Electrochemical measurements of the levels of nitric oxide metabolites in the blood serum

Irina V. Goroncharovskaya; Горончаровская Ирина Викторовна; Anatoly K. Evseev; Евсеев Анатолий Константинович; Elena V. Klychnikova; Клычникова Елена Валерьевна; Elizaveta V. Tazina; Тазина Елизавета Владимировна; Alina S. Bogdanova; Богданова Алина Сергеевна; Aslan K. Shabanov; Шабанов Аслан Курбанович; Sergey S. Petrikov; Петриков Сергей Сергеевич

doi:10.17816/clinpract202788

Electrochemical measurements of the levels of nitric oxide metabolites in the blood serum

Authors: Goroncharovskaya I.V.¹, Evseev A.K.¹, Klychnikova E.V.¹, Tazina E.V.¹, Bogdanova A.S.¹, Shabanov A.K.¹, Petrikov S.S.¹
Affiliations:
1. N.V. Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine
Issue: Vol 14, No 1 (2023)
Pages: 6-11
Section: Original Study Articles
URL: https://journals.eco-vector.com/clinpractice/article/view/202788
DOI: https://doi.org/10.17816/clinpract202788
ID: 202788

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Background: Sepsis is a serious clinical condition caused by a dysregulated immune response to infection resulting in multiple organ failure. In the pathogenesis of sepsis, especially that of septic shock, great importance is given to the endothelial marker of vascular regulation, nitric oxide (NO). In septic shock, dysregulation of the vascular tone plays a key role in the development of hypotension. Therefore, the control of the level of nitric oxide and its stable metabolites in critically ill patients is a very important task.

Aim: the aim of this study was to evaluate the potential of the electrochemical nitrite detection in the patients’ blood serum.

Methods: The levels of nitric oxide stable metabolites in the blood serum of healthy individuals (n=20) and septic patients (n=25) were studied by the electrochemical method using a composite electrode and by the spectrophotometric method using the Griess reagent.

Results: The data in the groups of healthy people and patients with sepsis differ significantly (p <0.00001) both when measured using electrochemical and spectrophotometric methods. The median value of the current response in healthy people was 0.41 µA (0.33; 0.55), and the total content of nitric oxide metabolites (NOx) was 26.8 µmol/L (20.8; 31.0), while in patients with sepsis, these values were 0.79 µA (0.61; 1.28) and 38.89 µmol/L (29.64; 57.45), respectively. A negative correlation was found between the data obtained for practically healthy persons (r=-0.696, p=0.0007).

Conclusion: The obtained results allow us to conclude that the nitrite measurement in the blood serum by amperometry using a composite electrode is promising as a diagnostic technique.

Keywords

amperometry, nitric oxide metabolites, sepsis, spectrophotometry

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Патогенез сепсиса сложен и представлен патогенетическими звеньями, затрагивающими практически все органно-функциональные системы организма, тем более когда речь идет о наиболее тяжелой форме генерализованной инфекции — септическом шоке, который сопровождается высокой смертностью пациентов [1, 2]. Главная мишень при сепсисиндуцированных нарушениях — эндотелий сосудов. В результате повреждения эндотелия развивается эндотелиальная дисфункция, одним из проявлений которой является чрезмерное образование оксида азота. Увеличение содержания в организме оксида азота приводит к резкой вазодилатации и повышению проницаемости капилляров, что является причиной развития гиповолемии, а в дальнейшем гипотензии и гипоперфузии органов [3, 4]. Кроме того, оксид азота способен взаимодействовать с супероксид-радикалом, который также появляется при воспалительной реакции, с образованием пероксинитрита, оказывающего цитотоксическое действие [5]. Совокупность всех указанных событий способствует развитию полиорганной недостаточности.

Исследования уровня оксида азота и его стабильных метаболитов в плазме крови лиц в критическом состоянии показали, что данный параметр коррелирует с тяжестью состояния пациентов, оцененной с помощью шкал SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessment) и APACHE (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation) [6–8]. При сравнении случаев сепсиса с благоприятным и летальным исходом выявлено, что уровень метаболитов оксида азота был выше у пациентов с летальным исходом [9–11].

Таким образом, контроль уровня оксида азота и его стабильных метаболитов необходим при мониторинге пациентов, находящихся в критическом состоянии.

Уровень оксида азота может быть оценен как путем непосредственного его определения, так и через содержание его стабильных метаболитов — нитрита и нитрата (NOx) [12]. Однако прямое определение оксида азота не получило распространения для измерений в биологических средах, поскольку молекула газа обладает коротким временем жизни. В клинической практике для определения метаболитов оксида азота используется спектрофотометрический метод с применением реактива Грисса [12]. Поскольку метод Грисса направлен на определение нитрит-ионов, то необходимо предварительное восстановление нитрат- ионов, что делает анализ более трудоемким и длительным. Именно поэтому разработка альтернативных методов определения метаболитов оксида азота до сих пор остается актуальной.

