EFFECT OF ANTICANCER DRUGS ON PRIMARY CELL CULTURES OF PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER

Cover Page

Abstract


The goal of the research is to estimate the effect of 5-Fluorouracil, Cisplatin, Tomudex, Leucovorin and their combinations on colorectal cancer cells in vitro. Cell response to the effect of cytotoxic compounds and immunomodulator was estimated by the change in chromosomal aberrations, cell growth rate, proliferative activity and colonyforming unit. It was detected that antineoplastic drugs affected the mutagenesis and fission rate of cultured cells.

Введение Ежегодно в мире регистрируют примерно 600 000 новых случаев колоректального рака (КРР), около 300 000 человек умирают от этого заболевания [5]. В связи с тем, что большин- ство больных (до 70-80%) поступают в стаци- онар на поздних стадиях развития заболевания, актуальным представляется совершенствование способов диагностики и схем лечения КРР [1, 2]. Расширение сферы применения методов моле- кулярной биологии в онкологии стимулирует трансформацию дескриптивного этапа развития этого раздела медицины, констатирующего био- логические и клинические феномены, в анали- тический этап углубленного изучения явлений с целью объяснения механизмов их возникнове- ния. В свою очередь, расшифровка механизмов регуляции пролиферации опухолевых клеток, процессов метастазирования и ангиогенеза, осо- бенностей репликации ДНК, развития и угнете- ния апоптоза - эти научные достижения послед- них десятилетий вносят существенный вклад в понимание генетических процессов клетки [4, 6]. Результаты патогенетических исследова- ний стимулируют разработку новых подходов, в частности, генной и, так называемой, таргентной терапии неоплазий кишечника. Цель исследования Оценить in vitro влияние препаратов анти- канцерогенного действия на опухолевые клетки при колоректальном раке. Материалы и методы Проведено исследование трансформирован- ных и нетрансформированных клеток больных КРР. Биопсийный материал нормальной (на расстоянии 10 см от опухоли) и опухолевой эпи- телиальной ткани, отобранный во время опера- ции 10 больных КРР, использовали для получе- ния первичых неперевиваемых культур клеток. Получение первичных культур клеток. Образцы ткани подвергали механической и ферментатив- ной дезагрегации на шейкере при 100 об/мин в течение 20 мин при 370С в среде культивирова- ния МЕМ (Hyclone, Logan, UT) c добавлением 10% инактивированной эмбриональной сыво- ротки крупного рогатого скота (ЭС) и анти- биотиков (пенициллин 100 Ед, цефазолин 5 Ед, канамицин 5 Ед на 1 мл среды), 15 мкг/мл ДНК- азы I (Sigma, St. Louis, MO) [11]. Затем клетки центрифугировали 10 мин при 1 250 об/мин при 40С, помещали в 100 мм чашки для культивиро- вания и инкубировали в термостате при 370С с 5% атмосферой СО2. Состав среды культивиро- вания: 6,16 мл среды МЕМ; натрий фосфатный буфер 7,5%; 1,6 мл ЭС; 0,08 мл L-глютамина; 0,08 мл раствора антибиотиков. Метод колоние- образования. Агаризованную 0,6% МЕМ среду объемом 20 мл с 1×105 клеток помещали в 100 мм чашки для культивирования, которые инку- бировали в термостате при 370С в 5% атмос- фере СО2 в течение 7 дней. Колониеобразую- щая активность выражена в процентах по фор- муле: К/N×100%, где К - количество колоний на чашку, N - количество засеянных на чашку кле- ток [8]. Оценка резистентности клеток к химиопре- паратам. Суспензии первичных культур кле- ток в 90 мкл МЕМ среды помещали в 96-луноч- ные стерильные иммунологические планшеты в концентрации 1×103 клеток на лунку и добав- ляли лекарственные препараты. В контроль- ном варианте в инкубационную среду с клет- ками добавляли деионизированную дистилли- рованную воду в объеме 10 мкл., соответствую- щем объему раствора лекарственного препарата. Клетки в планшетах инкубировали 24, 48, 72, 96 час. Оптическую плотность клеток в МЕМ среде измеряли на UV-спектрофотометре Biospec-mini (Shimadzu, Япония) при длине волны 630нм. Скорость роста опухолевых клеток рассчиты- вали по формуле: R=exp(-t)≈ΔN/N, где N - ОП суспензии необработанных химическим соеди- нением опухолевых клеток, ΔN - ОП