LARGE UTERINE LEIOMYOMAS: PATHOGENETIC MECHANISMS OF GROWTH

Full Text

Особенности клинического течения миомы матки больших размеров определяются мно- гими факторами: размерами и локализацией опухоли (субсерозные, интрамуральные, суб- мукозные и их сочетания), особенностями гемодинамических нарушений в малом тазу, вариантом ее гистологического строения (про- стая, клеточная, пролиферирующая, липолей- омиома и т.д.), состоянием рецепторного аппа- рата миометрия и эндометрия, а также нали- чием сопутствующей гинекологической пато- логии [1-6]. В генезе миомы матки играют роль изменения иммунологической реактивности, а также состояние гипоталамо-гипофизарной системы, функции яичников, надпочечников, щитовидной железы. До настоящего времени существует традици- онное мнение о ведущей роли эстрогенов в пато- генезе миом. Уменьшение объемов миоматоз- ных узлов и значительное снижение содержа- ния рецепторов эстрогенов в миометрии и тка- нях миомы после длительного лечения агони- стами гонадолиберина подтверждают это мне- ние [2, 4]. В последнее время появилось сообще- ние о влиянии прогестероновых рецепторов на рост и развитие миомы матки. Ryzard et all (2001 г.) в своих исследованиях показали, что экспрес- сия прогестероновых рецепторов в клетках лей- омиомы значительно выше, чем в обычном мио- метрии и ниже, чем в эндометрии, a экспрессия прогестероновых рецепторов в клетках лейоми- омы матки значительно превышает экспрессию эстрогеновых рецепторов [7]. Прогестероновые рецепторы на высоком уровне экспрессируются в небольших лейомиомах матки, в то время как уровень экспрессии прогестероновых рецепто- ров снижается в лейомиоме матки больших раз- меров до уровней наблюдаемых в группах без лейомиомы матки. Экспрессия эстрогеновых рецепторов не зависит от возраста женщины и размера лейомиомы матки [8]. Рост миомы матки происходит с накопле- нием коллагена [9-12], фибронектина [13] и гли- козаминогликанов [14], которые служат резер- вуаром для биологически активных факторов роста и цитокинов [15]. Исходя из результатов иммунногистохи- мического исследования, в ряде работ сделано предположение, что факторы роста, продуци- руемые миомой матки, через пара- и аутокрин- ные механизмы могут способствовать росту миомы за счет гипертрофии и пролиферации миометрия, усилению неоангиогенеза и непра- вильному формированию сосудов с низкорези- стентным кровотоком, более выраженым в про- лиферирующих миомах [16-18]. В настоящее время в развитии лейомиом матки большое внимание уделяется факто- рам апоптоза, пролиферации и неоангиоге- неза, которые наиболее интенсивно происхо- дят в так называемых зонах роста опухолей [16, 17]. Зонами роста ЛММ обозначаются скопле- ния клеток гладкомышечного и перицитарного происхождения вокруг сосудов, формирующих муфтообразные структуры и располагающиеся на территории опухоли [16-18]. ЛММ является истинной опухолью, что подтверждено моно- клональностью ееклеток. Рост ЛММ зависит от продукции местных факторов, таких как: TGF- beta 1antibody - белка, являющегося одним из многочисленных факторов роста и играю- щего важную роль в ангиогенезе (содержится в -гранулах в тромбоцитах и синтезируется в мегакариоцитах). В литературе обсуждается также вопрос о возможных источниках роста ЛММ и из взаимосвязи с прогениторными клет- ками и опухолевыми стволовыми клетками, экс- прессирующими определенные маркеры и фак- торы роста, среди которых важное место занимают АСА протеин , Connexin 43, CD117, Nestin, Ki-67, PD-ECGF [17]. Цель исследования Целью исследования явилась оценка клинико-морфологических особенностей и патогенентических механизмов роста ЛММ больших размеров различных возрастных груп- пах на основании изучения экспрессии TGFb, CD117, PD-ECGF, Ki67, connexin и nestin в зонах роста опухолей. Материал и методы исследования В исследование включены 54 пациентки, кото- рым проводилась операционное лечение в отде- лении общей хирургии ФГБУ «Научный центр акушерства и гинекологии, перинатологии им. В.