EFFECT OF ANTICANCER DRUGS ON PRIMARY CELL CULTURES OF PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER

Full Text

Введение Ежегодно в мире регистрируют примерно 600 000 новых случаев колоректального рака (КРР), около 300 000 человек умирают от этого заболевания [5]. В связи с тем, что большин- ство больных (до 70-80%) поступают в стаци- онар на поздних стадиях развития заболевания, актуальным представляется совершенствование способов диагностики и схем лечения КРР [1, 2]. Расширение сферы применения методов моле- кулярной биологии в онкологии стимулирует трансформацию дескриптивного этапа развития этого раздела медицины, констатирующего био- логические и клинические феномены, в анали- тический этап углубленного изучения явлений с целью объяснения механизмов их возникнове- ния. В свою очередь, расшифровка механизмов регуляции пролиферации опухолевых клеток, процессов метастазирования и ангиогенеза, осо- бенностей репликации ДНК, развития и угнете- ния апоптоза - эти научные достижения послед- них десятилетий вносят существенный вклад в понимание генетических процессов клетки [4, 6]. Результаты патогенетических исследова- ний стимулируют разработку новых подходов, в частности, генной и, так называемой, таргентной терапии неоплазий кишечника. Цель исследования Оценить in vitro влияние препаратов анти- канцерогенного действия на опухолевые клетки при колоректальном раке. Материалы и методы Проведено исследование трансформирован- ных и нетрансформированных клеток больных КРР. Биопсийный материал нормальной (на расстоянии 10 см от опухоли) и опухолевой эпи- телиальной ткани, отобранный во время опера- ции 10 больных КРР, использовали для получе- ния первичых неперевиваемых культур клеток. Получение первичных культур клеток. Образцы ткани подвергали механической и ферментатив- ной дезагрегации на шейкере при 100 об/мин в течение 20 мин при 370С в среде культивирова- ния МЕМ (Hyclone, Logan, UT) c добавлением 10% инактивированной эмбриональной сыво- ротки крупного рогатого скота (ЭС) и анти- биотиков (пенициллин 100 Ед, цефазолин 5 Ед, канамицин 5 Ед на 1 мл среды), 15 мкг/мл ДНК- азы I (Sigma, St. Louis, MO) [11]. Затем клетки центрифугировали 10 мин при 1 250 об/мин при 40С, помещали в 100 мм чашки для культивиро- вания и инкубировали в термостате при 370С с 5% атмосферой СО2. Состав среды культивиро- вания: 6,16 мл среды МЕМ; натрий фосфатный буфер 7,5%; 1,6 мл ЭС; 0,08 мл L-глютамина; 0,08 мл раствора антибиотиков. Метод колоние- образования. Агаризованную 0,6% МЕМ среду объемом 20 мл с 1×105 клеток помещали в 100 мм чашки для культивирования, которые инку- бировали в термостате при 370С в 5% атмос- фере СО2 в течение 7 дней. Колониеобразую- щая активность выражена в процентах по фор- муле: К/N×100%, где К - количество колоний на чашку, N - количество засеянных на чашку кле- ток [8]. Оценка резистентности клеток к химиопре- паратам. Суспензии первичных культур кле- ток в 90 мкл МЕМ среды помещали в 96-луноч- ные стерильные иммунологические планшеты в концентрации 1×103 клеток на лунку и добав- ляли лекарственные препараты. В контроль- ном варианте в инкубационную среду с клет- ками добавляли деионизированную дистилли- рованную воду в объеме 10 мкл., соответствую- щем объему раствора лекарственного препарата. Клетки в планшетах инкубировали 24, 48, 72, 96 час. Оптическую плотность клеток в МЕМ среде измеряли на UV-спектрофотометре Biospec-mini (Shimadzu, Япония) при длине волны 630нм. Скорость роста опухолевых клеток рассчиты- вали по формуле: R=exp(-t)≈ΔN/N, где N - ОП суспензии необработанных химическим соеди- нением опухолевых клеток, ΔN - ОП суспензии обработанных химическим соединением опухо- левых клеток [7]. Все эксперименты проведены в трех повторностях. Анализ хромосомных абер- раций в клетках первичных культур эпители- альных клеток выполняли стандартным мето- дом [3]. Клетки инкубировали в термостате при 370С в течение 48 час. Для блокирования митоза на стадии метафазы за 2 час до окончания инку- бации в культуры