EXPRESSION OF OCT-4, P53, P16 AND KI-67, WITH HPV ASSOCIATED PRECANCER AND CANCER OF THE CERVIX

Cover Page

Abstract


The pathology of cervical HPV infection is detected by three types of epithelial-mesenchymal spheroidal structures: reparative, neoplastic and cancerous involved in reparation processes and in tumor growth. Cancer spheroids are different from neoplastic not only larger in size but also a tendency to merge, and high expression of p53. Expression of tumor markers p53, p16 and Ki-67 could be used in the early differential diagnosis of precancer and squamous cell carcinoma of the cervix.

Введение Рак шейки матки (РШМ) является наибо- лее распространенной формой онкологической патологии репродуктивной системы женщин, занимающей 7-е место среди всех злокачествен- ных опухолей и 3-е место среди карцином [1]. Вирус папилломы человека (ВПЧ) в настоящее время признается в качестве этиологического фактора этого новообразования и обнаружива- ется в 98% случаев РШМ [2]. Согласно современной концепции канцеро- генеза полагают, что опухоль обычно возникает в зонах активных регенераторных процессов, в области ниш стволовых клеток (НСК) из транс- формированных тканевых стволовых клеток или путем перепрограммирования трансфор- мированных клеток очагов предраковых изме- нений [3, 4, 5]. В шейке матки НСК соответ- ствует зоне трансформации [6]. Остается откры- тым вопрос о роли стволовой тканевой и стволо- вой раковой клетки в канцерогенезе рака шейки матки. Полагают, что мутантный ген-супрессор рака p53 играет важную роль в развитии плоскокле- точного рака шейки матки и может использо- ваться для его диагностики [7, 8].Кроме того, онкобелок E6 ВПЧ связывается с диким типом p53 и инактивирует его [9]. В результате чего, клетки с поврежденным геномом не отправля- ются в апоптоз, сохраняются, дают потомство, что ведет к накоплению мутаций в клетках и их злокачественной трансформации [10, 11]. Ранее нами были описаны сфероид- ные эпителиально-мезенхимальные струк- туры (СЭМС), обнаруживаемые в пласте пло- ского эпителия по экспрессии маркера эмбри- ональных стволовых клеток Oct-4 при ВПЧ- ассоциированной патологии шейки матки, включая предрак и плоскоклеточный рак [12]. Как было установлено, СЭМС формируются в зоне НСК, при этом их клетки обладают про- лиферативной активностью. Часть сферо- идов не имеют признаков клеточного ати- пизма, экспрессируют только Ki-67, не содер- жат р16 и были названы нами репаратив- ными сфероидами [12], в то время как дру- гие построены из атипичных клеток и экспрес- сируют и Ki-67 и p16, за что получили назва- ние опухолевых сфероидов [12]. Данные об экс- прессии р53 в СЭМС в доступной литературе отсутствуют. Целью исследования явилось изучение экспрессии p53, Oct-4, p16 и Ki-67, в репара- тивных и опухолевых сфероидах при ВПЧ- ассоциированной патологии шейки матки: хро- нический цервицит, цервикальная интраэпи- телиальная неоплазия < II степень (ЦИН<II), цервикальная интраэпителиальная неоплазия ≥ II степень (ЦИН≥II), а также при микроинва- зивной плоскоклеточной карциноме. Материалы и методы исследования Проведено клинико-морфологическое и им- муногистохимическое исследование биопсий- ного материала, полученного от 61 пациентки репродуктивного возраста, проходивших обсле- дование и лечение в ФГБУ «Научный центр аку- шерства, гинекологии и перинатологии им. ака- демика В.