И. Кулакова» г. Москвы за период с 2012 по 2014 год. Всем пациентам проводили ультразву- ковое исследование органов малого таза с опреде- лением размеров и расположения узлов миомы. Проведено оперативное лечение в зависимости от возраста и тяжести заболевания (экстирпация матки с и без придатков, миомэктомия, выпол- ненные различными доступами) с последующей морфологической верификацией диагноза. Сред- ний возраст больных при исследовании коле- бался от 15 до 57 лет и составил 41,86 ± 8,1г. Все пациентки были разделены на две группы; основная - с ЛММБ (лейомиома матки больших размеров), больше 6 см в диаметре и группа сравнения с ЛМММ (лейомиома матки малых размеров), менее 4 см в диаметре. Каж- дая группа была разделена на две подгруппы по возрасту: женщины моложе 45 лет и женщины старше 45 лет (I а,б, II а,б). Морфологическое исследование включало изучение макропрепарата, а также гистологи- ческое и иммуногистохимическое исследования по общепринятым методикам. Материал фикси- ровался в 10% забуференном формалине, зали- вался в парафин. Серийные парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивались гематоксилином и эозином, а также использовались для имуно- гистохимических реакций. Имунногистохимически определяли экс- прессию Кi67 (MIB-1 моноклональные мыши- ные антитела RTU, в разведении 1:100 Dako), PD-ECGF (мышиные моноклональные анти- тела, клон P-GF.44C Termo Fisher Scientific Inc. в разведении 1:100, Abcam), TGFb (мыши- ные моноклональные антитела. клон TB21 в разведении 1:100, Abcam), Connexin 43 (кро- личьи поликлональные антитела, Abcam), Nestin (мышиные моноклональные антитела, A B прямой кишки) имелось у 6% больных и чаще наблюдались при межсвязочном, подбрюшин- ном, шеечном расположении узлов. Морфологическое исследование. В исследу- емом материале ЛММ локализовалась следую- щим образом: субсерозные - 67% (36 случаев); интрамуральные - 20% (11 случаев); субмукоз- Б Г ные - 11% (6 случаев) и их различное сочетание в 2% (1 случай). В нашем материале преобладали пациентки с гистологическим вариантом простой ЛММ, что составило 81% (44 случая) от общего числа исследованных пациенток, из них в основной группе - 49 % (26 случаев), в группе сравнения Рис. 1. Макропрепарат гигантской лейомиомы (а), варианты: простая (б), клеточная (в) с зонами роста (г). Окраска гематоксилином и эозином. Х400. clone Rat-401, Abcam), CD117 (кроличьи моно- клональные, клон YR145, Cell Marque). Дема- скировка антигенов проводилась в ретривере с цитратным буфером pН=6,0 при темпера- туре - 120С° в течение 20 минут. Результаты реакций были оценены полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике для всех антител [17] за исключением Ki-67. Оценка экспрессии Ki-67 проводилась с под- счетом индекса пролиферации (ИП) процента позитивных клеток на 3000 клеток одного типа. Статистичес-кая обработка получен- ных данных проведена с помощью электрон- ных таблиц Microsoft Excel и прикладных программ «Статистика» для Windows v.7.0. Для сравнения числовых данных использо- вали метод t-критерий Стьюдента. Попарное сравнение осуществляли с помощью критерия Манна-Уитни. Результаты собственных исследований и их обсуждение Клинические особенности ЛММ больших размеров проявлялись в жалобах пациенток. Наиболее частой жалобой пациенток являлась жалоба на нарушение менструальной функ- ции - маточные кровотечения в виде мено- и метроррагий, которые составляли 89% (48 слу- чаев), приведшие к анемизации у 12% женщин (7 случаев) и нарушению трудоспособности - у 8% (5 случаев ). Заболевание сопровожда- лось болевым синдромом у 57% пациенток (30 случаев). Как правило, боли локализовались в нижних отделах живота, пояснице. Нарушения функции смежных органов (мочевого пузыря, - 51% (28 случаев) (рис. 1, 2). Простая ЛММ макроскопически имела вид узла с четкими контурами, плотной консис- тенции, серого цвета, волокнистого строения. Нередко (в 40% случаев) отмечалось мелко- дольчатое строение внутри крупных ЛММ. При микроскопическом исследовании простая ЛММ больших размеров построена из пере- плетающихся пучков крупных гладкомышеч- ных клеток, фигуры митозов не определялись. В периферических отделах опухолевых узлов отмечались единичные «зоны роста» ЛММ (рис.1б) вокруг сосудов в виде муфт из лейо- миоцитов (рис.1г). Строма представлена сое- динительнотканными прослойками и сосудами капиллярного и синусоидного типа. На гра- нице с сохранной тканью располагалась псев- докапсула из лейомиоцитов и фибробластиче- ских элементов. В некоторых ЛММ отмечались очаги некрозов и кровоизлияний. Достоверных различий в размере очагов некрозов и кровоиз- лияний по группам не выявлено. Фигуры мито- зов отсутствовали, а ИП по