клеток добавляли 0,002 мкг/ мл колхицина (Sigma). Затем клетки помещали в 0,75 М раствор КCl, и после инкубации в тече- ние 15 мин фиксировали в растворе метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1). В каж- дом приготовленном и окрашенном по методу Гимза препарате анализировали 100 метафаз при помощи микроскопа Leica при увеличении ×1000. Подсчитывали количество клеток с рас- познаваемыми без кариотипирования хромо- сомными аберрациями. Митотический индекс рассчитывали по формуле: Р = М/К×100%, где М - количество делящихся клеток в популяции, К -общее количество клеток (не менее 1000) в популяции [3]. Эту же формулу использовали для вычисления количества анеуплоидных кле- ток. В работе использовали лекарственные пре- параты в конечных концентрациях мкг/мл: 18 - 5-фтор-дезоксиурацил (5-ФУ), 0,43 - циспла- тин (ЦП), 2 - томудекс (ТД) и 0,29 - лейково- рин (ЛВ). После обработки препаратами клетки инкубировали в течение 48 час при 370С. Выделение ДНК и РНК из клеток. К клет- кам, суспендированным в буфере LST (29 мМ трис-HCl рН 8.0, 10 мМ NaCl, 1мМ MgCl2, 0.25 М сахароза) добавляли равный объем буфера 4× TNLB (29 мМ трис-HCl рН 8.0, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 5% сахароза, 4% Np-40). Затем суспензию клеток центрифугировали при 5 000 об/мин в течение 10 мин. Осадок клеток дважды промывали буфером LST, затем ресуспендиро- вали в буфере TNE (10 мМ трис-HCl рН 8,0, 10 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА), 1% СДС (лаурил- сульфат натрия) с протеиназой К в конечной концентрации 100 мкг/мл. Выделение РНК из клеток проводили с помощью набора TRIzol (Life Technologies, Inc.) согласно прилагаемой инструкции. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ПЦР-RT). Метод ПЦР с обратной транскрипцией использовали для получения продуктов, которые анализи- ровали в 1% агарозном геле с добавлением 0,5 мкг/мл бромистого этидия (EtBr).Температуру отжига праймеров (табл. 1) с мишенью рассчи- тывали по формуле: 40С (G+C)+20С×(A+T)-4. Реакцию проводили в 30 мкл инкубацион- ной смеси следующего состава: 2 мкг РНК, 1 μl M-MulV (обратная транскриптаза, СибЭнзим), 300 нM (5,0 пмоль) прямого и обратного прай- мера, 0,1 μM (2,5 пмоль), 5,0 нM MgCl2, SYBR Green, 10 мM трис-HCl pH 8,0, 3,5 нМ TaqMan ДНК-полимеразы (Sigma), 200 μM каждого из четырех дезоксинуклеотид-трифосфатов и 50 мM KCl. Цикл начинался нагреванием смеси до 250C в течение 5 мин. Проводили 40 циклов при 950C в течение 15 сек, при 520C - 20 сек и при 720C - 25 сек. Реакцию заканчивали охлажде- нием инкубационной смеси до 40C. Электрофоретическое разделение ДНК в ага- розном геле. Разделение ДНК осуществляли в 0,8% агарозном геле в ТАЕ буфере (40 мM трис- HCl pH 8,5, 5,71% ледяной уксусной кислоты, 0,04 мМ ЭДТА) в присутствии EtBr. Электро- форез проводили при 10-15 В/см в течение 120 мин. Результаты протоколировали с помо- щью BioRad. Статистический анализ резуль- татов проводили с использованием методов описательной статистики, парного t-критерия Стьюдента и парного T-критерия Вилкоксона для двух попарно связанных выборок, непара- метрического U-теста Манна-Уитни (Mann- Whitney U Test), метода линейного корреляци- онного анализа Пирсона. Результаты представ- лены в виде средней арифметической и ее стан- дартной ошибки (М±m) с указанием стандарт- ного отклонения SD. Различия или показатели связи считались статистически значимыми при p<0,05. Расчеты выполнены при помощи ком- пьютерной программы Excel 2003. Результаты иccледования Биопсийный материал отобран по 10 морфо- типам аденокарцином (низкодифференциро- ванная, НД - 3, умеренно-дифференцированная, УД - 6, высоко-дифференцированная, ВД - 1), которым в дальнейшем проводилось 5 курсов химиотерапии в режиме Мейо (5-фторурацил -425 мг/м2 и лейковорин 20 мг/м2 в течение 5 дней, каждые 4-5 недель). Из биопсийного мате- риала получены первичные культуры клеток, в которых определяли уровень мутагенеза, про- лиферативной активности и резистентности к противоопухолевым препаратам. Установлено, что