Additional diagnostic capabilities in the practice of a PAP-test using liquid-based cytology

Full Text

Список сокращений

ВПЧ — вирус папилломы человека

ВПЧ-ВР — вирус папилломы человека высокого онкогенного риска

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖЦ — жидкостная цитология

мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота

ПАП-тест — цервикальный мазок по Папаниколау

РШМ — рак шейки матки

ASCUS (atypical squamous cells undetermined significance) — атипичные клетки плоского эпителия неопределенного значения

ASC-H (atypical squamous cells cannot exclude HSIL) — атипичные клетки плоского эпителия, не исключающие HSIL

CIN (cervical intraepithelial neoplasia) — цервикальная интраэпителиальная неоплазия

HPV (human papilloma virus) — вирус папилломы человека

HSIL (high-grade squamous intraepithelial lesion) — высокая степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения

LSIL (low-grade squamous intraepithelial lesion) — низкая степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения

RT-qPCR (real-time quantitative polymerase chain reaction) — количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

ОБОСНОВАНИЕ

Ежегодно инфицирование проонкогенными штаммами вируса папилломы человека (ВПЧ) становится причиной 570 000 новых случаев рака шейки матки (РШМ) в мире [1]. В России в 2019 г. злокачественные новообразования шейки матки были выявлены у 73 918 женщин (22,25 на 100 000 населения), при этом РШМ в стадии in situ диагностирован только в 4964 (28,2%) случаях. Показатель заболеваемости РШМ в Российской Федерации в 2019 г. находился на пятом месте среди всех злокачественных новообразований у женщин (5,0%).

РШМ является причиной смерти женщин моложе 30 лет в 8,0% случаев, а в возрасте 30–39 лет — в 24% [2].

В настоящее время для выявления предраковых поражений и РШМ следует придерживаться стратегии котестирования (цитологический + ВПЧ-анализ) последних клинических рекомендаций [3]. Цитологическое исследование может выполняться как традиционным, так и методом жидкостной цитологии, при использовании которого уменьшается процент некачественных мазков и существенно возрастает точность диагностики [4–6].

Жидкостная цитология (ЖЦ) — метод приготовления цитологических препаратов, при котором клетки перед фиксацией на предметном стекле погружаются в консервирующую жидкость, что позволяет улучшить качество и стандартизировать методику цитологического исследования [7]. ЖЦ все чаще используется в скрининге РШМ [8]. Чувствительность выявления ≥ CIN (cervical intraepithelial neoplasia) III при цитологическом исследовании составляет от 46 до 50%, в то время как при ВПЧ-тестировании — 86–97%; ≥ CIN II — 38–65 и 63–98% соответственно [9]. Хотя общий риск инфицирования штаммами ВПЧ высокого онкогенного риска (ВПЧ-ВР) достаточно высок, более чем в 90% случаев инфекция элиминируется в течение 24 мес [10, 11].

Ограниченная чувствительность скрининга на основе только цитологического исследования обусловила внедрение первичного ВПЧ-тестирования в Великобритании, Нидерландах, Сан-Марино, Турции и Германии [12, 13], однако результатами ряда исследований были подтверждены низкая положительная прогностическая значимость и низкая специфичность (от 30 до 60% при обнаружении ≥ CIN III) ВПЧ-скрининга для выявления предраковых процессов и РШМ [14–18].

С целью дифференциальной диагностики тяжести поражения шейки матки наряду с ВПЧ-тестированием может производиться иммуноцитохимическое исследование для определения коэкспрессии онкобелков p16/Ki67 [3]. Совместное выполнение иммуноцитохимического и цитологического исследования несколько улучшает чувствительность и специфичность тестирования [19–22], но является достаточно субъективным, что накладывает ограничения на его использование [19, 23].

Таким образом, существует потребность в поиске новых, эффективных и специфичных биологических маркеров, которые точно и быстро определяют стадии развития патологического процесса шейки матки, что будет способствовать ведению пациента без излишнего медицинского вмешательства. С целью оптимизации молекулярно-генетических исследований следует рассмотреть использование остаточного материала консервирующей жидкости, применяемой при ЖЦ [24–27].

