ThE uSE of AbErrAnT METhylATEd gEnES SEPT9 And VIM for clInIcAl dIAgnoSIS of colorEcTAl cAncEr

Full Text

Колоректальный рак (КРР) является одним из наиболее агрессивных типов рака и зани- мает второе место по распространенности в Рос- сии. Было доказано, что одна из основных при- чин, влияющих на развитие этого заболевания, эпигенетические нарушения регуляции генов [1]. Определение эпигенетических нарушений имеет большое значение для ранней диагностики раковых заболеваний, так как нарушен- ная регуляция генов вследствие аберрантного метилирования ДНК является ключевой ста- дией в развитии опухоли [2]. При этом, метили- рованная ДНК является достаточно информа- тивным биомаркером и может быть легко изме- рена в образцах крови или плазмы [3]. Мети- лирование обширных регионов CpG-островков основное эпигенетическое изменение, харак- терное для процессов канцерогенеза при КРР. В настоящий момент на рынке представлены зарубежные коммерческие наборы для опреде- ления аберрантного метилирования генов SEPT9 либо VIM, однако эти наборы выпускаются раз- ными фирмами и применение в диагностичес- кой практике сразу двух генов затруднительно. Использование лишь одного маркера мети- лирования зачастую недостаточно для эффек- тивной диагностики заболевания, так как пока- затели чувствительности и специфичности отдельных маркеров невысоки, поэтому пред- ставляет интерес проверка диагностических характеристик модели из нескольких маркеров. Для этих целей мы определяли частоту метили- рования в генах SEPT9 и VIM. Наличие аберрантного метилирования в гене SEPT9 тесно связано с развитием КРР. Даже на ранних стадиях КР отмечается гиперметили- рование гена SEPT9 [1]. Септин принадлежит к классу ГТФ-связывающих полипептидов, кото- рые задействованы в большом количестве кле- точных процессов [4]. У людей в общей сложно- сти 13 генов септина. Все септины могут образо- вывать гетеромерные комплексы и участвуют в формировании структур наподобие нитей, колец и клеток. Эти уникальные структуры участвуют в клеточном делении, формируют плазму мем- браны, кольца сперматозоидов, основания рес- ничек и дендритов [5, 6]. Ген SEPT9 расположен на хромосоме 17q25.3, и экспрессируется в большинстве клеток чело- века. Было показано, что SEPT9 имеет 18 различ- ных транскриптов, которые кодируют 15 поли- пептидов [7]. Они играют важную роль в дина- мике актина, в процессах ангиогенеза, в подвиж- ности и пролиферации клеток, цитокинезе, регу- лировании микротрубочек, и процессах экзоци- тоза Несколько недавних исследований показы- вают, что SEPT9 занимает концевую позицию в октамерциссептиновом комплексе и играет клю- чевую роль в полимеризации субъединиц и ста- билизации целых гетеромеров [8]. Это также имеет важное значение для окончательного раз- деления дочерних клеток во время цитокинеза. Продукт гена VIM, виментин, входит в состав цитоскелета, а также задействован в иммунном ответе и контролирует транспорт липопротеинов низкой плотности. VIM содержит богатый CpG динулеотидами промотерный регион, рядом с которым расположен первый экзон, являю- щийся мишенью для ДНК-метилтрансфераз. Было показано, что в 53-84% образцов опу- холи и сыворотки больных КРР имеет место метилирование гена VIM [9, 10], таким образом, метилированный ген VIM является потенциаль- ным маркером для диагностики КРР. Важно отметить, что маркерные молекулы для диагностики заболеваний не всегда лежат в основе развития заболеваний. Данное утверждение в осо- бенности справедливо для маркеров метилирова- ния. В ряде работ было показано отсутствие пря- мой корреляции между аберрантным метилирова- нием и выраженностью экспрессии генов [11, 12]. При анализе генома пациентов с КРР очень часто выявляются мутации (частота до 40%) [13]. KRAS является геном, кодирующим один из бел- ков, играющих важную роль в сигнальной системе рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) - сложного сигнального каскада, принимающего участие в развитии и прогрессировании рака. Белок KRAS регулирует другие белки, находящи- еся далее в сигнальной системе EGFR, которые связаны с выживаемостью опухоли, ангиогенезом, пролиферацией и метастазированием [14]. При метастатическом колоректальном раке почти 60% пациентов имеют нормальную сиг- нальную систему EGFR и дикий тип гена KRAS; остальные 40% имеют мутантный тип гена [13]. Тестирование генов, кодирующих белки семейства RAS (K-RAS и N-RAS) позволяет отобрать пациентов с диким типом (без мута- ции) генов RAS, у которых может быть получен ответ при лечении