в первичных культурах клеток аденокар- цином по сравнению с культурами нормальных эпителиальных клеток больше количество ане- уплоидных клеток (соответственно от 2,8±0,2% до 15,2±0,2%, SD 0,36 и 1,87, и 1,6±0,04%,SD 0,7, p<0,05), клеток с хромосомными аберраци- ями (соответственно от 5.7±0.9 до 15,1±3,7%, SD 2,4 и 9,8, и 0,2±0,002%, SD 0,007, p<0,05). Статистически не значимы уровни митотического индекса в культурах клеток, полученных из био- птатов аденокарцином и нормальных эпители- альных тканей (соответственно от 25,5±2,0% до 41,7±7,3, SD 4,5 и 17,9 и 22,3±0,3%, SD 0,6,p>0,05). Отсутствует корреляционная зави- симость уровня клеток с хромосомными абер- рациями (2,1±0,01%) и уровня митотического индекса (5,2±0,02%, r=0,2, p>0,05) в первичных культурах клеток ВД аденокарцином, основ- ными характеристиками которых являются большое количество митозов и ядрышек в клет- ках. Корреляционная зависимость уровня кле- ток с хромосомными аберрациями (2,9±0,1%) и митотического индекса (36,6±0,2%, r=0,5, p<0,05) обнаружена в культурах клеток, полу- ченных из УД аденокарцином, в которых есть перстневидные и атипичные клетки, некрозы, ядерный полиморфизм. Максимальный коэф- фициент корреляции между уровнем клеток с хромосомными аберрациями (5,6±0,02%) и митотическим индексом (20,8±0,2%, r=0,9, p<0,05) характерен для культур клеток НД аде- нокарцином с инвазивным ростом, массивными некрозами, большим количеством митозов, ати- пичными клетками и ядерным полиморфизмом. Основными типами хромосомных аберраций в опухолевых клетках являются дицентрические хромосомы (0,57±0,03%), парные и непарные хроматидные делеции (0,71±0,01%), количество которых в нормальных эпителиальных клет- ках соответственно 0,01±0,001% и 0,02±0,004%. Концентрации исследуемых противоопухоле- вых препаратов, соответствующие их терапев- тическим дозам, максимально эффективно сни- жают количество анеуплоидных клеток, клеток с хромосомными аберрациями и митотический индекс в первичных культурах клеток, полу- ченных из ВД аденокарциномы (рис. 1 А-Г). Цисплатин, лейковорин и 5-фторурацил вызы- вают снижение количества анеуплоидных кле- ток в первичных культурах клеток, полученных из НД или УД аденокарцином (рис. 1 А, В, Г). Максимально эффективное влияние на геном- Рис. 1. Количество клеток с хромосомными аберрациями,полиплоидных и пролиферирующих клеток в культурах клеток,полученных из аденокарцином и обработанных противоопухолевыми препаратами (%) низко(НД), умеренно(УД) и высокодифференцированных (ВД) * - р < 005 по отношению к монопрепарату Рис. 2. Влияние 5фторурацила (5ФУ), цисплатина (ЦП), томудекса (ТД), лейковорина (ЛВ) и комбинаций 5фторурацила (5ФУ+ЛВ), цисплатина (ЦП+ЛВ), томудекса (ТД+ЛВ) с лейковорином на колониеобразующую активность опухолевых клеток больных колоректальным раком. А: больные «1», «2» и «9» с низкодифференцированной аденокарциномой. Б: больные «3» , «4», «6», «10» с умереннодифференцированной,«8» - с высокодифференцированной аденокарциномами. а - р < 0.05 по отношению к деионизированной воде субкультур клеток больных «1» и «6»; б - р < 0.05 по отношению к деионизированной воде субкультур клеток больных «2» и «8»; в - р < 0.05 по отношению к деионизированной воде субкультур клеток больных «9» и «4». Рис. 3. Влияние лекарственных препаратов и их комбинаций на динамику роста культур клеток, полученных из аденокарцином А,Г низкодифференцированных, Б,Д - умереннодифференцированных, В,Ж - высокодифференцированных. Рис. 4. Мутация в генах hMSH6 и hMSH2 больных колоректальным раком. Экспрессия генов А - hMSH3 в опухолевых клетках, мутантных по гену hMSH6 - пациенты «4» и «6» с УД и «10» пациент с ВД аденокарциномами; Б - hMSH6 в опухолевых клетках, мутантных по гену hMSH2 - «2», «5», «7» и «9» пациенты с УД аденокарциномами. ную стабильность и деление клеток всех под- групп первичных культур клеток аденокарци- ном показала комбинация 5-фторурацила с лей- коворином (рис. 1 Ж). Необходимо отметить, что цисплатин, 5-фторурацил и их комбинации с лейковорином