Цель — проанализировать возможности улучшения медицинской сортировки пациенток с предраковыми процессами шейки матки с помощью метода жидкостной цитологии с окраской по Папаниколау (ПАП-тест).

Анализ микроРНК

МикроРНК — короткие некодирующие РНК, состоящие в среднем из 22 нуклеотидов. Многие микроРНК тканеспецифичны и являются посттранскрипционными регуляторами экспрессии генов путем связывания оснований с целевыми РНК-носителями. МикроРНК могут быть сверхэкспрессированы или подавлены при раке и связаны с генетическими (например, делеции, амплификации и точечные мутации) и эпигенетическими (модификации гистонов и аберрантное метилирование ДНК) изменениями [28, 29].

В исследованиях, в которых для тестирования использовался остаточный материал ЖЦ, показана потенциальная эффективность применения в качестве молекулярного маркера прогрессирования плоскоклеточных интраэпителиальных поражений некоторых микроРНК (miR-34a, miR- 218, miR-375, miR-424, miR-125b и let-7c) [30–32]. В частности, исследователи заявляют, что по сравнению с ПАП-тестом обнаружение как miR-424, так и miR-375 обеспечивает более высокую чувствительность (76,0 и 74,9 против 63,8%; p <0,05) и сопоставимую специфичность при идентификации ≥ CIN II [32].

Анализ метилирования ДНК

Другим молекулярным маркером предраковых поражений и РШМ в современной литературе обсуждается анализ метилирования ДНК у ВПЧ-ВР-положительных пациентов. Метилирование ДНК — это индуцированная ферментом химическая модификация богатых цитозин-гуанином динуклеотидных участков (CpG-островков) в промоторных и/или кодирующих областях генов, приводящая к нормальным эпигенетическим функциональным изменениям генома. Аберрантное метилирование промотора гена — один из важных механизмов транскрипционной репрессии гена в процессе канцерогенеза [33, 34]. В литературе сообщается об эффективности как анализа метилирования ДНК человека, так и ДНК ВПЧ. Наиболее полно метилирование последовательности генома ВПЧ было изучено для вируса 16-го типа. Авторы сообщают, что гиперметилирование областей L1, L2, E2 и E4 связано с повышенным риском поражения ≥ CIN II при чувствительности 91% и специфичности 60% [35–37].

Сообщается, что более 100 генов человека являются возможными биомаркерами метилирования РШМ [38]. Проведено исследование оценки клинической эффективности молекулярного сортировочного теста на основе метилирования QIAsure Methylation Test (Qiagen, Нидерланды) по материалу ПАП-теста ThinPrep (Hologic, США) и SurePath (Becton, Dickinson and Company, BD, США). QIAsure Methylation Test — это тест-система на основе мультиплексной, специфичной к метилированию полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени для выявления гиперметилирования промоторов генов FAM19A4 и hsa-mir124-2. Тест был оценен в 2384 ВПЧ-положительных образцах, полученных у женщин в возрасте 29–76 лет из четырех стран мира (Шотландия, Дания, Словения, Нидерланды). В 899 случаях результаты QIAsure Methylation Test были сопоставлены с таковыми гистологического исследования: по результатам последнего, в 527 (58,6%) случаях не было выявлено предраковых поражений, в 124 подтверждена CIN II (5,2%), в 228 — CIN III (9,6%), в 20 — РШМ (0,8%). Авторы сообщают, что 19 из 20 выявленных образцов РШМ имели модификацию молекулы ДНК. Таким образом, чувствительность для группы РШМ составила 95%, для CIN II — 46,8%, для CIN III — 77,2%, для SCC — 95%, при этом общая специфичность для группы ≥ CIN II составила 78,3% [39].

