Mesenchymal stem cells in the treatment of ischemic stroke

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Ишемический инсульт (ИИ) продолжает оставаться одной из самых актуальных проблем современной медицины в связи с высокими показателями заболеваемости, летальности и инвалидизации пациентов [1–3]. По данным Всемирной организации здравоохранения, ИИ и другие виды острых нарушений кровообращения на текущий момент занимают второе место (11%) в структуре общемировой смертности [4–6]. На территории Российской Федерации за последние 5 лет было зарегистрировано порядка 430–470 тысяч случаев ИИ в год, при этом госпитальная летальность пациентов отмечалась на очень высоком уровне и составляла 17–21% [7].

На сегодняшний день единственное эффективное лечение ИИ возможно только в остром периоде путём проведения внутривенного тромболизиса и/или внутрисосудистой тромбоэкстракции для восстановления кровотока в церебральных артериях [8, 9]. Эти методы имеют ряд ограничений и противопоказаний, ведущим из которых является короткий временной интервал («терапевтическое окно») их применения, составляющий, по данным последних исследований, от 4,5 часов для внутривенного тромболизиса до 24 часов для тромбоэкстракции [10–12]. У многих пациентов после перенесённого ИИ, даже после успешно проведённой реперфузионной терапии, сохраняется пожизненный неврологический дефицит в связи с гибелью нейронов и глиальных клеток в очаге инфаркта головного мозга [13].

По данным последних аналитических исследований показано, что в Российской Федерации высокий процент инвалидизации пациентов после ИИ приводит не только к формированию постоянной утраты их трудоспособности, но также к сокращению вклада в экономику их родственников, осуществляющих уход [4]. Годовые затраты в среднем на 1 случай инсульта для государства составляют 0,9–1,2 млн рублей, а возникающий в течение первого года после инсульта экономический ущерб — 0,3% годового валового внутреннего продукта страны. Все вышеописанное приводит к формированию значительного социально-экономического бремени для государства и подтверждает необходимость поиска и разработки новых эффективных методов и подходов для терапии ИИ у пациентов с упущенным терапевтическим окном.

В последние два десятилетия получено множество доказательств, что трансплантация мезенхимальных стволовых клеток (МСК) может стать перспективным методом терапии ИИ. МСК — это удовлетворяющая критериям стволовости субпопуляция мезенхимальных стромальных клеток, согласно терминологии, разработанной по рекомендациям Международного общества клеточной терапии (International Society for Cellular Therapy, ISCT) [14]. Под критериями стволовости подразумевается клеточная мультипотентность — способность дифференцироваться в различные зрелые типы клеток в пределах одного зародышевого листка (в случае с МСК — мезодермы) наряду со способностью к активной пролиферации. МСК широко применяются в клеточной терапии и регенеративной медицине в связи с их иммуномодулирующим, противовоспалительным, стимулирующим ангиогенез, антиапоптотическим действием [15, 16]. МСК наряду с непосредственной секрецией во внеклеточное пространство цитокинов и других регуляторных молекул продуцируют внеклеточные везикулы, которые активно захватываются клетками-мишенями, что облегчает внутриклеточную доставку биологически активных молекул. Из внеклеточных везикул МСК наиболее хорошо изучены экзосомы (внеклеточные везикулы размером 30–100 нм), которые могут транспортировать широкий спектр регуляторных микроРНК и факторов роста.

Фенотипически МСК характеризуются экспрессией определённых поверхностных клеточных маркеров кластера дифференцировки (CD). Согласно минимальным критериям, предложенным Комитетом по мезенхимальным и тканевым стволовым клеткам (ISCT), к МСК относятся клетки, экспрессирующие CD105, CD73 и CD90 и не экспрессирующие CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19 и HLA-DR. Будучи адгезионными и активно пролиферирующими клетками, они образуют плотный клеточный монослой при культивировании на адгезионных полимерных покрытиях в стандартных условиях, а также обладают способностью дифференцироваться в адипоциты, хондробласты и остеобласты в специальных условиях in vitro [17]. Помимо этого, МСК способны дифференцироваться в другие клеточные типы — перициты, гепатоциты [18], кардиомиоциты [19] и другие мезодермальные клетки. Способность МСК к нейрональной дифференцировке без дополнительной индукции в настоящее время вызывает сомнения в научном сообществе [20].

МСК можно выделить из множества разных органов и тканей — костного мозга, плаценты, пуповины, амниотической жидкости, жировой ткани, кожи, пульпы зуба, стромы паренхиматозных органов и др. [21–26]. Стоит также отметить, что МСК, полученные из различных источников или даже от разных доноров, могут иметь существенные отличия в паттерне экспрессии генов и, как следствие, разный регенераторный потенциал [27]. МСК обладают иммуномодулирующим эффектом и при этом считаются относительно иммунологически инертными вследствие низкого уровня экспрессии HLA, т.е. риск патологической иммуносенсибилизации при трансплантации аллогенных МСК невелик, хотя и не исключён полностью [28].

Среди главных преимуществ МСК можно отметить отсутствие биоэтических проблем при получении МСК из первичного материала (особенно, если источником МСК является плацента, классифицируемая как биоотходы), сравнительную простоту и низкую себестоимость получения первичных культур и масштабирования производства клеток в необходимых для клинического применения количествах, а также многократно подтверждённую в доклинических и клинических исследованиях безопасность. За всё время исследования МСК ни разу не было описано случая формирования опухоли или онкогенной трансформации трансплантированных МСК, поэтому онкологическая безопасность этих клеток не вызывает сомнений [29, 30].