Ki67 составлял 0,1 %. Однако, отмечалась тенденция к увеличе- нию объема некроза и кровоизлияния у жен- щин молодого возраста, как с малыми, так и с большими ЛММ, по сравнению с женщинами старшего возраста. Клеточная ЛММ встретилась у 13.5% жен- щин (7 случаев) из общего числа пациенток, из них в основной группе - в 8.1% (5 случаев), группе сравнения - в 5.4% (3 случая). Макро- скопически клеточная ЛММ больших размеров имела вид узла с четкими контурами, плотно- эластической и иногда мягковатой консистен- ции, серого цвета, и была окружена слабовы- раженной псевдокапсулой. При микроскопии, в отличие от простой ЛММ больших разме- ров, клеточная ЛММ имела более выраженный 81 13,5 2,7 2,7 тельная частота клеточных лейомиом была отно- сительно выше в группе ЛММ больших разме- ров, где чаще встречались очаги некроза и кро- воизлияний. В ЛММ больших размеров отмеча- ется повышенная васкуляризация и гипертро- фия мышечных волокон вокруг сосудов, а также большое количество зон роста по сравнению с ЛММ малых размеров из группы сравнения. Иммуногистохимическое исследование ИГХ исследование позволило установить молекулярно биологические особенности ЛММ больших размеров, связанные с характеристи- ками их зон роста. Рис. 2. Гистологические типы ЛММ больших размеров. паренхиматозный компонент, в то время как стромальный был выражен значительно меньше (рис.1в). Пучки опухолевых гладкомышечных клеток имели нечеткие контуры, однако ядра их были одинакового размера, митозы отсут- ствовали, а ИП по Ki67 составлял 4 %. Визуа- лизировались многочисленные «зоны роста» вокруг сосудов, где в основном и были сосре- доточены пролиферирующие Ki67 позитивные клетки. В клеточной ЛММ больших размеров намного чаще (82% наблюдений) отмечались очаги некрозов и кровоизлияний, по сравнению с ЛММ группы сравнения, а также с простой ЛММ. Эпителиоидная ЛММ больших размеров, в нашем материале была у 1 женщины основной группы, подгруппы б. Гистологическое строе- ние опухоли отличается от других типов ЛММ: большое количество сосудов, вокруг которых происходит формирование опухоли из гладко- мышечных клеток или, возможно, из перицитов. Митозы единичные, ИП по Кi67составил 6%. Липолейомиома - опухоль достаточно ред- кая, в нашем материале встретилась у 1 жен- щины основной группы, подгруппы а. Макро- скопически липолейомиома представлена узлом с четкими контурами, от окружающих тканей отделена псевдокапсулой. На разрезе узел серого цвета с желтоватым оттенком. Кон- систенция мягко-эластическая, ткань не имела волокнистого строения, а была более однород- ного вида. Резюмируя данные морфологического иссле- дования, следует подчеркнуть, что среди ЛММ больших размеров преобладают простые ЛММ, также, как и в группе сравнения, однако относи- Иммуногистохимическое исследование Кi67. При ИГХ исследовании экспрессиия Кi67, ЛММ с разными гистологическими типами, выявлялась ядерная окраска преимущественно вокруг сосудов (Табл.1). Таблица 1 Экспрессия Кi67 (ИП) в исследованных группах Группа ЛММ Прилежа- щий миометрий Зона роста лейомио- циты ЛММ (1а) 1,75% 1,38% 0,38% ЛММ (1б) 2,22% 0,00% 0,00% ЛММ (2а) 1,63% 0,63% 0,25% ЛММ (2б) 1,50% 0,13% 0,00% ИП у женщин с большими ЛММ старше 45 лет, составил в среднем 2,22 балла. У женщин с большими ЛММ, но моложе 45 лет ИП был немного ниже, и в среднем составил 1,75 бал- лов. При сравнении пациенток с малыми ЛММ старше 45 лет с основной группой, пациенток старше 45 лет, ИП вокруг сосудов и зон роста был достоверно выше в основной группе по сравнению с ЛММ группы сравнения. Иммуногистохимическое исследование TGF При ИГХ исследовании экспрессия белка TGF преобладала в зонах роста у женщин старше 45 лет. Отмечалась тенденция к увели- чению экспрессии данного белка в зонах роста ЛММ больших размеров, особенно с клеточным типом строения. Различия экспрессии TGF в зонах роста между группами были статисти- чески не достоверны. (Табл. 2, 3, рис. 3, 4). Иммуногистохимическое исследование CD 117. Экспрессия биомаркеров Таблица 3 При ИГХ исследовании экспрессия CD 117 (цитоплазматическое окрашивание) обнаружи- валась, как правило, в зонах роста, и реже в самой ткани опухоли, особенно у женщин моложе 45 лет. В лейомиоцитах экспрессия белка была примерно равной во всех исследованных груп- пах. (см. Табл. 2, 3, рис. 3, 4). Поскольку в ЛММ больших размеров зон роста