И. Кулакова» Минздрава РФ за 2013- 2015 год. Обследованные женщины были в воз- расте от 17 до 56 лет (средний возраст 36,5 лет). Всем женщинам проводили ВПЧ-тестирование цервикального содержимого, полученного при заборе цитологического материала, на приборе Cobas 4800 методом ПЦР-НВ, представляющем собой полностью автоматизированную систему, выдающую результат по трем отдельным кана- лам: индивидуально ДНК ВПЧ16, ДНК ВПЧ18 и общий пул ДНК других 12 высокоонкогенных генотипов ВПЧ (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68) [13, 14]. Во всех образцах получили положительные результаты, причем ДНК ВПЧ 16 типа обнаружена в 19 случаях (31,15%), ДНК ВПЧ 18 типа в 4 случаях (6,55%), ДНК ВПЧ других 12 высокоонкогенных типов в 38 слу- чаях (62,30%). Все женщины были разделены на 4 группы в зависимости от патологического процесса в шейке матки: хронический цервицит (15), ЦИН<II (12), ЦИН≥II (25), микроинвазивный рак шейки матки (9). Биопсийный мате- риал был представлен соскобами цервикального канала, биоптатами шейки матки в случаях хро- нического цервицита и ЦИН<II, а также опера- ционным материалом (резецированные конусы шейки матки) при ЦИН≥II и микроинвазив- ном раке. Ткань фиксировали в 10% нейтраль- ном формалине, заливали в парафин и готовили серийные парафиновые срезы, которые окраши- вали гематоксилином и эозином и инкубиро- вали в ретривере для восстановления антиген- ности тканей. Ставили иммуногистохимические реакции с использованием моноклонных анти- тел к Oct-4 (MRQ-10, 309M-15,CELL MARQUE CORPORATION), p53 (RTU, клон DO-7 RTU, N158187-2, DAKO), и антител для двойной окра- ски p16/Ki67 (CINtec PLUS cytology kit, Рош). Докрашивание ядер осуществлялось гематокси- лином и эозином. Ставились положительные и отрицательные контрольные реакции. Резуль- таты реакций оценили в процентах окрашенных эпителиальных клеток из расчета на 300 клеток. Для статистического анализа применялся непа- раметрический метод для малых выборок по Манну-Уитни. Результаты и их обсуждение При гистологическом исследовании биоп- татов шейки матки морфологический диагноз хронического ВПЧ-ассоциированного церви- цита ставился при обнаружении лимфогисти- оцитарной инфильтрации подслизистого слоя, лейкопедеза в эпителиальном пласте, явлении акантоза, очаговой плоскоклеточной метапла- зии и койлоцитоза. При ЦИН < II и ЦИН ≥ II, также выявля- лись признаки хронического воспаления с кой- лоцитозом в сочетании с появлением атипич- ных клеток, распространяющихся не более чем на 1/3 толщины плоского эпителия при ЦИН < II и более 2/3 толщины эпителия при ЦИН ≥ II. Микроинвазивный плоскоклеточный рак отли- чался наличием разрушения базальной мем- браны с микроинвазией раковых клеток в под- слизистый слой на глубину менее 3 мм. СЭМС идентифицированы при исполь- зовании имуногистохимической реакции на Oct-4, который экспрессируется во всех клет- ках сфероидов. В среднем данный маркер опре- деляется в эпителии шейки матки при хрони- ческом цервиците в 13.5% клеток, при ЦИН < II в 33.5% клетках, при ЦИН ≥ II в 43.75% клеток и при микроинвазивном раке в 48.5% клеток. При гистологическом исследовании выяв- ляли 3 типа СЭМС: 1тип небольших разме- ров, построенные из крупных эпителиальных клеток типа базальных, в центре, как правило, можно быть увидеть кровеносный сосуд; 2 тип более крупных размеров, построенные из кле- ток с признаком атипизма, часто не имеющие сосудов; 3 тип крупные и сливающиеся между собой, образованные резко атипичными рако- выми клетками. При хроническом цервиците обнаруживались СЭМС 1 типа, при ЦИН < II - преобладали СЭМС 1 типа в сочетании с СЭМС 2 типа, при ЦИН ≥ II - СЭМС 2 типа, а при микроинвазивной карциноме - СЭМС 3 типа (в окружающей ткани с морфологией ЦИН<II и ЦИН≥II обнаруживались также СЭМС 2 типа). При