, старение МСК сопровождается изменениями ядерной морфологии и образованием отчетливой структуры хроматина, называемой гетерохроматическими фокусами, ассоциированными со старением, или SAHF (senescence associated heterochromatic foci) [34]. В настоящее время старение МСК оценивают путем измерения активности β-галактозидазы, длины теломер, маркеров экспрессии генов, метилирования CPG и других эпигенетических маркеров [35].

Стволовые клетки кишечника (СКК) поддерживают регулярное обновление эпителия желудочно-кишечного тракта. Большая часть наших знаний о старении СКК получена из исследований на дрозофиле, где СКК легко идентифицировать по экспрессии фактора транскрипции улиток (Esg) и дельта лиганда Notch (D1). Примечательно, что в процессе старения количество клеток с иммунофенотипом СКК увеличивается в несколько раз, что сопровождается снижением их функции [36, 37]. Это увеличение связывают с нарушением процесса самообновления, сопровождающимся частичной дифференцировкой СКК с сохранением некоторых маркеров стволовых клеток [36]. У млекопитающих существуют две взаимопревращаемые популяции СКК: пролиферативно активные Lgr5-экспрессирующие клетки, локализованные в основании крипты, и покоящиеся стволовые клетки, расположенные над основанием крипты [38]. Эксперименты с гамма-облучением показали, что, хотя кишечник с возрастом становится более чувствительным к повреждению, общее количество клонообразующих единиц увеличивается [39]. Предполагают, что старение СКК человека, сопровождающееся нарушением их самообновления и дифференцировки, является одним из этиологических факторов гиперплазии слизистой кишечника, которая, в свою очередь, приводит к увеличению заболеваемости колоректальным раком с возрастом [40].

Стволовые сателлитные клетки обеспечивают регенерацию поврежденных скелетных мышц [41, 42]. В отличие от ГСК и СКК, количество сателлитных клеток заметно снижается с возрастом [43, 44]. Скорость пролиферации in vitro и потенциал приживления и регенерации сателлитных клеток после трансплантации in vivo также снижаются с возрастом [45–47]. Более того, как и ГСК, старые сателлитные клетки демонстрируют искаженный потенциал дифференцировки, в результате чего они дифференцируются в сторону образования фибробластов, а не миобластов, в основном из-за изменений в передаче сигналов Wnt и TGF-β (transforming growth factor beta) [48, 49]. Гетерохронная трансплантация сателлитных клеток от старых мышей к молодым указывает на то, что механизмы, лежащие в основе изменений, в потенциале регенерации сателлитных клеток включают изменения в доступности лигандов суперсемейства Wnt, Notch, FGF (fibroblast growth factors) и TGF-β [48, 50, 51], а также изменения в передаче сигналов цитокинов через путь JAK-STAT (janus kinase, signal transducer and activator of transcription proteins) [52]. Помимо изменений микроокружения, дефекты самообновления, усиление индуцированной стрессом передачи сигналов p38-MAPK связаны со старением самих сателлитных клеток [45, 46], и эти изменения не отменяются после трансплантации в молодую среду [46, 47]. Можно предположить, что необратимые изменения сателлитных клеток лежат в основе старческой саркопении, в разной степени присутствующей у 100% пожилых и престарелых людей.

Нейральные стволовые клетки. Нейрогенез во взрослом мозге млекопитающих происходит на протяжении всей жизни в субвентрикулярной (subventricular zone, SVZ) и субгранулярной (subgranular zone, SGZ) зонах головного мозга [53]. Основные функции нейрогенеза во взрослом мозге — регенерация ольфакторных клеток и образование новых нейронов и глиоцитов в структурах, осуществляющих функционирование памяти и другие когнитивные процессы, поддержание нейрональной пластичности в целом.

