EXPERIMENTAL AND THEORETICAL STUDY OF ANTIMICROBIAL PROPERTIES OF CATIONIC PHTHALOCYANINES

Full Text

Лаборатория молекулярного моделирования и биоинформатики, организованная в ФНКЦ ФМБА России в 2012 году, ведет научную деятельность по нескольким направлениям. Одним из приоритетных направлений деятельности является исследование антимикробных свойств катионных макроциклических соединений, включая фотосенсибилизирующие свойства, взаимодействие с микробными клетками-мишенями и компонентами их клеточных стенок, в том числе - исследование строения самих микробных клеточных стенок методами молекулярного моделирования. 1. Фотодинамическая инактивация бактерий, опосредованная катионными фталоцианинами Нарастание резистентности бактерий к уже имеющимся препаратам и дефицит структур, которые потенциально могли бы лечь в основу новых дезинфектантов и антибиотиков, поставили на повестку дня поиск альтернативных способов борьбы с патогенными микроорганизмами. Одной из возможных альтернатив является фотосенсибилизированная инактивация бактериальных и грибковых заражений, опосредованная активными форами кислорода (АФК). Одним из инновационных способов борьбы с возбудителями инфекций является метод фотодинамической инактивации, основанный на обработке участка зараженной поверхности красителем - фотосенсибилизатором (ФС), обладающим сродством к микробным клеткам. Суть метода состоит в том, что ФС при воздействии видимого или инфракрасного света с длинами волн, соответствующими спектру их поглощения, генерирует образование цитотоксических АФК, вызывающих окислительную деструкцию различных структур микробных клеток. В отличие от антибиотиков, каждый из которых специфически воздействует на определенную мишень в микробной клетке: клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, репликацию ДНК, транскрипцию или трансляцию белков, генерируемые ФС АФК вызывают окислительное повреждение компонентов как липидной, так и белковой природы, а также нуклеиновых кислот. Считается, что такой множественный окислительный характер повреждений клеточных компонентов препятствует развитию микробной резистентности, в связи с чем этот метод рассматривается как перспективный способ борьбы с возбудителями заболеваний, устойчивыми к действию традиционных препаратов. В результате интенсивных исследований, проводимых в мире в течение последних 20 лет (в среднем около 200 публикаций в год только по антибактериальной активности ФС) достигнуты значительные успехи. Однако, несмотря на очевидные достижения, создание новых структур ФС для фотодинамической инактивации микроорганизмов представляет актуальную задачу. Основными направлениями оптимизации структур и свойств ФС являются улучшение фотофизических параметров, и за счет этого - снижение доз действующего света, создание ФС с поглощением в дальней красной или, особенно, ближней инфракрасной области, достижение высокой селективности к микробным клеткам-мишеням по отношению к нормальным тканям организма. Условием эффективной фотодинамической инактивации (ФДИ) является тесная ассоциация ФС с биологической мишенью, что следует из малого (10-50 нм) диффузионного радиуса АФК в биологической среде. Введение в структуру молекул ФС катионных заместителей позволяет достичь высокой эффективности связывания молекул ФС по электростатическому механизму (рис. 1) с отрицательно заряженной поверхностью микробных клеток, а значит, и специфичности фотодинамического воздействия [1]. Применяемые в нашей работе инновационные катионные ФС из класса тетрапиррольных макроциклов (фталоцианины, хлорины и бактериохлорины) обладают высокой эффективностью и широким спектром антимикробной активности, в том числе - в отношении биопленок [2]. Внедрение фотосенсибилизаторов и технологий фотодинамической терапии и обеззараживания в медицинскую практику послужит повышению эффективности борьбы с микробной резистентностью. 2. Исследование электростатического взаимодействия катионных фталоцианинов с липополисахаридами - эндотоксинами грам-отрицательных бактерий По химическому строению эндотоксины относятся к липополисахаридам (ЛПС) и являются основным компонентом наружной мембраны, входящей в состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Так, одна клетка Escherichia coli содержит 2-3 млн молекул ЛПС. При разрушении бактериальных клеток ЛПС выделяются в окружающую среду, формируя в водной среде агрегатные формы. ЛПС сочетают в пределах одной макромолекулы гидрофильный и гидрофобный фрагменты. Гидрофильный фрагмент молекулы ЛПС несет отрицательный заряд, который обусловливает ее высокое сродство с катионными соединениями. Нами было обнаружено, что поликатионные металлофталоцианины эффективно связываются по электростатическому механизму не только с целыми бактериальными клетками, но и с ЛПС, высвободившимися из бактериальных клеток в окружающую среду. При этом происходит нейтрализация отрицательных зарядов на молекулах ЛПС положительными зарядами в молекулах металлофталоцианинов [3]. Отрицательно заряженные сахара преимущественно входят в коровую часть ЛПС, состав и размер которой у различных видов бактерий сильно варьирует. Нами исследовано влияние размера коровой части на связывание поликатионного фталоцианина с ЛПС. Эти эксперименты проводили с использованием ЛПС из мутантных штаммов без О-антигенной цепи - Re, Rd, Rc, Ra формы, характеризующихся последовательным увеличением коровой цепи. Показано, что наибольший эффект нейтрализации дзета потенциала наблюдается на мицеллах из Re-формы ЛПС, для которой характерно полное отсутствие О-антигенной цепи (рис. 2). 