моноклональными антителами, блокирующими EGFR. В данном исследовании мы обладали воз- можностью сопоставить статус мутации генов семейства RAS с наличием аберрантного мети- лирования в выбранных нами генах. Основной задачей этой работы был анализ метилирования промотерных участков генов SEPT9 и VIM у пациентов с КРР для формирова- ния единой панели эпигенетических маркеров, позволяющей диагностировать данную онкопа- тию с высокой чувствительностью и специфич- ностью. Материалы и методы Работа была одобрена локальным этическим комитетом, выполнена в соответствии с требо- ваниями GCP (Good Clinical Practice) и Хель- синской декларацией по защите прав человека. Исследование включало 150 парных образ- цов опухолевой ткани с известным статусом мутации генов семейства RAS и прилегающей гистологически неизмененной ткани пациентов с аденокарциномой прямой кишки, прохо- дивших лечение в Республиканском клиниче- ском онкологическом диспансере Министер- ства здравоохранения Республики Татарстан в 2008-2012 годах (таблица 1). Каждый паци- ент подписал добровольное информированное согласие на участие в проведении исследования. Опухоли классифицированы в соответствии с TNM-классификацией Международного про- тиворакового союза и описаны гистологически на основании классификации Всемирной Орга- низации Здравоохранения (ВОЗ) [12, 13]. Для отбора образцов с высоким содержанием опу- холевых клеток проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов. Отби- рали образцы из первичных очагов с содержа- нием опухолевых клеток не менее 50%. Таблица 1 Клиническая характеристика пациентов Пол Количество мужской 72 женский 78 Возраст >50 124 <50 26 Стадия опухоли Т2M0 11 Т3M0 36 Т4М0 38 Т2М1 2 Т3М1 18 Т4М1 28 Выделение ДНК осуществлялось набо- ром QIAamp DNA FFPE Tissue Kit («Qiagen», Германия), концентрацию суммарной ДНК в водном растворе оценивали на спектрофотоме- тре NanoVue Plus («GE Healthcare», Великобри- тания) по соотношению оптической плотности при длинах волн 260 и 280 нм. Бисульфитная кон- версия и очистка проводились наборами EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit («Qiagen», Герма- ния) с помощью автоматической станции пробо- подготовки QIAcube («Qiagen», Германия). Изу- чение профилей метилирования производилось с помощью метода MethyLight PCR c олигонукле- отидами (таблица 2), подобранными на локусы, содержащие дифференциально метилируемые CpG-островки, на приборе StepOnePlus™ Real- Time PCR Systems («Applied Biosystems», США). В качестве неметилированного гена сравнения использовали COL2A1. Для определения степени метилирования вычисляли величину порогового цикла (Ct) для каждого гена-мишени, затем вели- чину ΔCT (мишень-контроль), после значение ΔΔCT (мишень-калибрант). Величина RQ рас- считывалась по формуле RQ=2^(- ΔΔCT). Мети- лированным считался образец с RQ>10. Статус мутаций в генах KRAS и NRAS опре- деляли с помощью наборов KRAS-24 и NRAS-24 (ООО «Тестген», Россия). Статистический анализ данных проводили с применением точного критерия Фишера. Уро- вень значимости принят равным 0.05. Конкор- дантность данных по метилированию оцени- вали с помощью непараметрической ранговой корреляции Спирмана. Значимость корреляции по Спирману (Rs) проверяли с помощью t-теста Стьюдента: с числом степеней свободы ν = N - 2, где N - размер выборки. Уровень значимости принят равным 10-6. Чувствительность и специфичность мар- керов оценивались с помощью ROC-анализа (MedCalc.2 software) Результаты и обсуждение В данном исследовании подтвердилось нали- чие аберрантного метилирования у пациентов, больных КРР. ДНК образцов опухоли была досто- верно чаще метилирована, чем ДНК образцов прилежащей ткани (P=8,67E-19 для гена SEPT9 и P=8,68E-19 для гена VIM) (рис. 1). Довольно интересно, что гены SEPT9 и VIM не являются биологически значимыми маркерами в разви- тии КРР, однако ценность их как диагностиче- ских маркеров представляется нам очень высокой, так как в отличие от таких маркеров, как MLH1 и MGMT (продукты которых участвуют в канце- рогенезе), они обладают высокими показателями как чувствительности, так и специфичности (чув- ствительность 60-70% для SEPT9 и VIM) По результатам проведенной работы мы выя- вили, что в группе пациентов, имеющих мута- ции в генах KRAS или NRAS, ДНК опухоле- вых образцов достоверно чаще метилирована в генe SEPT9 (P=0.0018), в отличие от ДНК опу- холевых образцов пациентов, не несущих дан- ных мутаций. В исследованиях похожей тема- тики также подтверждается частое гипермети- лированние