The influence of etiological factors on immunoreactivity in patients with community-acquired pneumonia

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Внебольничная пневмония относится к числу наиболее распространенных острых инфекционных заболеваний. По данным Росздравнадзора, в России более чем за 30 лет (с 1985 г.) заболеваемость пневмонией практически не менялась (350–500 на 100 тыс. населения), однако в течение последних 3 лет отмечается ее рост. Внебольничная пневмония занимает 4–6-е место среди всех причин смертности и 1-е место среди инфекционных заболеваний [1]. Важным является тот факт, что, несмотря на большой арсенал лекарственных средств, используемых для лечения данной патологии, смертность от внебольничной пневмонии не снижается.

Как известно, при внебольничной пневмонии имеет место взаимодействие этиологического фактора и иммунной системы. Этиологический агент воздействует на факторы иммунной системы, а иммунная система, в свою очередь, — на этиологические агенты [2–7]. Врачебные вмешательства основаны на назначении антибактериальных препаратов, при этом одним из ресурсов повышения эффективности лечения пациентов с внебольничной пневмонией является воздействие на иммунную систему.

Известно, что возбудители пневмонии оказывают влияние на различные компоненты иммунной системы. Было показано, что стрептококки вырабатывают ряд протеаз: клеточноассоциированную пептидазу, которая расщепляет С5а компонент комплемента, что приводит к ингибированию хемотаксиса нейтрофилов; цистеиновую протеазу, разрушающую С3, что приводит к снижению киллинга бактерий [4]. Staphylococcus aureus, который вызывает тяжелые пневмонии у пожилых людей, секретирует ряд факторов, таких как суперантигенподобные протеины 7 и 10 [7, 8] и хемотаксический ингибирующий протеин, влияющих на систему комплимента и хемотаксис нейтрофилов [9].

1. aureus также вырабатывает ауролизин, который относится к металлопротеазам [10]. Ауролизин блокирует комплементзависимый фагоцитоз и киллинг бактерий нейтрофилами [11].

Помимо гуморальных факторов иммунной системы, возбудители взаимодействуют и с клеточными. Так, Mycoplasma pneumoniae — наиболее частый возбудитель нетяжелой внебольничной пневмонии у молодых лиц — способствует увеличению экспрессии поверхностных антигенов, пролиферации иммунокомпетентных клеток, усилению их функций и высвобождению ими различных веществ, влияющих на взаимодействия иммунокомпетентных клеток между собой и с микоплазмами. Эти возбудители способны стимулировать в макрофагах и моноцитах секрецию провоспалительных цитокинов [5].

Учитывая все вышеизложенное, целью настоящего исследования было изучение особенностей иммунореактивности у пациентов с внебольничной пневмонией в зависимости от возбудителя. Изучение механизмов данного комплексного взаимодействия может улучшить понимание процессов, происходящих при внебольничной пневмонии, а следовательно, поможет в разработке индивидуальных подходов к терапии в зависимости от этиологического фактора.

МЕТОДЫ

Условия проведения

Обследование и лечение больных проводилось на базе ФГБУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России и лаборатории пульмонологии ФГБОУ ВО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова» Минздрава России. У всех пациентов диагноз пневмонии был подтвержден рентгенологически (наличие свежей очаговой инфильтрации). –

Методы исследования

Для установления этиологического фактора были проведены микробиологическое (посев на твердые питательные среды – кровяной агар, Эндо, шоколадный агар, среда Сабуро) и молекулярно-генетическое исследования индуцированной мокроты и периферической крови (Streptococcus pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Haemophilus influenzae, Adenovirus, Klebsiella pneumoniae) на амплификаторе «Терцик» с использованием комплектов для амплификации семейства «АмплиСенс» (производство ООО «ДНК-технология», Россия) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле. Полученное изображение геля фиксировали на компьютере с помощью видеосистемы для регистрации гелей ViTran. Определение уровня иммуноглобулинов (immunoglobulin, Ig) класса M и G к Chlamydophila pneumoniae, M. pneumoniae (Savyon Diagnostics, Израиль) и к вирусу простого герпеса 1-го и 2-го типов (НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород) в сыворотке крови выполняли методом твердофазного иммуноферментного анализа по стандартной методике с измерением результатов на микропланшетном ридере Anthos-2020 (Австрия).