По данным многочисленных доклинических исследований, трансплантация МСК животным с экспериментальным инфарктом мозга может оказывать значимое положительное терапевтическое действие [31–33]. Показано, что после системной (внутривенной или внутриартериальной) трансплантации МСК, равно как и после локального внутримозгового введения, улучшается выживаемость лабораторных животных, в той или иной мере снижается степень выраженности неврологического дефицита, а в ряде исследований отмечено также уменьшение размеров зоны инфаркта мозга [34–40]. Оптимальный способ трансплантации МСК по данным доклинических исследований точно не известен, однако наиболее перспективным для использования при ИИ, особенно в острейшем и остром периодах, с нашей точки зрения, является системное внутриартериальное введение, при котором МСК в первую очередь попадают в микроциркуляторное русло мозга и потенциально могут оказывать наибольшее системное действие в пределах центральной нервной системы [34, 41]. Внутривенное введение является наименее инвазивным способом системного введения, однако следует отметить, что большая часть клеток при этом задерживается в паренхиматозных органах (прежде всего в лёгких, печени, селезёнке), что уменьшает эффективность доставки МСК в мозг и, как следствие, приводит к меньшему функциональному восстановлению по сравнению с внутриартериальным введением [42]. Внутриартериальная трансплантация продемонстрировала наилучшую терапевтическую эффективность, обеспечивая адресную доставку МСК в церебральные артерии, минуя периферические органы [43]. При выполнении внутриартериального введения имеется потенциальный риск церебральной эмболии, однако эмболических осложнений можно избежать путём подбора адекватных дозы и скорости введения МСК [44]. Кроме того, благодаря активному развитию методов эндоваскулярной хирургии в последнее десятилетие внутриартериальный доступ стал более доступным для применения в рутинной клинической практике.

Оптимальное время трансплантации МСК, как и других типов стволовых клеток при ИИ, до сих пор не определено, однако, в отличие от реперфузионной терапии, предполагаемое «терапевтическое окно» клеточной терапии при ИИ составляет более длительный промежуток времени: сообщается о положительном терапевтическом эффекте клеточной трансплантации от нескольких часов до нескольких месяцев после развития острого нарушения мозгового кровообращения [40]. При сравнении выраженности терапевтического действия наилучшее функциональное восстановление и более быстрое уменьшение объёма очага инфаркта мозга у экспериментальных животных отмечались в период 24–48 часов с момента появления неврологической симптоматики [45, 46]. Механизм действия МСК связывают с противовоспалительным и нейропротективным действием при ишемии мозга, нейровоспалении и повреждении гематоэнцефалического барьера, что обусловливает максимальную эффективность терапии с помощью МСК в первые 48 часов после ИИ [47]. Уникальные иммунологические свойства МСК делают возможным их аллогенную трансплантацию, что важно с социально-экономической точки зрения: это позволяет осуществлять массовое производство плацентарных МСК и применять их в острейшем и остром периодах ИИ, когда получение аутологичных клеток невозможно [46, 48, 49].

Вышеописанные свойства МСК и обнадёживающие результаты доклинических исследований сделали возможным проведение в зарубежных странах первых клинических испытаний по изучению влияния трансплантации МСК на течение и исходы ИИ у человека.

Цель настоящего обзора — обобщить накопленный по клиническим исследованиям опыт трансплантации МСК при ИИ, представить современную концепцию механизма действия МСК на основе доказательной медицины и наметить наиболее интересные, с нашей точки зрения, пути развития клеточной терапии ИИ.

РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

На текущий момент в научной литературе представлены результаты 14 клинических исследований на пациентах с ИИ, которые были проведены в зарубежных странах, и в которых оценивали безопасность и эффективность трансплантации МСК, полученных из разных источников. Пациентам трансплантировали как аутологичные, так и аллогенные и даже генетически модифицированные МСК. Во всех исследованиях помимо клеточной терапии пациентам с ИИ проводили стандартную терапию, согласно принятым в стране клиническим рекомендациям. Обобщённые результаты проведённых исследований представлены в табл. 1 [50–63].

 

Таблица 1 / Table 1

Результаты основных клинических исследований, посвящённых клеточной терапии ишемического инсульта / Results of the main clinical trials dedicated to cell therapy for ischaemic stroke