3. Исследование сорбционных свойств гетерогенных катионных фталоцианинов в отношении липополисахаридов - эндотоксинов грам-отрицательных бактерий Основными требованиями к инфузионным растворам является стерильность и апирогенность. Пирогенные реакции или лихорадочные состояния вызываются при попадании в кровяное русло вместе с трансфузионной средой пирогенов, важнейшими из которых являются эндотоксины грам-отрицательных бактерий. Предельно допустимое содержание бактериальных эндотоксинов в воде для инъекций, установленное Фармакопеями многих стран, в том числе РФ, составляет 0,25 единиц эндотоксина в мл (0,25 EU/мл). В питьевой воде, для сравнения, содержится более 2 EU/мл эндотоксинов. При приготовлении инфузионных растворов вода является основным источником эндотоксинов, поэтому разработка способов удаления эндотоксинов из воды является актуальной задачей биотехнологии и медицины. Использование больших объемов плазмазамещающих растворов создает условия для попадания в организм больного значительных количеств эндотоксинов, способных вызвать пирогенную реакцию. В этой связи возникает необходимость очистки солевых растворов, изотоничных плазме крови, от эндотоксинов. Для изучения эффективности связывания эндотоксинов, выделенных из клеточных стенок грам-отрицательных бактерий, использовали гетерогенные поликатионные металлофталоцианины, ковалентно пришитые (5 мкМ/г) к аминопропилированному силикагелю с размером пор 25 нм (рис. 3). Поскольку структурной единицей ЛПС, активирующей иммунную систему, является липид А, в качестве объекта для исследования эффективности сорбции использовали форму ЛПС без О-антигенной цепи с промежуточной длиной коровой части, Rc-форму. Для определения наличия эндотоксинов с помощью ЛАЛ-теста использовался набор реактивов Pyrosate®. В основе ЛАЛ-теста лежит способность лизата амебоцитов (форменных элементов гемолимфы) мечехвоста специфически реагировать с эндотоксинами грам-отрицательных бактерий, что приводит к образованию агрегатов, адгезии и дегрануляции амебоцитов. В результате этого взаимодействия происходит помутнение реакционной смеси, образование плотного геля, что является индикатором присутствия эндотоксина. Установлено, что после инкубации при 37°С в течение часа 200 мг диасорб-250-амин с привитым ZnPcChol7 (5 µM/г) с 2 мл вод-ного раствора эндотоксина, при исходной концентрации эндотоксина 2,5-25 ЕдЭ/мл, результат ЛАЛ-теста с заявленной производителем чувствительностью 0,25 ед эндотоксина/мл (ЕдЭ/мл), - отрицательный, то есть концентрация эндотоксина после инкубации с сорбентом менее 0,25 ЕдЭ/мл. При введении в растворы эндотоксина 140 мМ NaCl и 4 мМ CaCl2, концентраций, изотоничных плазме крови, результат ЛАЛ-теста также отрицательный. Таким образом, приведенные примеры показывают эффективную сорбцию эндотоксинов из водных растворов, в том числе, содержащих неорганические соли. В дальнейшем этот сорбент планируется испытать с целью создания колонок для специфической гемосорбции эндотоксинов, играющих ключевую роль в развитии сепсиса и септического шока. Содержание эндотоксина в крови пациентов с сепсисом может превышать базовый уровень в тысячи раз. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в лечении инфекционных заболеваний, сепсис остается одной из актуальных проблем современной медицины. 4. Компьютерные модели наружной мембраны грам-отрицательной бактерии и молекул фталоцианина ЛПС обладают крайне вариабельной химической структурой и состоят из трех основных частей: липид А, центральный олигосахарид и О-антиген. О-антиген - самая вариабельная, дистальная часть молекулы ЛПC, покрывающая поверхность грам-отрицательных бактерий и формирующая защитный барьер, препятствующий проникновению антимикробных агентов к гидрофобному бислою. О-антиген состоит из повторяющихся углеводных фрагментов, число которых может варьировать даже в пределах одного штамма бактерий и содержать от единиц до нескольких сотен таких фрагментов. Таким образом, О-антиген представляет собой гибкую, малоразветвленную полисахаридную цепочку с огромным числом степеней свободы. Из-за высокого разнообразия и большой молекулярной массы не существует достоверных экспериментальных данных, точно описывающих пространственную укладку О-антигенов на поверхности бактериальной