Также всем пациентам проводили исследование гуморальных и клеточных факторов иммунной системы: определение уровня высокочувствительного С-реактивного белка (highly sensitive C-reactive protein, hsCRP; СРБ) и концентрации IgА, IgМ, IgG в сыворотке крови — методом нефелометрии на анализаторе BN ProSpec (Dade-Behring Marburg GmbH, Германия); цитокинов — методом твердофазного иммуноферментного анализа по стандартной методике: IL1β, IL6, IL8 и IFNγ — на тест-системах производства «Цитокин» (Санкт-Петербург), IL5 — на тест-системе Bender MedSystems, IL10 — на тест-системе Biosource (Бельгия). Учет результатов проводили на микропланшетном ридере TECAN SUNRISE (Австрия).

Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводилось методом проточной цитофлуориметрии на аппарате Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител (Beckman Coulter, США) с двойной меткой – флюоресцеин-5-изотиоцианат и фикоэритрин. Пробоподготовку проводили на станции TQ-Prep (Beckman Coulter, США).

Функциональная активность нейтрофилов оценивалась по их способности поглощать частицы латекса (ДиаМ, Россия) в базальных и стимулированных условиях. В качестве стимулятора использовали зимозан (Sigma, США).

Статистический анализ

Описание массивов данных, подвергающихся нормальному распределению, проводилось с использованием параметрических критериев (среднее, стандартная ошибка среднего, t-критерий Стьюдента, критерий Дункана, коэффициент корреляции Пирсона), а данных, не подвергающихся нормальному распределению, — с использованием непараметрических критериев — (медиана, 25-й и 75-й процентили, критерий Манна–Уитни, коэффициент корреляции Спирмена). Статистическую обработку полученных результатов выполняли с помощью компьютерной программы SPSS 13,0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Участники исследования

В исследование было включено 20 мужчин и 10 женщин с внебольничной пневмонией нетяжелого течения в возрасте от 21 года до 75 лет. Средний возраст пациентов составил 50,5±3,4 года.

При проведении этиологической диагностики наличие патогенной флоры было выявлено у 23 (76,7%) пациентов из 30, и лишь у 7 пациентов (23,3%) патогенная флора не определялась (табл. 1).

 

Таблица 1. Этиологическая характеристика внебольничной пневмонии

Показатель	Число пациентов	%
Streptococcus pneumoniae	14	53,3
Haemophilus influenzae	8	26,7
Mycoplasma pneumoniae	7	23,1
Klebsiella pneumoniae	6	20,0
Adenovirus	6	20,0
Chlamydophila pneumoniae	4	13,2

Примечание. Указаны положительные результаты, полученные любым из методов.

 

В зависимости от результатов этиологической диагностики все пациенты были разделены на четыре группы:

1) бактериальная группа(n=12);

2) вирусно-бактериальная группа(n=6);

3) группа атипичных возбудителей (n=5);

4) группа без выявленных возбудителей (n=7).

Маркеры воспаления

С-реактивный белок

Как известно, эффективный воспалительный ответ обеспечивает элиминацию возбудителя. В нашей работе мы провели оценку различных факторов воспаления. Так, одним из неспецифических маркеров воспаления является СРБ. Он образуется в печени под влиянием интерлейкина (interleukin, IL) 6 и играет важную роль, являясь фактором неспецифической защиты. Наиболее высокие уровни СРБ (>100 мг/л) определяются при тяжелых бактериальных инфекциях. В нашей работе увеличение высокочувствительного СРБ по отношению к норме (норма <3 мг/л) наблюдалось у пациентов всех групп, что свидетельствовало о наличии воспалительного процесса. H. Summah и J. Qu показали, что наиболее высокие уровни СРБ наблюдаются при внебольничной пневмонии, вызванной S. pneumoniae и Legionella pneumophila, по сравнению с C. pneumoniae, M. pneumoniae и Coxiella burnetii [12], однако в нашем исследовании было показано, что уровень высокочувствительного СРБ выше в группе атипичных возбудителей (табл. 2).