Исследование	Фаза	Всего пациентов/трансплантация МСК, n	Тип МСК/доза	Путь введения	Срок наблюдения	Эффективность
Bang и др., 2005 [50]	I/II	30/5	Аутологичные (костный мозг)/две дозы по 50 млн кл.	Внутривенно	1 год	Тенденция к улучшению NIHSS
Lee и др. [51]	I/II	52/16	Аутологичные (костный мозг)	Внутривенная трансплантация	5 лет	Улучшение функционального восстановления, снижение смертности
Honmou и др. [52]	I	12	Аутологичные МСК (костный мозг) / от 0,6 до 1,6×10⁸ кл.	Внутривенная трансплантация	1 год	Тенденция к уменьшению неврологического дефицита, значимое уменьшение размеров очага инфаркта мозга
Bhasin и др. [53]	I/II	12/6	Аутологичные МСК (костный мозг)/ 50–60×10⁶ кл.	Внутривенная трансплантация	6 мес	Тенденция к уменьшению неврологического дефицита
Bhasin и др. [54]	I/II	40/МСК — 6/ мононуклеарные СК — 14	Аутологичные МСК (костный мозг)/ 50–60 млн кл.	Внутривенная трансплантация	6 мес	Статистически значимое улучшение mBI в группе терапии МСК
Fang и др. [55]	I/IIа	18/6/6 ЭПК	Аутологичные МСК (костный мозг)/ 2,5×10⁶ кл. + 2,5×10⁶ кл./кг через 1 нед.	Внутривенная трансплантация	4 года	Нет статистически значимых различий между группами
Hess и др. [56]	II	129/67	Аллогенные МСК (костный мозг)/ 400 млн кл./кг или 1200 млн кл./кг	Внутривенная трансплантация	3 года	Положительный терапевтический эффект наблюдался при ранней трансплантации МСК в течение 12–36 ч
Levy и др. [57]	I/II	36	Аллогенные МСК (костный мозг)/ 1,5 млн кл./кг	Внутривенная трансплантация	12 мес	Значимое увеличение mBI через 6 мес и 12 мес
Steinberg и др. [58]	I/IIa	18	МСК (костный мозг, линия «SB623»)/ 2,5×106, 5,0×106 или 10×106 кл.	Интратекально стереотаксически	2 года	Значимое функциональное улучшение (ESS, NIHSS, F-M) с 1-го мес
Qiao и др. [59]	I	8	МСК аллогенные (пуповина)/ 0,5×106 кл./кг внутривенно или 5×106 кл. МСК + 6×106 кл. НСК/НПК интратекально	Внутривенная трансплантация МСК по 4 введения или ко-трансплантация: 1 доза МСК внутривенно и МСК + НСК интратекально	2 года	Функциональное улучшение (NIHSS, mBI, и mRS), более выраженное после котрансплантации
Lee и др. [60]	I/II	44/31	Аутологичные МСК (костный мозг)/ 1×106 кл./кг	Внутривенная трансплантация	90 дней	Значимое улучшение по шкале F-M и восстановление межполушарных и ипсилатеральных проводящих путей
Jaillard и др. [61]	II	31/16	Аутологичные МСК (костный мозг)/ 1×108 кл. или 3×108 кл.	Внутривенная трансплантация	2 года	Значимое улучшение моторной функции
De Celis-Ruiz и др. [62]	IIb	30/15	Аллогенные МСК (жировая ткань)/ 106 кл./кг	Внутривенная трансплантация	2 года	Тенденция к улучшению показателя NIHSS
Bang и др. [63]	II	54/39	Аутологичные МСК (костный мозг)/ 1×106 кл./кг	Внутривенная трансплантация	90 дней	Значимое увеличение (~ в 5 раз) в крови уровня внеклеточных везикул и микроРНК в них, связанных с нейрогенезом/нейропластичностью через 24 ч после трансплантации, коррелирующее с восстановлением моторной функци и проводящих путей

Примечание. МСК — мезенхимальные стволовые клетки; ЭПК — эндотелиальные прогениторные клетки; СК — стволовые клетки; NIHSS — шкала инсульта Национального института здоровья; mBI — модифицированный индекс Бартела , mRS — модифицированная шкала Рэнкина; ESS — Европейская шкала инсульта, F-M — шкала Фугл-Мейера, НСК/НПК — нейральные стволовые/прогениторные клетки.

Note: МСК — mesenchymal stem cells; ЭПК — endothelial progenitor cells; СК — stem cells; NIHSS — National Institutes of Health Stroke Scale; mBI — modified Barthel Index, mRS — modifided Ranken scale; ESS — European Stroke Scale, F-M — Fugl-Meyer scale, NSC/NPC — neural stem/progenitor cells.

 

Трансплантация аутологичных МСК

Одно из первых клинических исследований по клеточной терапии ИИ с помощью трансплантации МСК было проведено в 2005 году O.Y. Bang и соавт. [50]. В исследование было включено 5 человек, которым осуществляли внутривенную трансплантацию аутологичных костномозговых МСК в дозе 100 млн клеток (для культивирования клеточной культуры использовали среды, содержащие фетальную бычью сыворотку) через 5–7 недель от момента начала заболевания. В исследовании не зафиксировано серьёзных побочных эффектов, и трансплантация была признана безопасной. Кроме того, у пациентов, получавших клеточную терапию, по сравнению с контрольной группой, состоявшей из 25 человек, отмечено стойкое клиническое улучшение и уменьшение степени выраженности неврологического дефицита через 3, 6 и 12 месяцев после трансплантации.

Основываясь на успехе этого первого исследования, та же группа впоследствии провела более крупное слепое исследование II фазы с участием уже большего числа пациентов (52 человека) [51]. В данном исследовании внутривенную трансплантацию МСК выполняли в два этапа — начальную дозу 50 млн, через 2 недели — ещё дополнительные 50 млн клеток. В исследовании также была признана безопасность внутривенной трансплантации МСК. Авторы сообщили, что использование бычьей сыворотки для культивирования МСК не приводило к зоонозам или другим неблагоприятным эффектам. В группе с клеточной терапией наблюдали более высокий уровень функционального восстановления и более низкую смертность по сравнению с контрольной группой.