было досто- верно больше, чем в группе сравнения, то и в целом CD 117 позитивных клеток в них было больше. Иммуногистохимическое исследование PD-ECGF. При ИГХ исследовании экспрессия PD-ECGF выявлялась в цитоплазме опухолевых клеток. Экспрессия маркера была выше при ЛММ боль- ших размеров по сравнению с группой сравнения (р <0,05). (см. Табл. 2, 3, рис. 3, 4). Иммуногистохимическое исследование Nestin и Connexin. В основной группе у женщин с ЛММ боль- ших размеров старше 45 лет экспрессия этих белков была максимальная, составила в сред- нем 6 баллов. В лейомиоцитах - 2 и 4 балла соответственно, а в прилежащем миометрии была практически нулевая. В целом обнару- жено достоверно более высокое содержание Nestin и Connexin в клетках ЛММ больших размеров по сравнению с ЛММ малых размеров (р <0,05). Нестин и коннексин показывают высокую экспрессию в зонах роста у женщин основной группы старше 45 лет, в опухолях, происхо- дит повышение экспресии и накопления белка нестина (р <0,05). Таблица 2 Экспрессия биомаркеров Маркер/груп- па ЛММ боль- ших размеров ЛММ малых размеров 1а 1б 2а 2б TGFb 0.90 0,78 0,9 0,78 CD117 0,15 0,17 0,11 0,33 PD-ECGF 1,33 2,75 0,25 1,33 Nestin 0,67 2 0,67 0 Connexin 0,67 2 0,67 0 в лейомиоцитах лейомиом матки в зонах роста лейомиом матки Маркер/груп- па зоны роста ЛММ малых размеров 1а 1б 2а 2б TGFb 1,16 1,44 0,9 0,78 CD117 0,33 0,31 0,11 0,33 PD-ECGF 2 4,33 0,25 1,33 Nestin 2 6 0,67 0 Connexin 2 6 0,67 0 Обсуждение ЛММ матки больших размеров имеют кли- нические, морфологические и иммуногисто- химические особенности, связанные с повы- шением пролиферативной активности клеток в зоне роста. Резюмируя данные морфологи- ческого исследования следует подчеркнуть, что частота клеточных лейомиом была отно- сительно выше в группе ЛММ больших разме- ров, где чаще встречались очаги некроза и кро- воизлияний. В ЛММ больших размеров отме- чается повышенная васкуляризация и гипер- трофия мышечных волокон вокруг сосудов, а также большое количество зон роста по срав- нению с ЛММ малых размеров из группы сравнения. Патогенетические механизмы роста ЛММ больших размеров связанные с активацией и увеличением количества зон роста. В зонах роста сосредоточены пролиферирующие клетки, име- ющие признаки стволовости и способные про- дуцировать разнообразные ростовые факторы. При ИГХ исследовании в нашей работе было установлено повышение экспрессии Кi-67, PD-ECGF, TGF, CD117, Nestin и Connexin. В зонах роста у женщин с ЛММ больших разме- ров по сравнению с ЛММ малых рзмеров, осо- бенно у женщин старше 45 лет, данные факторы были выше. Данные маркеры демонстрируют влияние на рост ЛММБ и участвуют в патоге- незе их развития. Рост ЛММБ у женщин стар- шего возраста происходит за счет усилении про- лиферации клеток в зоне роста, которая осу- ществляется за счет влияния факторов роста. В зонах роста ЛММБ у женщин старшего возраста отмечается одновременное повыше- ние экспресии нестина и коннексина, связанное, по-видимому, с усилением клеточного взаимо- действия и изменением цитоскелета гладкомышечных клеток, что, возможно, характерно для нарушения стромально-мезенхимального взаи- модействия. Повреждение зон роста и наруше- ние стромально-мезенхимального взаимодей- ствия приводит к усилению экспрессии белков межклеточной адгезии (коннексин) и поврежде- нию цитоскелета гладкомышечных клеток, что проявляется в усилении экспрессии нестина. Рост ЛММ больших размеров зависит от акти- вации пролиферативной активности и приоб- ретении признаков частичной стволовости кле- ток в зонах роста. Можно предположить, что длительное повреждающее действие факто- ров агрессии в зонах роста, которые фактически являются нишами стволовых клеток и опи- саны не только в ЛММ, но и в ткани миометрия, может приводить к развитию опухоли и ее про- грессирующему росту. Заключение Патогенетические механизмы роста ЛММ больших размеров связаны с активацией глад- комышечных и перицитарных клеток зон роста и увеличением их количества в опухоли. В зонах роста сосредотачиваются пролиферирующие клетки, имеющие признаки стволовости и спо- собные продуцировать разнообразные ростовые факторы.

About the authors

E A Kogan

Email: koganevg@gmail.com

S I Askolskaya

Yu V Popov

Email: yury.popoff@gmail.com

M A Solomakhina

Email: masolomahina@yandex.ru

N M Fayzullina

References

Supplementary files