суспензии обработанных химическим соединением опухо- левых клеток [7]. Все эксперименты проведены в трех повторностях. Анализ хромосомных абер- раций в клетках первичных культур эпители- альных клеток выполняли стандартным мето- дом [3]. Клетки инкубировали в термостате при 370С в течение 48 час. Для блокирования митоза на стадии метафазы за 2 час до окончания инку- бации в культуры клеток добавляли 0,002 мкг/ мл колхицина (Sigma). Затем клетки помещали в 0,75 М раствор КCl, и после инкубации в тече- ние 15 мин фиксировали в растворе метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1). В каж- дом приготовленном и окрашенном по методу Гимза препарате анализировали 100 метафаз при помощи микроскопа Leica при увеличении ×1000. Подсчитывали количество клеток с рас- познаваемыми без кариотипирования хромо- сомными аберрациями. Митотический индекс рассчитывали по формуле: Р = М/К×100%, где М - количество делящихся клеток в популяции, К -общее количество клеток (не менее 1000) в популяции [3]. Эту же формулу использовали для вычисления количества анеуплоидных кле- ток. В работе использовали лекарственные пре- параты в конечных концентрациях мкг/мл: 18 - 5-фтор-дезоксиурацил (5-ФУ), 0,43 - циспла- тин (ЦП), 2 - томудекс (ТД) и 0,29 - лейково- рин (ЛВ). После обработки препаратами клетки инкубировали в течение 48 час при 370С. Выделение ДНК и РНК из клеток. К клет- кам, суспендированным в буфере LST (29 мМ трис-HCl рН 8.0, 10 мМ NaCl, 1мМ MgCl2, 0.25 М сахароза) добавляли равный объем буфера 4× TNLB (29 мМ трис-HCl рН 8.0, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 5% сахароза, 4% Np-40). Затем суспензию клеток центрифугировали при 5 000 об/мин в течение 10 мин. Осадок клеток дважды промывали буфером LST, затем ресуспендиро- вали в буфере TNE (10 мМ трис-HCl рН 8,0, 10 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА), 1% СДС (лаурил- сульфат натрия) с протеиназой К в конечной концентрации 100 мкг/мл. Выделение РНК из клеток проводили с помощью набора TRIzol (Life Technologies, Inc.) согласно прилагаемой инструкции. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ПЦР-RT). Метод ПЦР с обратной транскрипцией использовали для получения продуктов, которые анализи- ровали в 1% агарозном геле с добавлением 0,5 мкг/мл бромистого этидия (EtBr).Температуру отжига праймеров (табл. 1) с мишенью рассчи- тывали по формуле: 40С (G+C)+20С×(A+T)-4. Реакцию проводили в 30 мкл инкубацион- ной смеси следующего состава: 2 мкг РНК, 1 μl M-MulV (обратная транскриптаза, СибЭнзим), 300 нM (5,0 пмоль) прямого и обратного прай- мера, 0,1 μM (2,5 пмоль), 5,0 нM MgCl2, SYBR Green, 10 мM трис-HCl pH 8,0, 3,5 нМ TaqMan ДНК-полимеразы (Sigma), 200 μM каждого из четырех дезоксинуклеотид-трифосфатов и 50 мM KCl. Цикл начинался нагреванием смеси до 250C в течение 5 мин. Проводили 40 циклов при 950C в течение 15 сек, при 520C - 20 сек и при 720C - 25 сек. Реакцию заканчивали охлажде- нием инкубационной смеси до 40C. Электрофоретическое разделение ДНК в ага- розном геле. Разделение ДНК осуществляли в 0,8% агарозном геле в ТАЕ буфере (40 мM трис- HCl pH 8,5, 5,71% ледяной уксусной кислоты, 0,04 мМ ЭДТА) в присутствии EtBr. Электро- форез проводили при 10-15 В/см в течение 120 мин. Результаты протоколировали с помо- щью BioRad. Статистический анализ резуль- татов проводили с использованием методов описательной статистики, парного t-критерия Стьюдента и парного T-критерия Вилкоксона для двух попарно связанных выборок, непара- метрического U-теста Манна-Уитни (Mann- Whitney U Test), метода линейного корреляци- онного анализа Пирсона. Результаты представ- лены в виде средней арифметической и ее стан- дартной ошибки (М±m) с указанием стандарт- ного отклонения SD. Различия или показатели связи считались статистически значимыми при p<0,05. Расчеты выполнены при помощи ком- пьютерной программы Excel 2003. Результаты иccледования Биопсийный материал отобран по 10 морфо- типам аденокарцином (низкодифференциро- ванная, НД - 3, умеренно-дифференцированная, УД - 6, высоко-дифференцированная, ВД - 1), которым в дальнейшем проводилось 5 курсов