Ввиду того, что научное сообщество выражало обеспокоенность использованием для культивирования МСК сред и сывороток, полученных от животных, из-за риска передачи прионных заболеваний, было инициировано ещё одно клиническое исследование, в котором МСК культивировали в аутологичной сыворотке [52]. В данном исследовании O. Honmou и соавт. производили внутривенную трансплантацию костномозговых МСК пациентам спустя 36–133 дня от момента ИИ. Результаты подтвердили безопасность и осуществимость культивирования аутологичных костномозговых МСК с использованием аутологичной сыворотки человека. У пациентов не выявлено существенных нежелательных явлений. В группе пациентов с клеточной терапией была отмечена тенденция к уменьшению неврологического дефицита, а также значимое уменьшение размеров очага инфаркта мозга спустя 1 неделю после внутривенной трансплантации.

A. Bhasin и соавт. в 2011 году [53] впервые трансплантировали пациентам с ИИ аутологичные костномозговые МСК, которые культивировали на бессывороточной среде. В исследовании I/II фазы МСК вводили внутривенно 12 пациентам с ИИ в раннем и позднем восстановительных периодах (от 3 месяцев до 1 года от начала заболевания). Данные сравнивали с группой контроля (6 человек). В группе с клеточной терапией МСК на фоне отсутствия серьёзных нежелательных явлений отмечалась тенденция к уменьшению степени выраженности неврологического дефицита, однако при сравнении с группой контроля эти изменения были статистически незначимыми. В 2013 году та же научная группа инициировала ещё одно клиническое испытание [54], в котором эффективность МСК сравнивали с гемопоэтическими/мононуклеарными клетками. Результаты также подтвердили безопасность и осуществимость клеточной терапии с использованием МСК. У пациентов при тенденции к улучшению неврологического дефицита вновь статистически значимых различий с группой контроля выявлено не было.

В 2019 году J. Fang и соавт. [55] опубликовали результаты клинического рандомизированного плацебоконтролируемого исследования I/IIa фазы, в котором аутологичные костномозговые МСК трансплантировали пациентам с ИИ внутривенно. Для культивирования МСК использовали фетальную бычью сыворотку. Оценку эффективности проводили спустя 1 неделю от момента начала заболевания. Сначала производили забор костного мозга для выделения и культивирования аутологичных МСК, затем вводили их внутривенно в два этапа: первую дозу — 2,5 млн клеток на килограмм массы тела — через 4 недели и повторно — аналогичную дозировку спустя неделю. Терапевтическую эффективность и безопасность сравнивали между группами — с трансплантацией МСК (6 человек) и плацебо (6 человек), которым внутривенно вводили аутологичные эндотелиальные прогениторные клетки. Период наблюдения составил 4 года. Исследование было признано безопасным. Между группами с клеточной терапией и группой плацебо не выявлено статистически значимых различий по показателям выживаемости и степени функционального восстановления. Возможная причина недостаточно выраженного терапевтического действия — введение МСК в подостром периоде ишемического инсульта. Данная проблема может быть решена путём трансплантации пациентам в острую фазу ИИ аллогенных стволовых клеток.

Трансплантация аллогенных нативных МСК

МСК легко размножаются в культуре, слабо экспрессируют антигены главного комплекса гистосовместимости HLA-ABC, а HLA-DR практически не экспрессируют [64, 65], что делает возможным их аллогенную трансплантацию [66]. Аллогенная трансплантация имеет важные преимущества для терапии неврологических заболеваний. Во-первых, это существенно удешевляет и упрощает производство и позволяет заранее создать банк стандартизованных и охарактеризованных МСК, которые можно подготовить в любой момент в требуемом количестве, что делает возможным их применение в острейшем периоде ИИ. Во-вторых, важную роль играет возраст доноров. Согласно данным эпидемиологических исследований, более 75% всех случаев ИИ приходится на возраст старше 65 лет [67]; в этом возрасте получение МСК из костного мозга сопряжено с большими сложностями, а регенераторный потенциал таких МСК существенно ниже, чем у МСК, полученных от молодых доноров, что объясняется естественными процессами старения организма [68].

Крупнейшее на сегодняшний день рандомизированное двойное слепое плацебоконтролируемое исследование II фазы MASTERS по изучению влияния трансплантации аллогенных МСК при ИИ было проведено на базе 33 медицинских центров в США и Великобритании [56]. В исследовании изучали безопасность и эффективности клеточного продукта MultiStem, представляющего из себя аллогенные костномозговые МСК, полученные от взрослых доноров [69]. МСК вводили пациентам в дозе 400 млн, либо 1,2 млрд клеток внутривенно спустя 24–48 часов от момента заболевания. Безопасность данной технологии подтверждена при введении обеих дозировок МСК, однако при сравнении группы клеточной терапии с группой плацебо первичная конечная точка (ожидаемая степень улучшения функционального состояния больных) спустя 90 дней после ИИ не была достигнута. Важно отметить, что при ретроспективном анализе (post-hoc) полученных результатов у части больных с функциональным восстановлением всё же было статистически значимое улучшение. Эти данные позволили исследователям начать следующий этап клинического испытания — проспективное рандомизированное плацебоконтролируемое двойное слепое исследование III фазы (MASTERS-2) в период между 18 и 36 часами после появления неврологического дефицита. Исследование на текущий момент продолжается, результаты не опубликованы.