вызвали повышение в 1,4-1,8 раза количества клеток с хромосомными абер- рациями в культурах клеток, полученных из УД аденокарцином. Первичные культуры опу- холевых клеток отличаются по уровню коло- ниеобразующей активности. Обработка 5-ФУ, ЛВ и 5-ФУ+ЛВ ингибирует колониеобразую- щую активность опухолевых клеток НД адено- карцином больных «2» и «9» (рис. 2А), а также УД аденокарциномы больного «4» (рис. 2 Б). Цисплатин стимулирует образование колоний в культурах клеток НД аденокарциномы больных «1» и «2», а также УД аденокарциномы боль- ных «3», «4» и «6». Инкубация в течение 7 дней клеток с томудексом и комбинацией этого цито- статика с лейковорином не влияет на колониео- бразующую активность клеток НД аденокарци- номы больного «1», УД аденокарцином больных «4», «5», «7» и «10». Динамика роста опухоле- вых клеток, обработанных препаратами in vitro, имеет индивидуальные особенности (рис. 3). Клетки первичных культур, полученные из НД аденокарцином, не чувствительны к цитотоксическому действию лекарственных препаратов. Исключением является высокая чувствитель- ность к томудексу клеток, полученных из УД и ВД аденокарцином. Максимально чувствитель- ными к цитотоксическому действию противоо- пухолевых препаратов являются клетки, полу- ченные из ВД аденокарцином. Экспериментально выявлено, что комбина- ции противоопухолевых препаратов эффектив- нее подавляют развитие опухолевых клеток. Гипермутагенез и снижение чувствительности клеток к цитостатическому действию противо- опухолевых препаратов являются признаками мутаторного фенотипа клеток, который возни- кает в результате мутаций в генах системы репа- рации ошибочно спаренных оснований и явля- ется одной из причин развития КРР [10]. В клет- ках, мутантных по гену hMSH6, - высокая экс- прессия белка Msh3, а в клетках, мутантных по гену hMSH2, не экспрессируются белки Msh3 и Msh6 [9]. Анализ продуктов ПЦР реакции сви- детельствует о присутствии мутаций в генах hMSH6 (два пациента с УД и один пациент с ВД аденокарциномами) и hMSH2 (четыре паци- ента с УД аденокарциномой) (рис. 4). В качестве контроля в анализе использованы праймеры к гену, продуктом которого является β-актин. Высокая пролиферативная активность, геном- ная нестабильность, низкая чувствительность к противоопухолевым препаратам опухоле- вых клеток являются показателями отсутствия аллелей дикого типа MSH2 и MSH6 в соматиче- ских клетках. Работы по созданию новых стра- тегий доклинических исследований резистент- ности опухолевых клеток направлены на созда- ние модели, которая позволит унифицировать химиотерапевтическое лечение и выбрать инди- видуальные схемы лечения пациентов [12, 13]. Модели доклинического скрининга цитостати- ков с использованием панели музейных переви- Праймеры Таблица 1 Ген F-праймер R-праймер β-актин 5’-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3’ 5’-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3’ MSH6 5’-GATGGCATTTTCACAAGGATGGG-3’ 5’-CTGGCGGATAATGGGTGACAAAC-3’ MSH2 5’-ACAAGGGGCTGGGTTAGCAAAAG-3’ 5’-AGTCACCATTCTCTTCCGCTTTCG-3’ PMS2 5’-TTCTCAGGTTATCGGAGCCAGCAC-3’ 5’-CTTCGTCCCAATTCACCTCAGTGG-3’ MLH1 5’-CAGGTTTCATTTCACAATGCACGC-3’ 5’-TTACCTTCAACATCCAGCAGTGGC-3’ MSH3 5’-GGCAACAGTTCGACTCCTTTCAAG-3’ 5’-TTGATACCCTCCCCGTTATCTCGC-3’ ваемых культур неопластических клеток позво- ляют разработать схему противоопухолевой терапии, но не дают возможность осуществлять индивидуальную прогностическую оценку раз- вития химиорезистентности опухолевых клеток [14]. На наш взгляд, необходим принципиально новый подход к выбору схем лечения больных. Экспозиция индивидуальных первичных куль- тур клеток с различными молекулярными меха- низмами действия противоопухолевых препа- ратов дает возможность оценить генетически детерминированную химиорезистентность кле- ток и апробировать комбинацию химиопрепара- тов, оптимально эффективную для подавления роста и развития опухоли.

About the authors

N V Golyasnaya

Email: golasnaya@mail.ru

Yu V Ivanov

N S Zhizhin

Email: gigin2000@mail.ru

References

Supplementary files