Старение — продолжительный и прогредиентный процесс с нарастающими нарушениями гомеостаза, затрагивающими все ниши резидентных стволовых клеток, в том числе в головном мозге [4]. Количество нейральных стволовых клеток (НСК), как и многих других резидентных стволовых клеток взрослого организма, уменьшается с возрастом, что в свою очередь сопровождается снижением уровня нейрогенеза, вплоть до его полной остановки у высших приматов и человека, и, как следствие, ухудшением когнитивных функций. Это связано прежде всего с уменьшением пула пролиферирующих НСК [54].

Новейшие исследования показали, что в процессе старения мозга в SVZ и SGZ происходит уменьшение общего количества пролиферирующих НСК, имеющих фенотип Nestin + Mcm2+, и увеличение доли покоящихся НСК, имеющих фенотип Nestin + MCM2- и находящихся в состоянии ареста клеточного цикла [55], т.е. снижение нейрогенеза с возрастом может быть обусловлено не только абсолютной убылью НСК, но и переходом НСК в покоящееся состояние вследствие возрастного снижения активирующих сигналов. Состояние покоя для НСК не означает переход в некий анабиоз: с точки зрения активности синтеза белков внеклеточного матрикса и сигнальных молекул, покоящаяся клетка может быть даже более активна, чем пролиферирующая [56]. Кроме того, состояние покоя имеет важное биологическое значение для сохранения пула стволовых клеток на протяжении всей жизни.

В экспериментальных исследованиях обнаружено, что НСК в SVZ старых мышей становятся менее чувствительны к сигналам активации, однако, активировавшись, старые НСК не отличаются от юных по уровню пролиферации и дифференцировки [57]. Возрастные изменения транскриптома активированных старых НСК также не были обнаружены, что позволяет предположить, что старение ниш стволовых клеток в меньшей степени затрагивает покоящиеся на протяжении жизни НСК по сравнению с их окружением. Старение микроокружения ниши стволовых клеток проявляется снижением сывороточного уровня важных сигнальных молекул, таких как инсулин и инсулиноподобный фактор роста (insulin-like growth factor, IGF), снижением секреторной активности хориоидного сплетения, локальным изменением активности сигнальных путей, в частности инактивацией пути Wnt [57], изменением соотношения IGF-1/BMP5, что приводит к увеличению доли покоящихся НСК [56, 57].

С точки зрения развития концепции активного долголетия, вселяет оптимизм тот факт, что функции «старых» НСК могут быть быстро нормализованы до состояния «молодых» при стимуляции in vitro. Так, кондиционированная среда от клеток хориоидного сплетения молодых мышей стимулирует пролиферацию старых НСК, и наоборот, среда от клеток хориоидного сплетения старых мышей инактивирует пролиферацию юных НСК вследствие изменения соотношения BMP5 и IGF1 [58]. Эксперименты с гетерохронным парабиозом (объединение кровеносных систем молодых и старых мышей) показали, что перфузия мозга старых мышей кровью молодых приводит к восстановлению уровней IGF-1, GH, Wnt3, TGF-β или GDF11 у старых мышей до «молодого» уровня, что существенно активирует нейрогенез и когнитивные функции [59–61]. Интересно, что ряд ассоциированных с возрастом факторов так или иначе связан с иммунным ответом и воспалением. Помимо уже упомянутого TGF-β, который наряду с влиянием на нейрогенез является индуктором Т-клеток, отмечается роль β2-микроглобулина в старении ниш НСК и возрастном ухудшении когнитивных функций [58].

Важные данные были получены при NGS-секвенировании транскриптомов отдельных клеток в стволовых нишах молодых и старых мышей [62]. Это прецизионное исследование обнаружило возрастные изменения транскриптома эндотелиальных клеток и микроглии, а также, что интересно, увеличение T-клеточной инфильтрации в стареющих нишах стволовых клеток. Обнаруженные в мозге T-клетки по репертуару Т-клеточных рецепторов отличались от Т-клеток в периферической крови тех же старых мышей, что позволило авторам предположить, что, возможно, они активированы какими-то церебральными антигенами [62]. Т-клетки в старом мозге экспрессировали γ-интерферон, при этом субпопуляции НСК, отвечающие на интерферон, характеризовались сниженным уровнем пролиферации in vivo. Эксперименты in vitro также показали, что Т-клетки могут ингибировать пролиферацию НСК при кокультивировании, в том числе посредством секреции интерферона. Таким образом, иммунные механизмы могут играть свою особую роль в старении ниш стволовых клеток и в возрастном снижении когнитивных функций [62].