Проведено также сравнение двух наиболее известных, коммерчески доступных диагностических тестов на основе метилирования ДНК — GynTect® (поиск метилированных участков ДНК в промоторных-/5’-областях генов ASTN1, DLX1, ITGA4, RXFP3, SOX17 и ZNF671) и QIAsure Methylation Test — с ассоциированными маркерами метилирования FAM19A4 и hsa-mir124-2. Так, GynTect® на примере 95 соскобов с шейки матки показал значимо более высокую специфичность по сравнению с QIAsure Methylation Test: 87,6 против 67,4% (p <0,001) для ≥ CIN II и 84,1 против 68,2% (p=0,002) для ≥ CIN III. Авторы заявили также о высоких показателях метилирования FAM19A4 и hsa-mir124-2 в группе ВПЧ-ВР-положительных пациентов (52,4%), у которых CIN при гистологическом исследовании не получил подтверждения, при этом в другом исследовании показатель положительности теста на метилирование QIAsure Methylation Test составлял 23,2% для ВПЧ-ВР-положительных случаев без CIN [40, 41].

Помимо маркеров метилирования ASTN1, DLX1, ITGA4, RXFP3, SOX17, ZNF671 (GynTect®) и FAM19A4, hsa-mir124-2 (QIAsure Methylation Test) обсуждается также применение других детерминант. Так, маркерная панель CADM1/MAL/hsa-mir124-2 показала сходные характеристики при использовании материала ПАП-теста ThinPrep в качестве маркера сортировки ВПЧ-ВР-положительных пациентов (чувствительность 73,8%, специфичность 81,5%) [42]. Цитологические образцы ПАП-теста ThinPrep были использованы для оценки показателей метилирования EPB41L3 и JAM3 и дифференцирования случаев ≥ CIN II, диагностированных при гистологическом исследовании. Диагностическая точность метилирования ДНК сравнивалась со стратегиями на основе идентификации ВПЧ-ВР. Чувствительность оценки ≥ CIN II составила 72,13%, специфичность 91,53%, при этом чувствительность обнаружения ВПЧ-ВР достигла 89,62%, специфичность — 25,42% [43].

В другом исследовании анализ метилирования был выполнен для шести маркеров — ANKRD18CP, C13orf18, EPB41L3, JAM3, SOX1 и ZSCAN1. Биоматериал для исследования отбирался из остаточной консервирующей жидкости ThinPrep. Наиболее значимыми для обнаружения патологических изменений ≥ CIN II были показатели чувствительности и специфичности панели генов C13orf18/ EPB41L3/ JAM3 (80 и 66% соответственно) и панели SOX1/ZSCAN1 (63 и 84% соответственно) [44].

В исследовании, включавшем 205 образцов остаточного материала SurePath пациентов с различными результатами ПАП-теста, был проведен анализ метилирования ДНК четырех генов — ADCYAP1, PAX1, MAL и CADM. Клетки РШМ показали резко повышенный уровень метилирования всех четырех проанализированных генов. ADCYAP1 и PAX1 также имели тенденцию к повышенным уровням метилирования в образцах HSIL (high-grade squamous intraepithelial lesion). Чувствительность к метилированным ADCYAP1, PAX1, MAL и CADM1 для выявления РШМ составила 79,2; 75,0; 70,8 и 52,1%, а специфичность, соответственно, 92,0; 94,0; 94,7 и 94,0% [45].

Исследование экспрессии мРНК генов человека

В литературе подчеркивается ценность детекции мРНК с помощью количественной ПЦР в жидкостной цитологии как менее субъективного исследования, нежели морфологическая оценка цитологического или гистологического препарата, и позволяющего оценить всю слизистую оболочку шейки матки в отличие от иммуногистохимического окрашивания [46–48].