 

 

Таблица 2. Уровень высокочувствительного С-реактивного белка в исследуемых группах

Показатель	Группы
	Бактериальная, n=12	Вирусно- бактериальная, n=6	Атипичные возбудители, n=5	Без возбудителей, n=7
вчСРБ, мг/л	8,4±0,1	8,3±0,2	11,4±4,3	9,9±1,8

Примечание. вчСРБ — высокочувствительный С-реактивный белок.

 

Известно, что большое значение играет как сам СРБ (высокий уровень СРБ — прогностически благоприятный признак), так и его динамика [13, 14].

Иммуноглобулины А, М, G

Анализ уровня общих IgА, IgМ и IgG, синтезируемых плазматическими клетками, показал, что у пациентов всех групп значения были в пределах нормы. Достоверных различий по исследуемым показателям не выявлено.

Интерлейкины

При исследовании уровня цитокинов был выявлен ряд особенностей. Если при анализе IL1β и интерферона γ (interferon-γ, IFNγ) не было выявлено различий в зависимости от этиологического фактора, то по таким цитокинам, как IL5, IL6, IL8 и IL10, были получены существенные различия между группами, однако они не были статистически достоверными (табл. 3).

 

Таблица 3. Уровень цитокинов в исследуемых группах

Показатель	Группы
	Бактериальная, n=12	Вирусно- бактериальная, n=6	Атипичные возбудители, n=5	Без возбудителей, n=7
IL1β, пг/мл	20,1 (13,8−38,7)	28,1 (12,3−64,9)	28,5 (24,2−40,0)	23,0 (16,0−37,9)
IL5, пг/мл	17,8 (5,1−30,6)	13,9 (5,6−22,1)	9,7 (5,6−36,2)	6,1 (5,6−26,0)
IL6, пг/мл	6,2 (3,8−14,2)	19,7 (9,8−69,0)	100,0 (2,1−176,5)	18,1 (5,1−293,0)
IL8, пг/мл	31,5 (14,2−48,8)	45,7 (17,1−74,2)	0 (0−0)	32,1 (31,2−32,9)
IL10, пг/мл	4,1 (2,7−26,8)	12,8 (3,2−42,7)	1,1 (1,0−1,2)	3,0 (3,0−3,0)
IFNγ, пг/мл	34,4 (22,5−46,2)	23,4 (17,4−32,6)	28,7 (23,9−217,1)	33,0 (14,3−35,7)

Примечание. * — р<0,05.

 

Как известно, IL5 — цитокин Т-клеточного происхождения, секретируемый Th2-лимфоцитами, — является не только важным фактором дифференцировки и активации эозинофилов, но и главным хемоаттрактантом для эозинофилов. В нашей работе было показано, что в группе атипичных возбудителей уровень эозинофилов был достоверно ниже по сравнению с бактериальной группой, в то время как процент пациентов с определяемым уровнем IL5 был, наоборот, наиболее высоким у данных пациентов и составлял 100% по сравнению с более низкими показателями в других группах — 33,3% в вирусно-бактериальной и 16,7% в бактериальной.

Учитывая полученные данные, мы можем предположить, что более низкий уровень эозинофилов в группе атипичных возбудителей обеспечивается не IL5, а другими цитокинами, что представляет собой сложный механизм, требующий дальнейшего изучения (рис.).

 

Рис. Количество эозинофилов в исследуемых группах

 

Кроме того, было показано, что у детей при внебольничной пневмонии, вызванной новым вирусом гриппа типа A (H1N1), увеличивается уровень эозинофилов и IL5 при отсутствии аллергии в анамнезе [15], а также наблюдается существенное увеличение уровня IL5 в сыворотке крови при внебольничной пневмонии, вызванной микоплазмой [16].

Таким образом, на основании полученных данных можно предположить, что микоплазменная инфекция через IL5 может провоцировать развитие бронхообструктивной патологии. Поводом для этого стал ряд данных, полученных еще в 1998 г. M. Kraft и соавт., которые показали, что в жидкости бронхоальвеолярного лаважа пациентов со стабильной астмой в 50% случаев определяется M. pneumoniae[17], а назначение антибактериальной терапии пациентам с бронхиальной астмой, у которых возбудитель был выявлен в жидкости бронхоальвеолярного лаважа или в эндобронхиальных биоптатах, приводит к снижению тяжести заболевания [18].