Несмотря на то, что транскриптомные исследования не обнаружили обусловленных возрастом изменений генетической экспрессии в старых НСК, старение затрагивает и непосредственно НСК, что проявляется биохимическими нарушениями, в частности дисфункцией лизосом, проявляющейся нарушением деградации белков и внутриклеточной аккумуляцией белковых агрегатов (в частности β-амилоида при болезни Альцгеймера) [57]. Лизосомальная активность НСК снижается c возрастом, что приводит к аккумуляции белковых агрегатов и потери способности к активации. Стимуляция функции лизосом предотвращает это связанное со старением снижение активности [63].

A. Ibrayeva и соавт. [55] показали, что популяция активированных НСК в зубчатой извилине гиппокампа значительно уменьшается с возрастом, а также обнаружили определенные молекулярные признаки старения, в числе которых было увеличение экспрессии тирозинкиназы Abl1, являющейся протоонкогеном. Примечательно, что ингибитор Bcr-Abl-тирозинкиназы — противоопухолевый препарат иматиниб может, по мнению авторов, частично восстанавливать функцию стареющих НСК и замедлять процесс их старения.

Изменения в нишах НСК при старении человека гораздо менее изучены, чем аналогичные процессы у лабораторных животных, вместе с тем подавляющее большинство исследователей считает, что взрослый нейрогенез драматически снижается с возрастом, начиная от первого года постнатальной жизни [64–66].

Стволовые клетки кожи. Кожа содержит несколько типов стволовых клеток, включая стволовые клетки базального слоя, обеспечивающие регенерацию эпителия, стволовые клетки волосяных фолликулов (hair follicle stem cells, HFSC), которые поддерживают рост волос, и стволовые клетки меланоцитов, которые генерируют, собственно, меланоциты, продуцирующие пигмент. Волосяные фолликулы проходят через фазы роста, регрессии и покоя. Наиболее выраженное изменение при старении — это увеличение периода покоя, в некоторых случаях — полная остановка роста волос и потеря волосяных фолликулов (алопеция) [67]. Несмотря на естественную убыль волос при старении, количество HFSC не снижается с возрастом [68]. Вместо этого наблюдается потеря их функции, которая лежит в основе удлинения периодов покоя. В отличие от HFSC, количество стволовых клеток меланоцитов в коже с возрастом резко снижается. Это снижение связано не с апоптозом, а с эктопической дифференцировкой и нарушением самообновления стволовых клеток [69]. Ионизирующее излучение и генотоксический стресс усиливают дифференцировку меланоцитов, что, в частности, является основной причиной возрастного поседения волос [70].

Герминальные стволовые клетки. У млекопитающих мужская зародышевая линия поддерживается сперматогониальными стволовыми клетками (spermatogonial stem cells, SSCs), количество которых прогрессивно уменьшается при старении [71, 72]. Несмотря на убыль SSCs, в подавляющем большинстве видов млекопитающих, включая высших приматов, самцы остаются фертильными на протяжении всей жизни. В отличие от самцов, оогенез самок из оогониев в развивающемся яичнике у большинства млекопитающих, за исключением несколько видов летучих мышей, кустарниковой собаки и шиншиллы, прекращается до рождения [73, 74]. Некоторые исследователи предположили, что эти виды и даже, возможно, все остальные млекопитающие обладают оогониальными стволовыми клетками (oogonial stem cells, OSC), способными постнатально генерировать ооциты. OSCs были выделены от мышей и макак-резусов, которые генерируют ооциты in vitro, и в случае мышей были использованы для создания трансгенных детенышей [75, 76]. OSCs также были описаны в яичниках взрослых людей, которые могут образовывать подобные ооцитам клетки при трансплантации в ткань яичников [77]. Однако другие группы не нашли доказательств постнатального оогенеза [78] или безуспешно пытались выделить OCS [79].

РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК С УМЕНЬШЕНИЕМ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОГО ВОЗРАСТА

Экспрессия четырех факторов транскрипции из коктейля Яманака (OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC; OSKM) превращает соматические клетки в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPSCs) [80]. Перепрограммирование происходит посредством глобального ремоделирования хроматина, который в конечном итоге возвращает клетку в плюрипотентное состояние, соответствующее эмбриональной стволовой клетке, в том числе по паттерну метилирования ДНК [81]. С одной стороны, это открывает большие перспективы для клеточной терапии: получив аутологичные IPSCs, их можно дифференцировать в нужный клеточный тип и таким образом провести «омоложение» клеток, тканей и органов.

Транскриптомный анализ в формате single cell в процессе получения IPSCs позволил обнаружить некоторые интересные закономерности [82–84]. Так, в процессе клеточного репрограммирования выделили две фазы. Стохастическая фаза характеризуется дифференциальной экспрессией генов, участвующих в клеточном цикле (например, Ccnb1 и Cdkn2b), мезенхимально-эпителиальном переходе (например, Snai1 и Cdh1), а также в подавлении генов, связанных с адгезией и дифференцировкой клеток (например, Col1a1, Fbln5 и Mmp14) [83]. За этими первоначальными изменениями следует вторая фаза — детерминированная или иерархическая, характеризующаяся прогрессирующей активацией мастер-генов плюрипотентности (Nanog, Oct4, Sox2, c-Mic, Dnmt3L и др.) [83]. Эпигенетическое ремоделирование начинается уже на первой фазе репрограммирования и характеризуется модификацией гистонов, таких как H3K4me3 и H3K27me3, за которым следуют изменения профиля метилирования ДНК, в том числе в генах Nanog, Oct4 и Rex1.

N. Olova и соавт. [85] показали, что даже при частичном репрограммировании, при котором клетка не достигает состояния плюрипотентности, обнуление возрастных эпигенетических сигнатур происходит в первые 10 дней репрограммирования — в период повышенной активности генов плюрипотентности, ранней экспрессии NANOG, SALL4, ZFP42, TRA-1-60, UTF1, DPPA4 и LEFTY2. Схожие результаты были продемонстрированы в работе A. Ocampo и соавт. [86], в которой авторы с помощью циклической индукции OKSM провели неполное репрограммирование клетки. В результате они показали обнуление эпигенетического возраста до раннего постнатального состояния без потери специализации клетки. Транзиторная экспрессия всего двух трансформирующих факторов из коктейля Яманаки — SOX2 и c-MYC — оказалась достаточной, чтобы полученная в результате популяция клеток по возрастным сигнатурам была сравнима с популяцией, дифференцированной из эмбриональных стволовых клеток [87]. Омоложение репрограммированных клеток было продемонстрировано на уровне измерения теломер [88], омоложения митохондрий и пр. [89, 90]. Таким образом, частичное репрограммирование без достижения плюрипотентной стадии может быть способом эпигенетического омоложения клеток и тканей.

В литературе описаны способы репрограммирования с получением IPSCs in vivo в экспериментах на мышах [91], что теоретически делает возможным выполнение частичного репрограммирования с «омолаживающим» эффектом in vivo. Так, показано, что циклическая экспрессия факторов Яманаки может увеличивать продолжительность жизни прогероидных мышей (progeria mice) и улучшать клеточную функцию у мышей дикого типа [86]. Альтернативный подход к репрограммированию in vivo продемонстрировал обратимость связанных со старением изменений в ганглиозных клетках сетчатки и возможность восстановления зрения на модели глаукомы на мышах [19]. Совсем недавно было показано, что транзиторная экспрессия транскрипционных факторов in vitro обращает вспять старение фибробластов и хондроцитов человека, включая обратные изменения эпигенетических часов, уменьшение экспрессии провоспалительных генов и «омоложение» регенеративного потенциала [92].