Так, в качестве альтернативы для определения нитрита могут выступать электрохимические методы анализа, поскольку они не требуют дополнительных реагентов, дорогостоящего оборудования, обладают хорошей чувствительностью и скоростью проведения измерений. Предварительные исследования возможностей композитного пастового электрода на основе многослойных углеродных нанотрубок, покрытых полиметиленовым голубым для электрохимического определения нитрита в водных и биологических средах [13], показали, что данный композитный электрод может быть пригоден для измерений в биологических средах пациентов.

Цель исследования — изучить возможности электрохимического определения нитрита в сыворотке крови пациентов в критическом состоянии.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Пилотное одноцентровое исследование.

Критерии соответствия

Критерии включения: пациенты отделения реанимации и интенсивной терапии ГБУЗ «НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗМ» любого пола и возраста (старше 18 лет) с диагностированным согласно критериям международных рекомендаций по лечению сепсиса и септического шока (Surviving Sepsis Campaign, SSC; 2016) сепсисом с нарушением тканевой перфузии и развитием полиорганной недостаточности.

Критерии включения в группу сравнения: практически здоровые доноры-добровольцы любого пола старше 18 лет.

Условия проведения

Исследование проведено на базе ГБУЗ «НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗМ» в период с февраля по апрель 2022 года.

Описание медицинского вмешательства

В качестве объекта исследования использовали сыворотку крови практически здоровых добровольцев и пациентов, полученную из цельной крови путем центрифугирования при 1500 g в течение 10 мин в центрифуге Allegra X-15R (Beckman Coulter, США). Исследование у пациентов проводили на 7–10-е сутки с момента их поступления в стационар.

Подготовка рабочего электрода. Рабочий композитный электрод был изготовлен путем нанесения на поверхность стеклоуглеродного электрода диаметром 3 мм суспензии многостенных углеродных нанотрубок (ООО «Глобал СО», Россия) в 1% растворе додецилсульфата натрия (5 мг/мл) объемом 1 мкл. После высыхания растворителя проводили электрохимическую полимеризацию метиленового голубого согласно методике, описанной в работе [13]. После синтеза электрод тщательно промывали дистиллированной водой.

Методика определения стабильных метаболитов оксида азота. Уровень нитрита в сыворотке крови определяли с помощью амперометрического метода. Фиксировали отклик тока при величине потенциала поляризации +810 мВ в момент добавления 0,5 мл сыворотки крови к 9,5 мл натрий-фосфатного буферного раствора (рН 7,4) при постоянном перемешивании. В измерениях в качестве электрода сравнения использовали насыщенный Ag/AgCl электрод, а в роли вспомогательного электрода — сетку из платинированного титана.

Суммарное содержание метаболитов оксида азота (NOx) в сыворотке крови определяли с помощью спектрофотометрического метода с использованием реактива Грисса [14].

Этическая экспертиза

Данное исследование проводилось согласно принципам Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» (2013 г.) и Правилам клинической практики в Российской Федерации (от 19.06.2003 № 266). На проведение данного исследования получено согласие этического комитета ГБУЗ НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗМ.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета программ Statistica 10 (StatSoft Inc., США). Проверку нормальности распределения количественных признаков осуществляли с использованием критерия Шапиро– Уилка. Данные представлены в виде медианы и процентилей (25% и 75%). Для сравнения двух независимых групп применяли U-критерий Манна–Уитни. Значения p <0,05 считали статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты (участники) исследования

Для исследования возможностей применения композитного электрода с целью оценки содержания нитрита в биологических средах обследованы две группы лиц. Первую группу, контрольную, составили 20 практически здоровых доноров, из них 11 мужчин и 9 женщин, медиана возраста 37 (31; 43,5) лет. Вторая группа — 25 пациентов с диагнозом сепсиса, находящихся на лечении в НИИ СП им. Н.В. Склифосовского, из них 17 мужчин и 8 женщин. Медиана возраста 59 (46; 64) лет. Медианный балл тяжести состояния пациентов по шкале SOFA составил 8,5 (5,75; 12). Причиной развития сепсиса явились распространенный фибринозно-гнойный перитонит, острый гнойный медиастинит, гнойные осложнения у больных с тяжелой сочетанной травмой, тяжелый острый панкреатит в фазе гнойно-септических осложнений.

Основные результаты исследования

Поскольку ранее нами было показано [13] с помощью вольтамперометрического метода, что окисление в плазме крови с добавлением нитрита протекает при тех же потенциалах, что и в водных растворах, то разность значений тока до и после введения образца сыворотки при потенциале +810 мВ можно отнести к процессу окисления нитрита. На рис. 1 приведены хроноамперограммы, снятые в растворе натрий-фосфатного буфера с добавлением сыворотки крови практически здорового донора (см. рис. 1, кривая 1) и пациента с диагнозом сепсиса (см. рис. 1, кривая 2), при этом установлены значительные отличия у здоровых людей и пациентов с воспалительной реакцией.