Как известно, одну из ключевых ролей в развитии воспалительного процесса играют IL6, IL8 и IL10.

На экспериментальной модели внебольничной пневмонии, вызванной K. pneumoniae (мыши, нокаутированные по IL6), было показано увеличение смертности от данной патологии, коррелирующее с нарушением клиренса бактерий за счет снижения фагоцитоза патогена нейтрофилами. При введении IL6 наблюдались активация нейтрофилов, снижение количества бактерий в легочной ткани и увеличение выживаемости экспериментальных животных [19].

Известно также, что концентрация IL6, IL8 и IL10 снижается в первые несколько дней от начала лечения. Сохранение высокого уровня цитокинов, особенно IL6, является неблагоприятным признаком [20].

В нашей работе наиболее высокий уровень IL6 (100 пг/мл) был выявлен у пациентов с атипичными возбудителями, в то время как IL8 у данной категории больных был ниже предела чувствительности метода в 100% случаев. Определяемый уровень IL10 был лишь у 33,3% пациентов, при этом наиболее высокий уровень — в группе пациентов с вирусно-бактериальными возбудителями.

Как указывалось выше, IL6 и IL8 являются провоспалительными цитокинами. Таким образом, воспалительный процесс играет позитивную роль, способствуя элиминации возбудителя.

Увеличение же уровня IL10 у пациентов вирусно-бактериальной группы мы можем рассматривать как реакцию организма на более активное воспаление.

CD-антигены

При исследовании параметров клеточного иммунитета было выявлено снижение относительного количества CD3+ (Т-лимфоциты) и субпопуляции CD3+CD4+ (Т-хелперы) лимфоцитов во всех исследуемых группах, а также снижение CD3+CD8+ (Т-цитотоксические) лимфоцитов у пациентов с бактериальными и невыявленными возбудителями, что можно рассматривать как транзиторное состояние, которое является физиологической реакцией организма на воспалительный процесс.

При проведении сравнительного анализа было показано, что в группе атипичных возбудителей уровень CD3+CD8+ лимфоцитов достоверно (р<0,05) выше (19,6±1,5), чем в группе бактериальных возбудителей (15,3±0,9) и группе без возбудителей (15,5±1,1), что дает возможность предположить активную стимуляцию клеточных механизмов иммунного ответа у пациентов с данными возбудителями.

Аналогично этому, свидетельством активности клеточных механизмов у пациентов с атипичными и вирусно-бактериальными возбудителями являются достоверно (р<0,05) более высокие значения NK-клеток (13,2±1,7 и 15,4±1,0 соответственно) по сравнению с другими группами.

В ряде работ было показано, что при внебольничной пневмонии, вызванной новым вирусом гриппа типа A (H1N1), наблюдается снижение уровней CD3+, CD4+, CD8+ лимфоцитов [21, 22]. Также существенное снижение относительного содержания CD3+, CD4+, CD8+ лимфоцитов и NK-клеток было показано при пневмонии, вызванной респираторным синцитиальным вирусом [22].

Известно, что CD25 (легкая цепь рецептора IL2) является маркером активации клеток. В соответствии с этим мы можем сделать заключение о том, что у пациентов с вирусно-бактериальными возбудителями и у тех пациентов, у которых возбудитель не был выявлен, наблюдается более высокий активационный статус, так как в данных группах было повышено относительное количество Т-лимфоцитов, несущих на своей поверхности CD25. Увеличение относительного количества CD3+CD25+ лимфоцитов у пациентов с невыявленными возбудителями может быть связано либо с более сильным ответом, в результате которого произошла ранняя элиминация возбудителя, либо с наличием патогенной флоры, которую мы не можем определить стандартными методами.

Корреляционный анализ

В группе пациентов с вирусно-бактериальными возбудителями проведенный корреляционный анализ выявил прямую зависимость между количеством тромбоцитов и уровнем провоспалительных цитокинов IL1β и IL6.