клетки. Для описания пространственной структуры О-антигена была использована система из пар двугранных углов О-гликозидной связи (φ, ψ), рис. 4). В нашей работе мы проводим детальный анализ конформационной подвижности О-антигена с помощью методов молекулярно-динамического (МД) моделирования. Нами была разработана МД модель одиночной молекулы ЛПС на базе силового поля OPLS-AA [4], а также модель фрагмента клеточной мембраны грам-отрицательной бактерии, состоящая из 20 полных молекул ЛПС во внешнем монослое, 20 молекул ЛПС без О-антигена во внутреннем монослое и 8 интегральных белков. Построенные модели были использованы для продолжительных МД расчетов с использованием пакета программ GROMACS [5], по результатам которых был проведен анализ конформационной подвижности О-антигенной части молекул ЛПС. Было показано, что существуют два минимума потенциальной энергии, отвечающие конформациям с двумя положительными или двумя отрицательными углами (φ, ψ). Поскольку пара двугранных углов одного знака задает направление закручивания цепочки атомов в спираль, то конформация молекулы может представлять собой как правую, так и левую спираль (рис. 5). Существование как правых так и левых спиральных мотивов в структуре О-антигенной цепи сильно отличает структуру этого полисахарида от других биополимеров, таких как нуклеиновые кислоты и белки. Чередование право- и левозакрученных фрагментов приводит к более сложной и крайне нерегулярной пространственной структуре молекул ЛПС. Наружная мембрана грам-отрицательной бактерии представляет собой асимметричный бислой, имеющий сложную многокомпонентную структуру и защищающий бактерию от различных внешних воздействий. В нашей работе мы рассмотрели модель, представляющую собой ЛПС-ЛПС бислой, содержащий интегральные белки. Внутренний монослой содержал ЛПС без О-антигена, а внешний монослой - полноценные ЛПС молекулы. В процессе МД расчетов модельной мембраны мы проследили процесс термического разрушения изначальной спиральной структуры О-антигена. Было показано, что полная реорганизация О-антигенов в мембране происходит за счет изменения всего нескольких степеней свободы. Так, меняется конформация одного из углеводных остатков (маннозы), а также происходит поворот вокруг всего одной О-гликозидной связи. Этих изменений оказывается достаточно для полного разрушения стартовой структуры и образования ранее не наблюдавшегося ни в расчётах [6], ни экспериментально состояния. В финальной структуре цепочки О-антигенов сильно запутаны друг относительно друга и формируют водные полости над интегральными белками (рис. 6). Таким образом, О-антиген, содержащий примембранный слой, оказывается крайне неоднородным, напоминающим лабиринт. Этот гетерогенный слой должен существенно замедлять диффузию в околомембранном пространстве и может иметь адаптивное значение для бактерии. С целью проведения в последующем компьютерного моделирования связывания молекул ЛПС и Фц нами была построена компьютерная модель молекулы ZnPc8+. В силу особенностей синтеза образец ZnPc8+ представляет собой смесь изомеров с различным положением заместителей в макроциклическом ядре. Поэтому для построения модели нами были оценены наиболее вероятные позиции остатков холина в молекуле, для чего мы рассчитали вероятности последовательного электрофильного присоединения заряженных остатков к макроциклическому ядру при помощи функций Фукуи. На основе функций Фукуи, а также на основе стерических факторов, нами были предложены три варианта молекулы, которые могут быть представлены в смеси изомеров. Для каждой из этих молекул была построена топология, включающая оптимизацию геометрии молекулы в базисе сс-pVDZ в рамках теории функционала плотности с трехпараметрическим потенциалом B3LYP5 и расчет парциальных зарядов. Квантово-механические расчеты были выполнены с помощью программного пакета Firefly, расчет точечных зарядов на атомах был произведен на основе алгоритма RESP.Вычисления как одиночных молекул ЛПС в воде, и тем более агрегатов и частей мембран, и связывание с ними молекул фталоцианинов являются весьма ресурсоемкими и требуют высокопроизводительную вычислительную архитектуру для их проведения. Вычисления проводятся с использованием суперкомпьютеров «Ломоносов» и «Чебышев» суперкомпьютерного центра МГУ имени М.В. Ломоносова. Результаты исследования предположительно позволят осуществить выбор оптимальных структур фотосенсибилизаторов и сорбентов эндотоксинов. На основе нового сорбента, разработанного в данном исследовании, возможно будет создание оригинальной колонки для специфической сорбции эндотоксинов из инъекционных препаратов, плазмы и цельной крови.

About the authors

I B Kovalenko

Email: ikovakenko78@gmail.com

M G Strakhovskaya

S Yu Kovalenko

T V Galochkina

A V Averyanov

Email: averyanovav@mail.ru

D V Zlenko

Email: dvzlenko@gmail.com

A M Nesterenko

Email: comconadin@gmail.com

References

Supplementary files