двойной окраске p16/Ki67 СЭМС 1 типа содержали клетки, экспрессирующие только Ki67, что наблюдалось при хроническом церви- ците. В СЭМС 2 типа клетки экспрессировали одновременно оба маркера. При этом одновре- менная экспрессия p16/Ki67 определялась в 7.5% клеток СЭМС при ЦИН<II, и в 72,5 % кле- ток СЭМС при ЦИН≥II, а при микроинвазивной карциноме в 55% (Рис.1). p53 не обнаруживался в СЭМС 1 типа (Рис. 2 А, Б), выявлялся в 10% клеток СЭМС 2 типа (Рис. 2С) и в 70% клеток СЭМС 3 типа (Рис. 2Д.). В целом в эпителиальном пласте маркер не определялся при хроническом цервиците и при ЦИН<II, при ЦИН≥II в 7.5% клеток, а при микроинвазивном раке в 52.5% всего эпители- ального пласта. Таким образом, на основании всех получен- ных данных и данных литературы [8, 12], было установлено, что процесс канцерогенеза в шейке матки связан с формированием СЭМС, кото- рые могут быть разделены на 3 типа в соответ- ствии с иммунофенотипом, участием в репара- тивных СЭМС процессах и опухолевом росте: репаративные, не экспрессирующие р16 и р53, неопластические, экспрессирующие р16 и р53 в единичных клетках, и раковые СЭМС с высокой экспрессией клетками р16 и р53. В результате проведенного исследова- ния установлено, что высокая экспрессия р53 (70,0%) позволяет проводить дифференциаль- ный диагноз между ЦИН≥II и микроинвазив- ным раком шейки матки, что совпадает с дан- ными других авторов. Согласно работам Wang [8], Alan Storey [15], при злокачественной трансформации, экспрессия белка p53 увели- чивается. Нами получены новые данные о том, что р53 положительные клетки сосредоточены в основном в СЭМС 2 типа (10%) и в большей степени в СЭМС 3 типа (70%), относящихся к раковым СЭМС. Последнее может быть косвен- ным подтверждением развития злокачественной трансформации в клетках с признаками стволо- вости, экспрессирующих Oct-4, р16 и Ki-67. Выводы При патологии шейки матки на фоне ВПЧ инфекции обнаруживаются репаративные, нео- пластические и раковые СЭМС, участвующие в репаративных процессах и в опухолевом росте. Репаративные СЭМС встречаются при хроническом цервиците и ЦИН<II, имеют мор- Рис. 1. Экспрессия разных маркров в сфероиде на фоне ВПЧассоциированной патологии шейки матки. Рис. 2. Экспрессия p53 в СЭМС A B при ВПЧассоциированной патологии шейки матки, иммунопероксидазная реакция, Х600. Отсутствие экспрессии p53 в клетках репаративных СЭМС при хроническом ВПЧассоциированном цервиците. Отсутствие экспрессии p53 в клетках репаративных СЭМС при ЦИН < II. C D C. Экспрессия p53 в единичных клетках неопластических СЭМС при ЦИН  II. D. Экспрессия p53 в клетках раковых СЭМС при ВПЧассоциированной микроинвазивной карциноме шейки матки. фологические особенности: небольшие размеры, всегда формируются вокруг сосудов, построены из клеток типа базальных кератиноцитов, кле- точный атипизм отсутствует, в клетках сферо- идов имеется экспрессия Ki-67 при отсутствии экспрессии p16, отсутствует экспрессия p53. Неопластические СЭМС встречаются при ЦИН < II, ЦИН ≥ II и в окружающей ткани при плоскоклеточном раке шейки матки, имеют большие размеры, формируются вне зависи- мости от сосудов, построены из эпителиальных клеток с признаками атипии или из рако- вых клеток, отличаются высокой экспрессией Ki-67,p16, а также содержат p53. Целесообразно выделять также и раковые СЭМС, отличающиеся от неопластических не только более крупными размерами, но и тенден- цией к слиянию, а также высокой экспрессией p53. Экспрессия онкомаркеров p53, p16 и Ki67 может быть использована в ранней дифферен- циальной диагностике предрака и плоскокле- точного рака шейки матки.