Как было показано M. Mirsaeidi и соавт., тяжесть пневмонии, а также риск увеличения 30-дневной смертности взаимосвязаны с количеством тромбоцитов [23]. При этом неблагоприятным прогностическим признаком является как тромбоцитопения (<100×10⁹/л), так и тромбоцитоз (>400×10⁹/л). При тромбоцитозе >400×10⁹/л наблюдается увеличение риска смертности на 15% [23].

Учитывая роль провоспалительных цитокинов и тромбоцитов в развитии воспаления, взаимосвязь количества тромбоцитов и уровней IL1β и IL6 является закономерной и отражает участие различных звеньев иммунной системы в развитии воспаления.

Также была выявлена обратная зависимость между количеством тромбоцитов и показателями фагоцитоза, такими как фагоцитарная активность нейтрофилов, фагоцитарное число и фагоцитарный резерв, у пациентов с атипичными возбудителями. При этом необходимо учесть, что различий по показателям фагоцитоза между исследуемыми группами не было: фагоцитарная активность нейтрофилов во всех исследуемых группах находилась в пределах нормы, а фагоцитарное число повышено у пациентов всех групп (табл. 4), в то время как уровень тромбоцитов был более высоким в группе атипичных возбудителей. Возможно, это связано с влиянием микоплазмы на процессы фагоцитоза. Так, показано, что в первые 12 ч после инфицирования происходит существенное угнетение фагоцитоза с последующей его нормализацией к 24 ч и достижением максимума к 7-му дню. Снижение фагоцитоза в первые часы связывают с продукцией супрессорных цитокинов в ответ на суперантиген, а последующее усиление — со способностью микоплазмы оказывать хемоаттрактантную активность в отношении макрофагов [24].

 

Таблица 4. Показатели фагоцитоза нейтрофилов в исследуемых группах

Показатель	Группы
	Бактериальная, n=12	Вирусно- бактериальная, n=6	Атипичные возбудители, n=5	Без возбудителей, n=7
ФАН	75,3±4,3	74,7±4,0	78,0±7,2	77,2±3,8
ФЧ	24,6±3,4	19,3±2,3	24,1±3,5	24,0±4,5
ФР	79,2±4,3	81,5±3,0	82,0±8,2	82,6±3,2

Примечание. ФАН — фагоцитарная активность нейтрофилов, ФЧ — фагоцитарное число, ФР — фагоцитарный резерв.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Воспалительный процесс, вызываемый различными возбудителями, имеет свои иммунологические особенности, и требуются дальнейшие широкомасштабные исследования для оценки возможности воздействия на иммунологические механизмы с целью повышения эффективности лечения пациентов с внебольничной пневмонией.

About the authors

A. V. Rvacheva

Research Institute of Pulmonology of the Federal Medical-Biological Agency of Russia; Moscow State University of Medicine and Dentistry a.n. A.I. Evdokimov

Author for correspondence.
Email: arvatcheva@mail.ru
SPIN-code: 5267-9598
Scopus Author ID: 24391582000
ResearcherId: E-9258-2014

канд. мед. наук, заведующая лабораторией иммунологии; ведущий науч. сотр. лаборатории пульмонологии отдела клинической медицины 

Russian Federation, 28, Orekhovy Bulvar, Moscow, 115682; 20/1, Delegatskaya street, Moscow, 127473

A. A. Pustovalov

Moscow State University of Medicine and Dentistry a.n. A.I. Evdokimov

Email: apoustovalov@gmail.com

канд. мед. наук, научный сотрудник лаборатории пульмонологии отдела клинической медицины

Russian Federation, 20/1, Delegatskaya street, Moscow, 127473

K. A. Zykov

Research Institute of Pulmonology of the Federal Medical-Biological Agency of Russia; Moscow State University of Medicine and Dentistry a.n. A.I. Evdokimov

Email: kirillaz@mail.ru
Scopus Author ID: 26538429700
ResearcherId: E-9177-2014
Russian Federation, 28, Orekhovy Bulvar, Moscow, 115682; 20/1, Delegatskaya street, Moscow, 127473

References

Supplementary files