химиотерапии в режиме Мейо (5-фторурацил -425 мг/м2 и лейковорин 20 мг/м2 в течение 5 дней, каждые 4-5 недель). Из биопсийного мате- риала получены первичные культуры клеток, в которых определяли уровень мутагенеза, про- лиферативной активности и резистентности к противоопухолевым препаратам. Установлено, что в первичных культурах клеток аденокар- цином по сравнению с культурами нормальных эпителиальных клеток больше количество ане- уплоидных клеток (соответственно от 2,8±0,2% до 15,2±0,2%, SD 0,36 и 1,87, и 1,6±0,04%,SD 0,7, p<0,05), клеток с хромосомными аберраци- ями (соответственно от 5.7±0.9 до 15,1±3,7%, SD 2,4 и 9,8, и 0,2±0,002%, SD 0,007, p<0,05). Статистически не значимы уровни митотического индекса в культурах клеток, полученных из био- птатов аденокарцином и нормальных эпители- альных тканей (соответственно от 25,5±2,0% до 41,7±7,3, SD 4,5 и 17,9 и 22,3±0,3%, SD 0,6,p>0,05). Отсутствует корреляционная зави- симость уровня клеток с хромосомными абер- рациями (2,1±0,01%) и уровня митотического индекса (5,2±0,02%, r=0,2, p>0,05) в первичных культурах клеток ВД аденокарцином, основ- ными характеристиками которых являются большое количество митозов и ядрышек в клет- ках. Корреляционная зависимость уровня кле- ток с хромосомными аберрациями (2,9±0,1%) и митотического индекса (36,6±0,2%, r=0,5, p<0,05) обнаружена в культурах клеток, полу- ченных из УД аденокарцином, в которых есть перстневидные и атипичные клетки, некрозы, ядерный полиморфизм. Максимальный коэф- фициент корреляции между уровнем клеток с хромосомными аберрациями (5,6±0,02%) и митотическим индексом (20,8±0,2%, r=0,9, p<0,05) характерен для культур клеток НД аде- нокарцином с инвазивным ростом, массивными некрозами, большим количеством митозов, ати- пичными клетками и ядерным полиморфизмом. Основными типами хромосомных аберраций в опухолевых клетках являются дицентрические хромосомы (0,57±0,03%), парные и непарные хроматидные делеции (0,71±0,01%), количество которых в нормальных эпителиальных клет- ках соответственно 0,01±0,001% и 0,02±0,004%. Концентрации исследуемых противоопухоле- вых препаратов, соответствующие их терапев- тическим дозам, максимально эффективно сни- жают количество анеуплоидных клеток, клеток с хромосомными аберрациями и митотический индекс в первичных культурах клеток, полу- ченных из ВД аденокарциномы (рис. 1 А-Г). Цисплатин, лейковорин и 5-фторурацил вызы- вают снижение количества анеуплоидных кле- ток в первичных культурах клеток, полученных из НД или УД аденокарцином (рис. 1 А, В, Г). Максимально эффективное влияние на геном- Рис. 1. Количество клеток с хромосомными аберрациями,полиплоидных и пролиферирующих клеток в культурах клеток,полученных из аденокарцином и обработанных противоопухолевыми препаратами (%) низко(НД), умеренно(УД) и высокодифференцированных (ВД) * - р < 005 по отношению к монопрепарату Рис. 2. Влияние 5фторурацила (5ФУ), цисплатина (ЦП), томудекса (ТД), лейковорина (ЛВ) и комбинаций 5фторурацила (5ФУ+ЛВ), цисплатина (ЦП+ЛВ), томудекса (ТД+ЛВ) с лейковорином на колониеобразующую активность опухолевых клеток больных колоректальным раком. А: больные «1», «2» и «9» с низкодифференцированной аденокарциномой. Б: больные «3» , «4», «6», «10» с умереннодифференцированной,«8» - с высокодифференцированной аденокарциномами. а - р < 0.05 по отношению к деионизированной воде субкультур клеток больных «1» и «6»; б - р < 0.05 по отношению к деионизированной воде субкультур клеток больных «2» и «8»; в - р < 0.05 по отношению к деионизированной воде субкультур клеток больных «9» и «4». Рис. 3. Влияние лекарственных препаратов и их комбинаций на динамику роста культур клеток, полученных из аденокарцином А,Г низкодифференцированных, Б,Д - умереннодифференцированных, В,Ж - высокодифференцированных. Рис. 4. Мутация в генах hMSH6 и hMSH2 больных колоректальным раком. Экспрессия генов А - hMSH3 в опухолевых клетках, мутантных по гену hMSH6 - пациенты «4» и «6» с УД и «10» пациент с ВД аденокарциномами; Б - hMSH6 в опухолевых клетках, мутантных по гену hMSH2 - «2», «5», «7» и «9» пациенты с УД аденокарциномами. ную