В I/II фазе исследовании M.L. Levy и соавт. [57] оценивали безопасность и эффективность аллогенных костномозговых МСК, полученных от одного здорового донора. МСК трансплантировали внутривенно в дозе до 1,5 млн клеток на килограмм массы тела 38 пациентам в позднем восстановительном периоде ИИ (>6 месяцев от начала заболевания). Выявлена безопасность инфузии МСК, у всех пациентов отмечали выраженное функциональное восстановление по шкале Бартела, однако в данном исследовании отсутствовала группа контроля.

Трансплантация модифицированных аллогенных МСК

Группой учёных под руководством доктора G.K. Steinberg [58] в I/IIa фазе изучены безопасность и эффективность трансплантации пациентам с ИИ модифицированной линии аллогенных костномозговых МСК под аббревиатурой «SB623». SB623 представляет собой модифицированную линию костномозговых МСК, для получения которых применялась временная трансфекция при помощи плазмиды, содержащей внутриклеточный домен Notch1, что привело к гиперэкспрессии Notch1 (важно отметить, что плазмида Notch1 не реплицируется во время митоза и поэтому быстро теряется в период деления клеток). В доклинических исследованиях установлено, что Notch1-модифицированные МСК обладают нейротрофическим действием, улучшают выживаемость и поддерживают жизнеспособность нейронов при церебральной ишемии, способны также улучшать неоангиогенез и оказывать противовоспалительное действие [70–73]. На экспериментальных моделях ИИ продемонстрировано также функциональное восстановление и нейропротективное действие SB623 МСК на нейроны в периинфарктной области, при этом сами трансплантированные клетки в организме реципиента длительное время не сохранялись и не оказывали прямого замещающего действия [74]. В клинических исследованиях линию клеток SB623 вводили стереотаксически в головной мозг 18 пациентам в позднем восстановительном периоде ИИ (от 6 месяцев до 3 лет с момента начала заболевания) в дозах 2,5, 5 или 10 млн клеток. Каждому пациенту выполняли по 20 стереотаксических инъекций в зонах инфаркта мозга. Возникшие нежелательные явления, такие как головная боль, тошнота и рвота, авторы связывали с нейрохирургической операцией, а не с эффектами трансплантированных клеток. Реакции отторжения трансплантатов не наблюдалось. Показано значимое функциональное восстановление пациентов через 3, 6 и 12 месяцев. Стоит отметить, что достигнутое клиническое улучшение состояния пациентов сохранялось спустя 2 года после трансплантации [75]. В связи с обнадёживающими результатами начато более крупное рандомизированное клиническое исследование фазы IIб, результаты которого ещё не опубликованы.

Комбинированная трансплантация МСК и других типов стволовых/прогениторных клеток

В доклинических исследованиях установлено, что МСК способны секретировать большой спектр паракринных факторов и оказывать трофическое, нейропротективное, противовоспалительное и иммуномодулирующее действие [46, 76]. В связи с этим высказана гипотеза, что совместная (комбинированная) трансплантация МСК вместе с другими типами стволовых/прогениторных клеток может улучшить приживаемость трансплантата и усилить терапевтические эффекты клеточной терапии. В серии исследований на животных с моделями экспериментального инфаркта головного мозга удалось подтвердить, что комбинированная трансплантация МСК с нейральными [77] или эндотелиальными прогениторными клетками [78] может оказывать более выраженное действие по сравнению с монотерапией только одним видом стволовых/прогениторных клеток [76]. Высказано предположение, что этот феномен может быть связан с синергией терапевтических эффектов двух разных типов стволовых клеток. На основании обнадёживающих данных доклинических исследований осуществлено несколько клинических исследований, посвящённых комбинированной трансплантации МСК и других типов стволовых клеток пациентам с ИИ.

T.S. Chen и соавт. [79] провели пилотное клиническое исследование, в котором 10 пациентам с ишемическим или геморрагическим инсультом в позднем восстановительном периоде (от 6 месяцев до 20 лет) трансплантировали аллогенные МСК, полученные из пуповинной крови, совместно с различными фетальными клетками нейрального происхождения (нейральными прогениторными клетками, клетками обонятельной выстилки, шванновскими клетками, выделенными из седалищного нерва). МСК трансплантировали внутривенно, другие типы клеток вводили интрацеребрально или интратекально. В результатах исследования отмечено улучшение клинического состояния пациентов без выраженных побочных реакций, однако число пациентов в каждой группе было очень мало.

L.Y. Qiao и соавт. [59] оценивали безопасность и целесообразность комбинированной трансплантации человеческих фетальных нейтральных прогениторных клеток и аллогенных МСК, выделенных из пуповинной крови. В исследование было включено 8 пациентов с ИИ с разными сроками после начала заболевания (от 1 недели до 2 лет). Первой группе пациентов МСК вводили внутривенно 4 раза в дозе 500 тыс. клеток на килограмм массы тела, во второй группе выполняли их однократную внутривенную инфузию, после чего три последовательные инъекции МСК и нейральных прогениторных клеток в цистерны мозга. Установлено, что комбинированная трансплантация МСК и нейральных прогениторных клеток осуществима и безопасна. У каждого пролеченного пациента наблюдалось клиническое улучшение, которое сохранялось также в течение 2 лет после трансплантации, и в течение этого периода не наблюдалось органной онкогенной трансформации.