Рис. 1. Хроноамперограммы композитного электрода при добавлении к раствору натрий-фосфатного буфера (pH 7,4) сыворотки донора (1) и сыворотки пациента с сепсисом (2). / Fig. 1. Chronoamperograms of a composite electrode when the blood serum of a donor (1) and of a septic patient (2) are added to a solution of sodium phosphate buffered saline (pH 7.4).

Аналитический отклик, наблюдаемый при добавлении сыворотки крови пациента, заметно выше, чем у практически здорового донора. Это можно объяснить тем, что при синдроме системной воспалительной реакции отмечается гиперпродукция оксида азота, что, следовательно, приводит к значительному росту уровня нитрита в организме [15].

Данные, полученные с помощью амперометрического и спектрофотометрического методов, достоверно различаются (p <0,00001) в группе здоровых людей и пациентов с сепсисом: отклик тока, эквивалентный уровню нитрита, как и концентрация NOx в сыворотке крови пациентов с сепсисом, оказались выше, чем у практически здоровых людей (табл. 1).

Таблица 1. Содержание стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови / Table 1. Levels of nitric oxide stable metabolites in the blood serum

Показатель	Доноры, n=20	Пациенты с сепсисом, n=25	p
ΔI, мкА	0,41 (0,33; 0,55)	0,79 (0,61; 1,28)	0,000002
NOx, мкмоль/л	26,8 (20,8; 31,0)	38,89 (29,64; 57,45)	0,00793

Выявлена также отрицательная корреляция между данными, полученными двумя методами измерения для практически здоровых людей: коэффициент корреляции Спирмена (r) составил -0,696, p=0,0007. Обратный характер зависимости тока окисления нитрита в сыворотке крови от суммарного содержания метаболитов оксида азота (NOx), измеренного спектрофотометрическим методом, вероятно, может быть обусловлен изменением соотношения в сыворотке крови NO₂^–/NO₃^–. Так, например, в исследованиях [16, 17] показано, что при стимулировании или подавлении активности эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS синтазы) происходило существенное изменение уровня NO₂^–, в то время как показатели NOx и NO₃^– оставались практически неизменными. Можно предположить, что данное соотношение варьирует и при изменении активности индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS синтазы).

ОБСУЖДЕНИЕ

Преимуществом электрохимического определения метаболитов оксида азота является более быстрый анализ по сравнению со спектрофотометрическим методом, который требует предварительного восстановления всех форм метаболитов оксида азота до нитрита [12]. В качестве восстановителя используют гранулы кадмия [10], либо конверсию проводят с помощью нитратредуктазы [7]. В случае применения кадмия время инкубации пробы составляет несколько часов, что делает анализ недостаточно экспрессным, а в случае нитратредуктазы — присутствует вероятность влияния ферментов на течение реакции Грисса.

Несмотря на преимущества электрохимического метода, в литературе описано применение подобных композитных электродов только для определения нитрита в водных растворах [18, 19], однако отсутствуют данные об аналогичных измерениях в биологических средах.

Научно-практической перспективой является более детальное исследование на большей выборке как практически здоровых людей, так и пациентов с различными патологическими состояниями с целью установления взаимосвязи между показателями, полученными электрохимическим и спектрофотометрическим методами.

Представленное исследование позволило выявить диагностические возможности электрохимического метода определения нитрита в биологических средах в качестве экспресс-анализа состояния пациента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Амперометрический метод может быть применен для определения нитрита в сыворотке крови. Дальнейшие исследования в направлении электрохимического анализа для оценки уровня стабильных метаболитов оксида азота являются весьма перспективными.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ / ADDITIONAL INFORMATION

Вклад авторов. И.В. Горончаровская — анализ литературы, написание статьи, набор данных; А.К. Евсеев — анализ и интерпретация данных, написание статьи, разработка концепции; Е.В. Клычникова — разработка концепции, написание статьи, анализ и интерпретация данных; Е.В. Тазина — набор данных, написание статьи; А.С. Богданова — лабораторная диагностика, набор данных, написание статьи; А.К. Шабанов — анализ данных, редактирование рукописи; С.С. Петриков — разработка концепции, обсуждение результатов. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Authors’ contribution. I.V. Goroncharovskaya — literature analysis, manuscript writing, data collection; A.K. Evseev — data analysis and interpretation, manuscript writing, conceptualization; E.V. Klychnikova — conceptualization, manuscript writing, data analysis and interpretation; E.V. Tazina — data collection, manuscript writing; A.S. Bogdanova — data collection, laboratory analysis; A.K. Shabanov — data analysis, manuscript editing; S.S. Petrikov — conceptualization, results analysis. The authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Источник финансирования. Исследование и публикация статьи осуществлены на личные средства авторского коллектива.

Funding source. The study had no sponsorship.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that there is no conflict of interests.

About the authors