промотерных участков генов при наличии активирующих мутаций гена KRAS [15]. Биологические основы этого обстоятель- ства на сегодняшний день до конца не изучены. Мы можем предположить, что процессы канце- рогенеза у носителей мутаций в генах семейства Параметры праймеров и зондов для ПЦР в режиме реального времени Таблица 2 Ген Последовательность, 5’-3’ Длина продукта Условия реакции, °С SEPT9 Праймер - FM, TAGGGTTCGGGTTTCGTCG ,57C Праймер - RM,TTTCAAAACTTCGAAATCCG,51C Зонд - CGCGTTAACCGCGAAATCCG-BHQ1, 61C 98 51 VIM Праймер - FM, GGCGGTTCGGGTATCG,56C Праймер - RM, CGTAATCACGTAACTCCGACT,54C Зонд - GACGCGGAGGCGAGTCGGTCG-BHQ1, 63C 146 54 COL2A1 Праймер - FM, AGGGTAATTTTGGAATAGATGGA, 64C Праймер - RM, TCTCCTAAAATAACAAAATCCACAA, 63CЗонд - CAACACTCACAACAAATCCTTTAACTCCAA -BHQ2, 69C 83 54 RAS протекают в целом быстрее и агрессивнее [16, 17], поэтому аберрантное метилирование в некоторых генах у пациентов-носителей мута- ций также будет выражено сильнее. Рис. 1. Процент метилированных образцов в зависимости от статуса мутации генов,кодирующих белки семейства RAS. Мы провели корреляционный анализ для выявления зависимости степени прогрессирова- ния КРР (учитывалось наличие или отсутствие метастазов) и частоты метилирования. Корре- ляция между данными показателями оказалась очень слабой (r=0,03967, P>0,05 для гена SEPT9, r= 08871, P>0,05 для гена VIM). Вероятно, для выявления степени прогрессирования КРР сле- дует анализировать профиль метилирования. На сегодняшний день для диагностики коло- ректального рака существуют наборы для опре- деления метилирования в гене SEPT9, либо набор для определения метилирования в гене VIM, однако обеспечить лишь одним из данных наборов необходимые для диагностики показа- тели чувствительности и специфичности пред- ставляется затруднительным. Использование нескольких маркеров позволили бы улучшить показатели диагностических тест-систем. В рамках данной работы был рассчитан индекс метилирования для каждого образца и проверены параметры чувствительности и специфичности как для совокупности маркеров, так и для каж- дого маркера в отдельности. За пороговое значе- ние для анализа совокупности маркеров был взят индекс метилирования, равный 0,5. Под индек- сом метилирования понимается отношение числа метилированных локусов к общему числу локу- сов модели. При этом значении система из марке- ров имеет высокие показатели чувствительности и специфичности (91,3% и 78,0% соответственно). AUC, показатель интегральной оценки качества и предсказательной способности модели, состав- ляет 0,90, что говорит о высоком качестве модели. Таким образом, использование нескольких маркеров при диагностике КРР позволяет существенно улучшить параметры тест-системы. Выводы В данной работе подтверждается высокая частота метилирования генов SEPT9 и VIM в опухолевых тканях больных КРР. Для генов SEPT9 и VIM были установлены высокие показатели чувствительности и специ- фичности (чувствительность 70,7% и специфич- ность 89,4 % для SEPT9, чувствительность 75,3% и специфичность 87,3% для VIM), которые счита- ются важными клиническими маркерами, имею- щими большие перспективы в диагностике КРР. В настоящем исследовании мы показали, что Рис. 2. Сравнение результатов ROC-анализа для каждого маркера в отдельности и для совокупности маркеров. ДНК опухолевых образцов пациентов с мутаци- ями в гене KRAS достоверно чаще метилирована в гене SEPT9 (P=0.0018) в отличие от ДНК опу- холевых образцов пациентов, не несущих данных мутаций. Однако биологические основы этих результатов требуют дальнейших изучений. Нами было продемонстрировано, что исполь- зование совокупности маркеров метилирования, таких как SEPT9 и VIM, позволяет улучшить чув- ствительность тест-систем, используемых в диа- гностике КРР, но показатели специфичности остаются на прежнем уровне. В связи с получен- ными результатами нами планируется проверить эффективность таких маркеров метилирования, как APC, ITGA4, RASSF1A, а также оценить пока- затели системы, состоящей из пяти маркеров. Таким образом, внедрение в практику теста, основанного на определении маркеров КРР, может сократить время и облегчить процедуру диагностики данного заболевания, а также слу- жить хорошим средством для оценки динамики состояния пациентов.

About the authors

O I Brovkina

Email: brov.olia@gmail.com

M G Gordiev

Email: marat7925@gmail.com

D S Khodyrev

Email: DmKh008@gmail.com

A G Nikitin

Email: avialn@gmail.com

A V Averyanov

Email: averyanovav@mail.ru

References

Supplementary files