На сервисе bioRxiv доступна совсем недавняя публикация D. Gill и соавт. [93], которые заявляют, что разработали беспрецедентную технологию омоложения с помощью транзиторной экспрессии транскрипционных факторов, позволяющую омолаживать человеческие фибробласты на 30 лет. Технология, названная MPTR (от англ. Maturation Phase Transient Reprogramming) включает трансфекцию полицистронной кассеты с генами Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc и GFP под контролем доксициклинового промотора. Гены экспрессировались эктопически до достижения фазы созревания, после чего экспрессию выключали. Показано, что MPTR значительно омолаживает все измеренные молекулярные признаки старения, включая профиль метилирования, без потери исходного клеточного фенотипа.

Перечисленные выше исследования позволяют предполагать, что в будущем станет возможной технология «омоложения» стволовых клеток ex vivo с последующей их трансплантацией в резидентные стволовые ниши, в результате чего, вероятно, будет происходить кардинальное омоложение органов и тканей.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ОМОЛОЖЕНИЮ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Рассмотрим подходы к омоложению стволовых клеток на примере МСК как одного из наиболее исследованных в регенеративной медицине видов стволовых клеток. Особый интерес к МСК связан с тем, что наряду с доступностью и относительной простотой наработки (propagation) [94] МСК обладают значительным паракринным терапевтическим потенциалом, что в сумме обусловило их широкое клиническое применение [95, 96]. Эффективность МСК показана при лечении различных заболеваний, включая болезнь трансплантат против хозяина [97], болезнь Крона [98], сахарный диабет [99], рассеянный склероз [100], инфаркт миокарда [101] и др. Как мы уже отмечали, функциональная активность МСК значительно снижается с возрастом. В попытке «омоложения» МСК предпринимались различные генетические модификации, обработка микроРНК и некодирующими РНК [102], прекондиционирование в условиях гипоксии или в присутствии различных цитокинов и пр. [102, 104]. Многие исследователи применяют МСК в качестве объекта частичного репрограммирования факторами плюрипотентности, так как описано в предыдущем разделе [104–107].

C. Liang с соавт. [108] показали, что дефицит гена CLOCK ускоряет старение hMSC, тогда как сверхэкспрессия CLOCK даже в транскрипционно неактивной форме омолаживает старые hMSC. Опираясь на идею, что CLOCK образуют комплексы с белками ядерной мембраны и KRAB-ассоциированным белком 1 (KAP1) и таким образом стабилизируют гетерохроматин, авторы с помощью редактирования генома CRISPR/Cas9 повысили уровень экспрессии CLOCK в стареющих MSC, что привело к их омоложению и способствовало регенерации хряща у мышей.

В недавнем исследовании H. Jiao и соавт. [109] выполняли транскриптомный анализ обычных МСК и «омоложенных» МСК, проведенных через стадию плюрипотентности. Обнаружено, что в последних снижен уровень экспрессии GATA-связывающего белка 6 (GATA6), экспрессия которого ассоциирована c развитием некоторых видов химиорезистентных карцином поджелудочной железы [110]. Уровень экспрессии GATA6 обратно коррелирует с активностью сигнального пути SHH (sonic hedgehog) и уровнем экспрессии forkhead box P1 (FOXP1), про который известно, что он замедляет старение МСК [111]. Таким образом, был сделан вывод, что нокаут GATA6 может быть применен для омоложения МСК ex vivo.