Del Pino и соавт. [47] впервые показали возможность использования детекции мРНК прогностических генов хозяина в остаточной консервирующей жидкости от материала для ЖЦ. В образцах 123 пациентов с цитологически и гистологически подтвержденными патологическими изменения эпителия шейки матки с помощью количественной ПЦР была проанализирована экспрессия мРНК 6 генов — CDKN2A, BIRC5, MMP9, TOP2A, MCM5 и MKI67. Исследование показало, что определение мРНК некоторых генов в остаточной консервирующей жидкости от материала для ЖЦ может быть полезным для обнаружения HSIL. Так, почти все исследуемые биомаркеры показали чувствительность к HSIL выше 81%. Оценка уровня экспрессии TOP2A продемонстрировала чувствительность, аналогичную тестированию на ВПЧ-ВР и лучшую (96%), чем цитология. Оценка уровня экспрессии CDKN2A/p16 при самой низкой чувствительности для диагностики HSIL продемонстрировала самую высокую специфичность (69%) по сравнению с другими биомаркерами. Комбинация оценки уровней экспрессии мРНК генов TOP2A и CDKN2A/p16 привела к адекватному балансу между чувствительностью и специфичностью и может быть использована при идентификации HSIL.

Исследование H.Y. Wang и соавт. [49] показало, что оценка коэкспрессии вирусной мРНК E6/ E7 и мРНК hTERT гена человека может использоваться в качестве метода сортировки предраковых поражений шейки матки высокой и низкой степени. В работе использовалась комбинация тестов CervicGen HPV RT-qDX для обнаружения мРНК E6/ E7 в 16 типах ВПЧ-ВР и CervicGen hTERT RT-qDX для исследования экспрессии hTERT (Optipharm, Osong, Корея) в диагностике поражений шейки матки высокой степени и злокачественных опухолей, а также для оценки прогнозируемых результатов с использованием 545 образцов ПАП-теста ThinPrep, при этом гистологически подтвержден 131 случай с использованием образцов биопсии или иссечения. Чувствительность и специфичность обнаружения мРНК E6/E7 с использованием множественной RT-qPCR в 545 образцах ПАП-теста ThinPrep составляли 91,1 и 96,7% соответственно по сравнению с цитологическими диагнозами. В образцах, которые были гистологически верифицированы как РШМ, CIN III, CIN II и CIN I, мРНК E6/E7 экспрессировалась в 95; 88; 100 и 50% случаев соответственно. Доля образцов, положительных по экспрессии мРНК hTERT, составляла 88,9; 100 и 100% для цитологически идентифицированных образцов РШМ, HSIL и ASC-H соответственно. Процент образцов, положительных для анализа мРНК hTERT, составлял 95,5; 100; 100 и 100% для образцов с гистологически диагностированным РШМ, CIN III, CIN II и CIN I соответственно. Уровень экспрессии мРНК hTERT был значимо выше при ASC-H и HSIL/РШМ (p=0,0001) по сравнению с образцами без патологических изменений. Уровни экспрессии мРНК hTERT во всех нормальных (n=288) образцах были ниже порогового значения, и поэтому специфичность RT-qPCR мРНК hTERT составляла 100%. Соответственно, анализ уровней экспрессии hTERT может использоваться для уменьшения ложноотрицательных результатов при цитологическом исследовании, но только в качестве дополнения к морфологическому исследованию.

Комбинация результатов оценки экспрессии мРНК E6/E7 и hTERT показала 100% чувствительность в случаях HSIL и РШМ и 100% — в образцах LSIL (low-grade squamous intraepithelial lesion) и ASC-US (atypical squamous cells undertermined significance — атипичные клетки плоского эпителия неопределенного значения), которые были гистологически диагностированы как предраковые поражения, при этом детекция ДНК ВПЧ была ниже (56,8%).

В одном из наших предыдущих исследований [50] мы оценили возможность проведения дифференцировки пациенток с ≥ CIN II и ≤ CIN I на основе экспрессии 21-генной панели мРНК методом количественной ПЦР в материале консервирующей жидкости флакона с образцами ПАП-теста CellPrep.