Для подтверждения полученных данных целесообразно дальнейшее проведение рандомизированных плацебоконтролируемых многоцентровых клинических исследований на большой выборке пациентов с ИИ.

Механизмы действия МСК

На сегодняшний день проведено большое количество доклинических фундаментальных исследований, посвящённых изучению не только эффективности, но и механизмов действия МСК при экспериментальном ИИ [80]. Ниже приводятся известные на текущий момент обобщённые данные о механизме терапевтического действия МСК при ИИ с позиции доказательной медицины.

Несмотря на то, что МСК являются мультипотентными стволовыми клетками и способны к дифференцировке в разные типы клеток мезодермального происхождения, они имеют, по мнению ряда учёных, низкий и даже отсутствующий потенциал к трансдифференцировке в нейрональном (эктодермальном) направлении [20]. С учётом вышесказанного, прямой замещающий механизм действия, т.е. дифференцировка в нейральные и/или глиальные клетки в очаге инфаркта головного мозга, является маловероятной. Описаны единичные случаи, когда после интрацеребрального введения некоторые из трансплантированных МСК in vivo теряли экспрессию специфических маркеров и приобретали нейронопободный фенотип [81]. В то же время существует множество данных, указывающих на то, что терапевтический потенциал МСК связан с их паракринным действием — способностью секретировать противовоспалительные цитокины, факторы роста, а также экзосомы, нагруженные биологически активными веществами (микроРНК, цитокины, факторы роста и т.д.) [82]. Помимо этого, результаты нескольких работ свидетельствуют о способности МСК к «клеточному слиянию» (cell fusion) с другими клетками, что может быть одним из механизмов тканевой регенерации [83]. Показано, что при инфузии МСК возможно прямое нейропротективное действие путём переноса компонентов митохондрий и цитоплазмы из трансплантированных МСК в нервные и глиальные клетки реципиента [84]. В ряде исследований после трансплантации МСК было выявлено усиление эндогенного нейрогенеза у животных-реципиентов [85–87].

Итак, на данный момент превалирует концепция, что в основе терапевтического воздействия МСК лежит паракринный эффект, а не способность к клеточной дифференцировке или другие механизмы [88, 89]. К факторам, секретируемым МСК, влияющим на регенерацию тканей, снижение воспаления, ангиогенез и другие процессы, относятся цитокины, модулирующие иммунный ответ, например интерлейкин 6 (IL-6), а также регуляторные молекулы VEGF, IGF-1, IGF-2, и PDGF-AA, что подтверждается их детекцией в кондиционной среде, в которой МСК культивировали. Анализ транскриптома выявил также, что МСК человека отличаются от фибробластов, остеобластов, хондроцитов, адипоцитов (и, предположительно, ряда других типов дифференцированных клеток) повышенной экспрессией ряда молекул: в частности, уровня нейротрофического фактора мозга (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) — примерно в 20 раз, IL-6 — в 60 раз, фактора роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF) — в 20 раз [90]. Нейропротекторная роль BDNF, секретируемого человеческими клетками МСК, подтверждена экспериментально [91]. Кроме того, трансплантация МСК может инициировать увеличение продукции VEGF и основного фактора роста фибробластов (basic fibroblast growth factor, bFGF) клетками реципиента, как было показано на модели ишемии головного мозга у крыс [92]. Примечательно, что IL-6 помимо своей «классической» роли провоспалительного цитокина [93] может выполнять ряд функций, крайне важных в контексте регенерации и стволовости: в поддержании «стволового» фенотипа МСК [94], способности активировать регенерацию аксонов в определённых условиях, что было продемонстрировано на зрелых ганглиозных клетках сетчатки [95].

В настоящее время предпринимаются попытки определить молекулярный состав биологически активных веществ в экзосомах, секретируемых МСК. Так, в экзосомах МСК из жировой ткани обнаружен 591 белок, причём их основными функциями, согласно генной онтологии (Gene Ontology), являются передача сигнала (GO:0007165), клеточная адгезия (GO:0007155), позитивная регуляция пролиферации (GO:0008284), иммунный ответ (GO:0006955) и т.д. [96]. В составе экзосом выявлены также 489 микроРНК из разных семейств микроРНК: превалирующими являются семейства mir-515 и mir-10. Считается, что значительная доля микроРНК в секретируемых МСК экзосомах находится в виде микроРНК-предшественников [79]. Биоинформатический анализ показывает, что некоторые из них вовлечены в регулирование воспалительных процессов (например, микроРНК hsa-let-7g-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-92a-3p) или негативную регуляцию активации макрофагов (hsa-miR-124-3p) [97]. Помимо этого, показано, что мишенями микроРНК секретируемых МСК в составе экзосом могут быть сигнальный путь Wnt, профибротические сигнальные каскады TGF-β (transforming growth factor-β) и PDGF (platelet-derived growth factor), а также сигнальные пути, регулирующие клеточную пролиферацию и апоптоз [98].