Недавно L. Deng и соавт. [112] получили экспериментальную модель синдрома Ди Георга (DiGeorge) на МСК с дефицитом критической области 8 (DiGeorge syndrome critical region 8, DGCR8) с фенотипом ускоренного старения. DGCR8 поддерживает организацию гетерохроматина, взаимодействуя с белком ядерной оболочки Lamin B1 и ассоциированными с гетерохроматином KAP1 и гетерохроматиновым белком 1 (heterochromatin protein 1, HP1), регулируя таким образом старение МСК. Аналогичным образом было обнаружено, что yes-ассоциированный белок (YAP) также играет важную роль в замедлении старения. L. Fu и соавт. [111] генерировали YAP-дефицитные МСК с фенотипом преждевременного клеточного старения и обнаружили, что YAP кооперируется с транскрипционным фактором домена ТЕА (TEAD), чтобы активировать антиэйджинговый фактор FOXD1.

Х. Ren и соавт. [113] получили CBX4-дефицитные МСК и показали, что CBX4 противодействует старению МСК через поддержание ядрышкового гомеостаза за счет рекрутирования ядерного белка фибрилларина и компонента гетерохроматина KAP1 к ядрышковой рДНК для ее стабилизации, тем самым ограничивая чрезмерную экспрессию рРНК и замедляя клеточное старение. Генная терапия с помощью лентивирусной трансдукции гена DGCR8 эффективно ослабляет старение МСК, о чем свидетельствовало подавление маркеров клеточного старения и факторов воспаления [112]. По аналогии, опосредованный лентивирусом перенос генов YAP, FOXD1 или CBX4 также омолаживает старые МСК [110, 113]. Таким образом, коррекция экспрессии определенных генов в резидентных стволовых клетках может привести к их омоложению, что в свою очередь может способствовать активации репарации и омоложению соответствующей ткани организма.

Несколько исследований были направлены на изучение эпигенетической модуляции стареющих МСК. Как мы уже отмечали выше, старение сопровождается селективным метилированием GPG-островков ДНК. Действительно, было обнаружено, что экспрессия ряда ДНК-метилтрансфераз увеличивается во время репликативного старения и коррелирует с гиперметилированием CPG в старых МСК [114]. Выключение метилирования ДНК с помощью ингибитора ДНК-метилтрансфераз 5-азацитидина, обращает вспять стареющий фенотип МСК. При этом наблюдается снижение накопления активных форм кислорода (АФК), улучшение активности супероксиддисмутазы и увеличения соотношения BCL-2/BAX [115].

Несколько исследований показали, что старение МСК можно обратить вспять путем модуляции генерации АФК и активации антиоксидантных систем. Было показано, что аскорбиновая кислота ингибирует производство АФК за счет активации передачи сигналов AKT/mTOR в МСК [116]. Другая группа показала, что железосодержащий белок лактоферрин ингибирует продукцию АФК, индуцированную перекисью водорода, и подавляет активацию каспазы-3 и AKT [117]. МСК, предварительно обработанные природным антиоксидантом растительного происхождения, полученного из Cirsium setidens, могут ингибировать продукцию АФК и снижать экспрессию фосфорилированной митоген-активированной протеинкиназы p38, N-концевой киназы c-Jun и p53 [118].

Нарушение функции митохондрий часто рассматривается как типичный признак стареющих клеток. Мелатонин может замедлить старение МСК за счет активации митохондриальной функции посредством вовлечения 70 кДа белка 1L теплового шока (HSPA1L) [119]. Известно, что HSPA1L связывается с COX4IA, белком митохондриального комплекса IV, что приводит к увеличению потенциала митохондриальной мембраны и активности антиоксидантных ферментов [119]. Снижение карнитин пальмитоилтрансферазы 1A (CPT1A) также активирует митохондриальное дыхание и обращает вспять старение МСК [120]. Аналогичным образом было показано, что повышение уровня FGF21 улучшает функцию митохондрий, омолаживая стареющие МСК, повышая митохондриальную динамику [121].