Для оценки возможности дифференцировки пациенток с ≥ CIN II и ≤ CIN I была оценена экспрессия мРНК 21-генной панели. Уровень экспрессии мРНК 21 гена (Ki-67, STK-15, CCNB1, CCND1, MYC, MYBL2, P16INK4A, PTEN, BIRC5, BCL2, BAG1, TERT, NDRG1, ESR1, PGR, HER2, GRB7, MGB1, MMP11, CTSL2, CD68) определяли методом количественной ПЦР в материале консервирующей жидкости флакона после ПАП-теста CellPrep у 59 пациенток, проходивших лечение в ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России в 2015–2016 гг. Критерием достоверности были результаты сопоставления с последующим гистологическим исследованием. По данным дискриминантного анализа установлено, что сочетанная оценка уровней экспрессии мРНК генов ESR1 и MYBL2 позволяет провести правильную классификацию для пациенток с изменениями ≥ CIN II в 88,24% случаев, а для пациенток с гистологически подтвержденной ≤ CIN I — в 84,0%. Сочетанная оценка уровней экспрессии мРНК 17 генов (ESR1, MYBL2, CD68, PTEN, CCND1, BCL2, HER2, MMP11, TERT, STK15, P16INK4A, BAG1, CTSL2, KI67, CCNB1, GRB7, NDRG1) позволяет с точностью 98,3% дифференцировать группы ≥ CIN II и ≤ CIN I. Совпадение классификации с данными гистологического исследования для группы ≥ CIN II составило 100,0% случаев, для группы с гистологически подтвержденной ≤ CIN I — 96,0%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время в Российской Федерации рекомендовано котестирование с использованием цитологического метода в качестве первичной сортировки с последующим ВПЧ-ВР-исследованием, которое характеризуется большей чувствительностью, определяющим необходимость направления пациента на кольпоскопию. Исследование новых молекулярно-генетических предикторов, получившее развитие в последнее десятилетие, поможет улучшить возможности сортировки пациентов, что будет способствовать оптимизации объема диагностических и лечебных мероприятий. Внедрение методов такой количественной оценки в качестве дополнения к существующей морфологической оценке позволит более эффективно решать проблему выявления предраковых поражений шейки матки.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Участие авторов. А.К. Аксаментов — анализ литературы, написание рукописи; В.П. Баклаушев, Н.В. Мельникова — идея и концепция обзора, анализ литературы, редактирование рукописи; Н.А. Колышкина, О.Н. Кучерова — анализ литературы с точки зрения клинической релевантности, редактирование рукописи. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Источник финансирования

Поисково-аналитическая работа проведена на личные средства авторского коллектива.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

About the authors

Artem K. Aksamentov

Federal Research and Clinical Center of Specialized Medical Care and Medical Technologies FMBA of Russia

Author for correspondence.
Email: temaaxe@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-7980-2537
SPIN-code: 7861-6556

MD

Russian Federation, 28 Orekhovy boulevard, Moscow, 115682

Nadezhda V. Melnikova

Federal Research and Clinical Center of Specialized Medical Care and Medical Technologies FMBA of Russia; Russian Scientific Center of Roentgenoradiology

Email: n_melnikova@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-1193-352X
SPIN-code: 5050-8605

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, 28 Orekhovy boulevard, Moscow, 115682; Moscow

Nadezhda A. Kolyshkina

Federal Research and Clinical Center of Specialized Medical Care and Medical Technologies FMBA of Russia

Email: baklab_83@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4486-5412

MD

Russian Federation, 28 Orekhovy boulevard, Moscow, 115682

Olga N. Kucherova

City Clinical Hospital named after V.V. Vinogradov of the Department of Health of the city of Moscow

Email: ola-kucherova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3773-9629

Cand. Sci. (Med)

Russian Federation, Moscow

Vladimir P. Baklaushev

Federal Research and Clinical Center of Specialized Medical Care and Medical Technologies FMBA of Russia

Email: baklaushev.vp@fnkc-fmba.ru
ORCID iD: 0000-0003-1039-4245
SPIN-code: 3968-2971

Dr. Sci. (Med.)

Russian Federation, 28 Orekhovy boulevard, Moscow, 115682

References

Supplementary files