стабильность и деление клеток всех под- групп первичных культур клеток аденокарци- ном показала комбинация 5-фторурацила с лей- коворином (рис. 1 Ж). Необходимо отметить, что цисплатин, 5-фторурацил и их комбинации с лейковорином вызвали повышение в 1,4-1,8 раза количества клеток с хромосомными абер- рациями в культурах клеток, полученных из УД аденокарцином. Первичные культуры опу- холевых клеток отличаются по уровню коло- ниеобразующей активности. Обработка 5-ФУ, ЛВ и 5-ФУ+ЛВ ингибирует колониеобразую- щую активность опухолевых клеток НД адено- карцином больных «2» и «9» (рис. 2А), а также УД аденокарциномы больного «4» (рис. 2 Б). Цисплатин стимулирует образование колоний в культурах клеток НД аденокарциномы больных «1» и «2», а также УД аденокарциномы боль- ных «3», «4» и «6». Инкубация в течение 7 дней клеток с томудексом и комбинацией этого цито- статика с лейковорином не влияет на колониео- бразующую активность клеток НД аденокарци- номы больного «1», УД аденокарцином больных «4», «5», «7» и «10». Динамика роста опухоле- вых клеток, обработанных препаратами in vitro, имеет индивидуальные особенности (рис. 3). Клетки первичных культур, полученные из НД аденокарцином, не чувствительны к цитотоксическому действию лекарственных препаратов. Исключением является высокая чувствитель- ность к томудексу клеток, полученных из УД и ВД аденокарцином. Максимально чувствитель- ными к цитотоксическому действию противоо- пухолевых препаратов являются клетки, полу- ченные из ВД аденокарцином. Экспериментально выявлено, что комбина- ции противоопухолевых препаратов эффектив- нее подавляют развитие опухолевых клеток. Гипермутагенез и снижение чувствительности клеток к цитостатическому действию противо- опухолевых препаратов являются признаками мутаторного фенотипа клеток, который возни- кает в результате мутаций в генах системы репа- рации ошибочно спаренных оснований и явля- ется одной из причин развития КРР [10]. В клет- ках, мутантных по гену hMSH6, - высокая экс- прессия белка Msh3, а в клетках, мутантных по гену hMSH2, не экспрессируются белки Msh3 и Msh6 [9]. Анализ продуктов ПЦР реакции сви- детельствует о присутствии мутаций в генах hMSH6 (два пациента с УД и один пациент с ВД аденокарциномами) и hMSH2 (четыре паци- ента с УД аденокарциномой) (рис. 4). В качестве контроля в анализе использованы праймеры к гену, продуктом которого является β-актин. Высокая пролиферативная активность, геном- ная нестабильность, низкая чувствительность к противоопухолевым препаратам опухоле- вых клеток являются показателями отсутствия аллелей дикого типа MSH2 и MSH6 в соматиче- ских клетках. Работы по созданию новых стра- тегий доклинических исследований резистент- ности опухолевых клеток направлены на созда- ние модели, которая позволит унифицировать химиотерапевтическое лечение и выбрать инди- видуальные схемы лечения пациентов [12, 13]. Модели доклинического скрининга цитостати- ков с использованием панели музейных переви- Праймеры Таблица 1 Ген F-праймер R-праймер β-актин 5’-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3’ 5’-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3’ MSH6 5’-GATGGCATTTTCACAAGGATGGG-3’ 5’-CTGGCGGATAATGGGTGACAAAC-3’ MSH2 5’-ACAAGGGGCTGGGTTAGCAAAAG-3’ 5’-AGTCACCATTCTCTTCCGCTTTCG-3’ PMS2 5’-TTCTCAGGTTATCGGAGCCAGCAC-3’ 5’-CTTCGTCCCAATTCACCTCAGTGG-3’ MLH1 5’-CAGGTTTCATTTCACAATGCACGC-3’ 5’-TTACCTTCAACATCCAGCAGTGGC-3’ MSH3 5’-GGCAACAGTTCGACTCCTTTCAAG-3’ 5’-TTGATACCCTCCCCGTTATCTCGC-3’ ваемых культур неопластических клеток позво- ляют разработать схему противоопухолевой терапии, но не дают возможность осуществлять индивидуальную прогностическую оценку раз- вития химиорезистентности опухолевых клеток [14]. На наш взгляд, необходим принципиально новый подход к выбору схем лечения больных. Экспозиция индивидуальных первичных куль- тур клеток с различными молекулярными меха- низмами действия противоопухолевых препа- ратов дает возможность оценить генетически детерминированную химиорезистентность кле- ток и апробировать комбинацию химиопрепара- тов, оптимально эффективную для подавления роста и развития опухоли.