E A Kogan

Li Ts Ts

N M Faizullina

A V Kazachenko

  1. Новик В.И. Скрининг рака шейки матки. Практическая онкология, 2010, 11(2): 66-73.
  2. Jacobs MV, Snijders PJ, Voorhorst F J, et al. Reliable high risk HPV DNA testing by polymerase chain reaction: an intermethod and intramethod comparison. Journal of clinical pathology, 1999, 52(7): 498-503.
  3. Beachy PA, Karhadkar SS, Berman DM. Tissue repair and stem cell renewal in carcinogenesis. Nature, 2004, 432(7015): 324-31.
  4. Reya T, Morrison S J, Clarke MF, et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature, 2001, 414(6859): 105-111.
  5. Schlessinger D, Van Zant G. Does functional depletion of stem cells drive aging?. Mechanisms of ageing and development, 2001, 122(14): 1537-53.
  6. Crum CP. Contemporary theories of cervical carcinogenesis: the virus, the host, and the stem cell. Modern Pathology, 2000, 13(3): 243-51.
  7. Regezi J A, Zarbo R J, Regev E, et al. p53 protein expression in sequential biopsies of oral dysplasias and in situ carcinomas. Journal of oral pathology & medicine, 1995, 24(1): 18-22.
  8. Wang N, Yao Q, Li X, et al. Detection of HPV and p53 gene expressions in cervical cancer tissue[J]. Medical Journal of Qilu, 2004, 20(2): 98-100,102.
  9. Scheffner M, Huibregtse JM, Vierstra RD, et al. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell, 1993, 75(3): 495-505.
  10. Liu Y, He Y, Jin A, et al. Ribosomal protein- Mdm2-p53 pathway coordinates nutrient stress with lipid metabolism by regulating MCD and promoting fatty acid oxidation. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 111(23): E2414-E2422.
  11. Vousden KH, Ryan KM. p53 and metabolism. Nature Reviews Cancer, 2009, 9(10): 691-700.
  12. E.A. Kogan, PhD, ScD; N.M. Fayzullina, PhD; T.A. Demura, PhD; G.T. Sukhikh, PhD, ScD. Reparative Spheroids in HPV-Associated Chronic Cervicitis. Science Center of obstetrics, gynecology and perinatology n.a. acad. V.I. Kulakov Moscow, RF. International Journal of BioMedicine 2013; 3(3): 192-6.
  13. Castle P.E., Sadorra M., Lau T., et al. Evaluation of a prototype real-time PCR assay for carcinogenic human papilloma virus (HPV) detection and simultaneous HPV genotype 16 (HPV16) and HPV18 genotyping // J Clin Microbiol 2009; 47: 3344-47.
  14. Коган Е.А., Файзуллина Н.М., Ли Ц. и др. Эффективность диагностики цервикальной интраэпителиальной неоплазии шейки матки с использованием комплекса методов: жидкостной цитологии, двойного иммуноокрашивания p16/Ki67 и ВПЧ тестирования // Акушерство и гинекология. 2014. №7. С. 43-47.
  15. Storey A, Thomas M, Kalita A, et al. Role of a p53 polymorphism in the development of human papilloma-virus-associated cancer. Nature 1998; 393(6682): 229-34.

Views

Abstract - 163

PDF (Russian) - 377

PlumX


Copyright (c) 2016 Kogan E.A., Ts L.T., Faizullina N.M., Kazachenko A.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.