Иммуномодулирующее действие МСК основывается, в частности, на их влиянии на поляризацию макрофагов в области повреждения. Поляризация макрофагов в сторону фенотипа М2 (противовоспалительный фенотип) может происходить в ответ на активирующее воздействие ряда цитокинов, таких как IL-4, IL-10 и IL-13. Такая поляризация является одним из ключевых этапов повреждения центральной нервной системы, так как в зависимости от их фенотипа (активации в провоспалительные М1 или противовоспалительные М2) макрофаги могут либо участвовать во вторичном повреждении ткани, либо способствовать её восстановлению [99]. Показано, что МСК за счёт секреции регуляторных молекул влияют на поляризацию макрофагов в сторону М2 [100]. Примечательно, что такая поляризация может регулироваться не только цитокинами, но и нуклеиновыми кислотами, входящими в состав экзосом, секретируемых МСК. Например, такой функцией обладает длинная некодирующая РНК LncGm37494, способная стимулировать поляризацию макрофагов в направлении M2 за счёт ингибирования микроРНК miR-130b-3p и стимулирования экспрессии PPARγ [101]. Кроме этого, МСК могут влиять на баланс субпопуляций Т-клеток, в частности Treg Th17, как было показано in vitro [102], что в свою очередь может приводить к восстановлению повреждённой ткани. Они воздействуют также на Вreg-клетки, (механизм такого воздействия малоизучен) [103], при этом и Treg, и Вreg — это ключевые супрессоры воспаления и аутоиммунных реакций.

МСК могут влиять на состояние внеклеточного матрикса — важнейшего компонента клеточного микроокружения, регулирующего клеточную дифференцировку, миграцию и восстановление повреждённой ткани. МСК продуцируют и депонируют компонент внеклеточного матрикса фибронектин, что в свою очередь может способствовать регенерации ткани, как это продемонстрировано на модели спинномозговой травмы [104]. Наконец, МСК секретируют проангиогенные факторы, что подробно освещено в недавних публикациях. К таким факторам относятся факторы роста, регуляторные нуклеиновые кислоты, в том числе секретируемые в составе внутриклеточных везикул. МСК секретируют в составе экзосом факторы EGF, FGF-2, ANGPT1, ANG, PDGF, TGF-α, TGF-β, VEGF [105], регуляторные нуклеиновые кислоты, влияющие на ангиогенез (к таковым относятся проангиогенные микроРНК, в частности miR-30b) [106].

Стратегии развития клеточной терапии с использованием МСК

Ни в одном из проведённых на текущий момент клинических исследований у пациентов с ИИ после трансплантации МСК не было выявлено серьёзных нежелательных явлений. Во всех исследованиях отмечались тенденция к улучшению состояния пациентов и уменьшение выраженности неврологического дефицита. Важно отметить, что в исследованиях с участием людей, в которых была проведена рандомизация пациентов и включена группа контроля не во всех случаях продемонстрировано статистически значимое положительное влияние клеточной терапии МСК. Среди возможных причин недостаточно выраженного клинического эффекта можно отметить неоптимальные параметры клеточной трансплантации и критерии включения пациентов в исследования, такие как ограниченное «терапевтическое окно», разброс до нескольких месяцев в сроках инфузии МСК, проведение терапии в позднем восстановительном периоде ИИ, включение в группу сравнения пациентов с большой разницей в возрасте (от детского/юношеского до старческого), введение аутологичных МСК от доноров пожилого и старческого возраста. Очень важные факторы — выбор способа трансплантации и кратности введения МСК. В большинстве проведённых исследований МСК вводились внутривенно однократно или дважды в период терапии. По данным последних доклинических исследований продемонстрирована высокая эффективность внутриартериального способа введения стволовых клеток, благодаря которому возможно осуществить адресную доставку трансплантированных клеток в церебральные сосуды, минуя паренхиматозные органы [44]. Выбор оптимального «терапевтического окна» и способа трансплантации напрямую зависит от предполагаемых механизмов действия стволовых клеток, которые необходимо ещё изучать.

Одной из стратегий дальнейшего развития клеточной терапии ИИ является модификация и унификация протоколов использования МСК с целью их оптимизации. В настоящий момент, основываясь на первых результатах, в ряде стран начаты рандомизированные плацебоконтролируемые многоцентровые клинические исследования на большой выборке пациентов с модифицированными протоколами клеточной трансплантации, результаты которых будут известны в течение ближайших нескольких лет [107].

Помимо продолжения клинических испытаний, крайне важной стратегией развития клеточной терапии с использованием МСК является и продолжение трансляционных фундаментальных исследований на моделях экспериментального инфаркта головного мозга у лабораторных животных с целью уточнения механизмов действия трансплантированных стволовых клеток и оптимизации протоколов трансплантации для их последующего внедрения в клиническую практику. В трансляционных исследованиях целесообразна оценка эффективности терапии МСК у животных обоих полов, разных возрастов, с сопутствующей патологией (сахарный диабет, артериальная гипертензия) [108, 109]. Целесообразно также изучение механизмов терапевтического действия МСК и способов их усиления: например, применение комбинированной трансплантации МСК совместно с нейрональными прогениторными клетками, полученными современными методами без использования тканей эмбриона и плода человека [34, 110].