Немало исследований в регенеративной медицине посвящено применению экзосом, содержащих различные биологически активные вещества, как от МСК, так и от других типов стволовых клеток. В ряде исследований экзосомы применены в том числе и для омоложения клеток. Так, внеклеточные везикулы, полученные из эмбриональных стволовых клеток (ESC-Exos), использовали в качестве фактора омоложения МСК и показали, что омолаживающий эффект опосредован через активацию сигнального пути IGF1 [122]. Также было продемонстрировано, что использование ESC-Exos омолаживает эндотелиальные клетки, усиливает ангиогенез, снижает уровень АФК и способствует регенерации пролежней у стареющих мышей [123, 124]. Применение экзосом, в отличие от репрограммированных клеток, не сопровождается никакими онкологическими рисками и поэтому представляется весьма перспективным и интересным направлением в антиэйджинге.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Старение — сложный генетически детерминированный процесс, реализация которого имеет свои особенности как на клеточном уровне в покоящихся, пролиферирующих, дифференцированных и стволовых клетках, так и на органном и организменном уровнях. Такой большой «оркестр», каким является организм млекопитающего, для синхронизации процессов старения и адекватного включения генетических программ в ответ на внешние факторы старения в клетках, органах и тканях не может не иметь общего «дирижера». На эту роль может претендовать генетически регулируемая система метилирования ДНК, составляющая основу эпигенетических часов. Старение органов и тканей во многом обусловлено возрастными изменениями резидентных стволовых клеток. Последние представляют собой привлекательную мишень для клеточного омоложения, поскольку могут быть отобраны, культивированы ex vivo, модифицированы и вновь возвращены в резидентные ниши. Можно предполагать, что омоложение столовых клеток с уменьшением их эпигенетического возраста может способствовать ювенилизации соответствующих органов и тканей.

Тесная взаимосвязь старения, регенерации и онкогенеза между собой и с функционированием ниш резидентных стволовых клеток требует дальнейших прецизионных исследований, результатом которых, мы уверены, станет создание эффективной стратегии антиэйджинга и продление активной жизни человека.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. В.П. Баклаушев — концепция обзора, написание и редактирование рукописи; Е.М. Самойлова — сбор материала, написание и редактирование рукописи; В.А. Кальсин, Г.М. Юсубалиева — сбор материала, редактирование рукописи. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Author contribution. V.P. Baklaushev — review concept, manuscript writing and editing; E.M. Samoylova — collection of material, manuscript writing and editing; V.A. Kalsin, G.M. Yusubalieva — collection of material, manuscript editing. The authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания ФМБА России (шифр «Репрограммирование»).

Funding source. The work was carried out within the framework of the state task of the FMBA of Russia (code “Reprogramming”).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Об авторах

Владимир Павлович Баклаушев

Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России; Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта; Научно-исследовательский институт пульмонологии Федерального медико-биологического агентства

Email: baklaushev.vp@fnkc-fmba.ru
ORCID iD: 0000-0003-1039-4245
SPIN-код: 3968-2971
https://fnkc-fmba.ru/about/komanda-upravleniya/

доктор медицинских наук,  заместитель генерального директора по научной работе и медицинским технологиям

Россия, 115682, Москва, Ореховый бульвар, д. 28; Москва; Москва

Екатерина Михайловна Самойлова

Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России; Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта

Email: samoyket@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0485-6581
SPIN-код: 3014-6243

научный сотрудник

Россия, 115682, Москва, Ореховый бульвар, д. 28; Москва

Владимир Анатольевич Кальсин

Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России; Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта

Автор, ответственный за переписку.
Email: vkalsin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2705-3578
SPIN-код: 1046-8801

научный сотрудник лаборатории клеточных технологий

Россия, 115682, Москва, Ореховый бульвар, д. 28; Москва

Гаухар Маратовна Юсубалиева

Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России; Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта

Email: gaukhar@gaukhar.org
ORCID iD: 0000-0003-3056-4889
SPIN-код: 1559-5866

к.м.н., ст. науч. сотр. лаборатории клеточных технологий

Россия, 115682, Москва, Ореховый бульвар, д. 28; Москва

Список литературы

Дополнительные файлы