N V Golyasnaya

Email: golasnaya@mail.ru

Yu V Ivanov

N S Zhizhin

Email: gigin2000@mail.ru

  1. Барсуков Ю.А., Кныш В.И. Современные возможности лечения колоректального рака. Современная онкология. 2014. Т. 8. № 2. С. 7-16.
  2. Имянитов Е.Н. Клинико-молекулярные аспекты колоректального рака: этиопатогенез, профилактика, индивидуализация лечения. Практическая онкология. 2015. № 6. С. 65-70.
  3. Клаус Дж. Лимфоциты. Методы. M. 2006.
  4. Cai G., Xu Y., Lu H. Clinicopathologic and molecular features of sporadic microsatelliteand chromosomal-stable colorectal cancers. Int J Colorectal Dis. 2016. V. 23. N 4. P. 365-373.
  5. Cheng K.C., Loeb L.A. Hereditary colorectal cancer. J Clin Oncol. 2014. V. 22. N 16. P. 3284-3292.
  6. Davies R.J., Miller R., Coleman N. Colorectal cancer screening: prospects for molecular stool analysis. Nat. Rev. Cancer. 2015. V. 5. P. 199-209.
  7. Deisboeck T.S., Berens M.E., Kansal A.R. Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumor spheroid model. Cell. Prolif. 2014. V. 34. N 1. Р. 115-134.
  8. DiPersio J.F., Brennan J.K.,Lichtman M.A. Human cell lines that elaboratecolony-stimulating activity for the marrow cells of man and other species. Exp. Hematol. 2013. V. 6. N 8. P. 661-672.
  9. Fishel R., Lescoe M., Rao M. The humanmutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer. Cell. 2013. V. 75. N 3. P. 1027-1038.
  10. Genschel J. Littman S., Drummond J.,Modrich P. Isolation of MutS beta from human cells and comparison of the mismatch repair specificities of MutS beta and MutS alpha.J. Biol. Chem. 2016. V. 273. N 31. P. 19895-19901.
  11. Giavazzi R., Campbell D., Jessup J. Metastatic behavior of tumor cells isolated from primary and metastatic human colorectal carcinomas implanted into different sites in nude mice. Cancer Res. 2015. V. 46. N 5. Р. 1928-1933.
  12. Lievre A., Laurent-Puig P. Molecular biology in clinical cancer research: the example of digestive cancers. Rev. Epidemiol. Sante Publique. 2015. V. 53. N 3. P. 267-282.
  13. Vogel I., Soeth E., Ruder C. Disseminated tumor cells in the blood and/or bone marrow of patients with colorectal carcinoma are an independent prognostic factor. Annual Oncol. 2014. V. 11. N 4. P. 43-183.
  14. Worthley D.L., Whitehall V.L., Spring K.J. Colorectal carcinogenesis: Road maps to cancer. World J. Gastroenterol. 2012. Vol. 3.N 28.P.3784-3791.

Views

Abstract - 107

PDF (Russian) - 78

PlumX


Copyright (c) 2016 Golyasnaya N.V., Ivanov Y.V., Zhizhin N.S.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.