Для оценки эффективности клеточной терапии МСК в доклинических исследованиях важно использование объективных количественных методов оценки терапии, в частности степени выраженности неврологического дефицита, таких как кинематика парализованной конечности, оценка объёма очага инфаркта головного мозга и т.п. Более широкое внедрение новых методов на доклиническом уровне позволит в будущем выбрать наилучшие способы объективизации результатов оценки клеточной терапии и использовать их при создании дизайна клинических исследований. Оценка объёма очага инфаркта головного мозга является одним из наиболее важных объективных количественных параметров оценки качества клеточной терапии. Морфометрический анализ очага инфаркта мозга может быть осуществлён в экспериментальных исследованиях, главным образом при помощи гистологического исследования [111, 112] и/или магнитно-резонансной томографии (МРТ) [111, 112]. В доклинических исследованиях на экспериментальных моделях церебральной ишемии использование МРТ позволяет оценивать динамику изменения объёма очага инфаркта головного мозга без необходимости выведения животных из эксперимента для проведения гистологического анализа для каждой временной точки. При переносе на клинические исследования МРТ позволяет прижизненно (in vivo) объективно оценивать у пациента динамику развития патологического процесса в головном мозге до и после лечения [113–115]. Для количественной оценки получаемых данных МРТ перспективным методом является полностью автоматический подход с использованием параметрического анализа изображений [116] или свёрточных нейронных сетей [117], при котором максимально нивелируется субъективный вклад оператора при оценке полученных им данных. Однако процесс выполнения морфометрического анализа очага инфаркта головного мозга для повышения объективности оценки необходимо стандартизировать, чтобы оптимально использовать его при поступлении пациента в стационар. Одним из методов является способ сегментации [118] путём выделения интересующей области на серии изображений. Данный подход позволяет избежать ошибок ввиду субъективности оценки объёма очага оператором или нескольких операторов без усреднения их оценки.

Разработка и апробация способов автоматической объективной оценки эффективности клеточной терапии при инфаркте головного мозга в доклинических и клинических исследованиях способны создать прочный фундамент для качественной оценки полученных результатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании анализа проведённых клинических испытаний безопасности и эффективности клеточной терапии ИИ можно сделать вывод, что трансплантация МСК на ранних ИИ является безопасной и патогенетически обоснованной.

Целесообразно продолжение исследований в этом направлении, в том числе инициация первых клинических испытаний на территории Российской Федерации. С позиций доказательной медицины необходимо проведение клинических исследований на большой выборке пациентов с рандомизацией и адекватным подбором группы контроля, модификацией критериев включения пациентов в исследование и протоколов трансплантации МСК. Не менее важно продолжение фундаментальных доклинических исследований по изучению механизмов действия клеточной терапии, выбору наиболее оптимального временного окна, способов и кратности введения стволовых клеток.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 23-25-00300). Работа Д.А. Чудаковой выполнена при поддержке ФМБА России.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Д.Д. Наместникова, Д.Б. Коваленко, И.А. Покусаева, Д.А. Чудакова — сбор и анализ данных, написание рукописи, концепция и дизайн, редактирование рукописи; И.Л. Губский, К.Н. Ярыгин, В.П. Баклаушев — написание рукописи, концепция и дизайн, редактирование рукописи. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This work was supported by the Russian Science Foundation (project No. 23-25-00300). Work by D.A. Chudakova carried out with the support of the Federal Medical and Biological Agency of Russia.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. D.D. Namestnikova, D.B. Kovalenko, I.A. Pokusaeva, D.A. Chudakova — data collection and analysis, manuscript writing, editing, research concept and design; I.L. Gubskiy, K.N. Yarygin, V.P. Baklaushev — manuscript writing, editing, research concept and design. The authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

About the authors

Daria D. Namestnikova

Federal Center of Brain Research and Neurotechnologies; Pirogov Russian National Research Medical University

Author for correspondence.
Email: dadnam89@gmai.com
ORCID iD: 0000-0001-6635-511X
SPIN-code: 1576-1860

MD, PhD, Research Associate

Russian Federation, Moscow; Moscow

Daria B. Kovalenko

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: daarrr.iii01@gmail.com
Russian Federation, Moscow

Irina A. Pokusaeva

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: pokusaeva.i@yandex.ru
Russian Federation, Moscow

Daria A. Chudakova

Federal Center of Brain Research and Neurotechnologies

Email: daria.chd@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9354-6824
SPIN-code: 1410-9581

PhD, Senior Research Associate

Russian Federation, Moscow

Ilya L. Gubskiy

Federal Center of Brain Research and Neurotechnologies; Pirogov Russian National Research Medical University

Email: gubskiy.ilya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1726-6801
SPIN-code: 9181-3091

MD, PhD, Senior Research Associate

Russian Federation, Moscow; Moscow

Konstantin N. Yarygin

Institute of Biomedical Chemistry

Email: kyarygin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2261-851X
SPIN-code: 7567-1230

PhD, Professor

Russian Federation, Moscow

Vladimir P. Baklaushev

Federal Center of Brain Research and Neurotechnologies; Pirogov Russian National Research Medical University; Federal Scientific and Clinical Center for Specialized Medical Assistance and Medical Technologies of the Federal Medical Biological Agency

Email: baklaushev.vp@fnkc-fmba.ru
ORCID iD: 0000-0003-1039-4245
SPIN-code: 3968-2971

PhD, Assistant Professor

Russian Federation, Moscow; Moscow; Moscow

References

Supplementary files