INVESTIGATION OF STRUCTURE OF THE MEMBRANE RAFTS BY MEANS OF COMPUTER MODELING

Full Text

Введение Биологические мембраны построены в основ- ном из белков, липидов и углеводов. Белки и липиды составляют основную часть сухой массы мембран. Доля углеводов обычно не превы- шает 10-15%, причем они связаны либо с моле- кулами белка (гликопротеины), либо с молеку- лами липидов (гликолипиды). В мембранах раз- личного происхождения содержание липидов колеблется от 25 до 75% по массе по отношению к белку. Липидный состав биологических мем- бран весьма различен и зависит от выполняе- мых функций, изменения в нем ведут к непра- вильному функционированию [1, 2]. Большое количество экспериментов ука- зывает на то, что в мембране есть наноразмер- ные области, обогащенные сфингомиелином и холестерином - «рафты» (от англ. raft - плот). Будучи ассоциироваными с мембранными бел- ками, рафты играют важную роль в функцио- нальной активности клетки: мембранного транс- порта, передачи сигнала, регуляции активности мембранных белков [3, 4]. Ввиду своих малых размеров рафты не могут быть детально исследованы классическими методами с помощью световой микроскопии [5]. Прямые свидетельства наличия рафтов в мем- бранах in vivo были получены на основе монито- ринга движения мембранных белков [6] или на распределении флуоресцентных зондов в мем- бранных средах [7]. Методами фотонной сило- вой микроскопии [8] были измерены размеры липидных рафтов и показано, что рафты в плаз- матической мембране фибробластов диффун- дируют как агломераты диаметром 50 нм, что соответствует площади поверхности порядка 3000 сфинголипидов. Небольшой размер раф- тов может иметь важное значение для поддер- жания содержащихся в нем сигнальных белков в «выключенном» состоянии. Соответственно, для активации этих белков необходимо сгруп- пировать малые рафты вместе с образованием большой рафтовой области, в которой функци- онально родственные белки могут взаимодей- ствовать между собой [9, 10]. Одним из примеров такого процесса кла- стеризации рафтов, встречающихся в повсед- невной клинической практике, является пере- дача сигнала от антитела IgE во время аллерги- ческого иммунного ответа [11, 12]. Чем больше участников каскада собираются в один рафт, тем выше отклик в ответ на сигнал. Неконтро- лируемое усиление сигнального каскада в рафте может вызвать гиперактивацию ответа с опас- ными для жизни последствиями, такими как отек Квинке и анафилактический шок. Таким образом, в передаче сигналов IgE липидные рафты нужны для повышения эффективности передачи за счет концентрации участвующих белков в жидкостных микродоменах, ограничи- вая их латеральную диффузию [13]. Другим клинически значимым примером кла- стеризации рафтов являются патогенетические механизмы пороформирующих токсинов, кото- рые секретируются Clostridium, Streptococcus, и Aeromonas [14]. Эти токсины могут вызывать самые разнообразные заболевания, от легкого целлюлита до газовой гангрены и псевдомембра- нозного колита. Наиболее изученным является токсин аэролизин морской бактерии Aeromonas hydrophila [14, 15]. Аэролизин связывается с GPI-белком, заякоренным в рафте на поверхно- сти мембраны клетки-хозяина. Токсин включа- ется в мембрану после протеолиза, а затем гепта- меризуется в рафте таким образом, чтобы сфор- мировать канал, через который внутрь клетки текут малые молекулы и ионы, нарушая гоме- остаз клетки. Олигомеризация аэролизина наблюдается также и в растворе, но на поверх- ности живой клетки необходимая концентра- ция токсина ниже более чем в 105 раз [15]. Это огромное увеличение эффективности связано с тем, что при взаимодействии токсина с рафтами происходит агрегация последних, а это, в свою очередь, амплифицирует олигомеризацию боль- шего количества токсинов. Известно, что многие вирусы целенаправ- ленно связываются с рафтовыми областями мембран, а также имеют сфинголипид/холе- стериновые области в своих мембранах. Вирус гриппа присоединяется к апикальной мем- бране эпителиальных клеток, которая обога- щена липидными рафтами. Вирусная мембрана состоит в основном из рафтовых областей мем- браны, что в свою очередь, ускоряет кластери- зацию с рафтами клеток хозяина [16]. ВИЧ-1, который также включает в себя рафтовые обла- сти и белки хозяина, использует их, по крайней мере в четырех ключевых событиях жизненного цикла: прохождение через слизистую оболочку нового хозяина, проникновение вируса в клетки иммунной системы, передача сигнала об изме- нениях в функционировании клетки-хозяина, а также выход вирусных частиц из клеток и их распределение в кровеносной системе хозяина [17]. Также было показано, что белки, ответственные за возникновение прионных заболе- ваний и болезни Альцгеймера, связаны с рафто- выми областями мембран и могут индуцировать развитие этих патологий [18, 19]. Природа основных взаимодействий, кото- рые приводят к образованию неоднородностей в мембране, находится на стадии обсуждения [20]. Известно, что холестерин играет важную роль в стабилизации рафта: при наличии холесте- рина параметр порядка ацильных цепей повы- шается, уменьшается площадь, приходящаяся на липид, и следовательно, увеличивается упа- ковка - плотность - липидных молекул [21- 23]; кроме того, холестерин заполняет пустое пространство в регионе ацильных цепей липи- дов [21], т.е. с увеличением концентрации холе- стерина увеличивается жесткость изгиба мем- браны. Выше была отмечена трудность выпол- нения экспериментов с использованием живых клеток для измерения физических свойств раф- тов, таких как точный состав липидов, характе- ристические размеры и время жизни [21, 24, 25]. Поэтому появляется необходимость рассматри- вать различные модели, чтобы охарактеризовать взаимодействия, ответственные за формирова- ние, стабильность, размер и подвижность раз- личных мембранных доменов. Для этого созда- ются модельные системы, состоящие из двух и трех видов липидов. В экспериментах на искусственных мем- бранах было обнаружено, что большие рафты имеют практически круглую форму и являются бислойными структурами, т.е. располагаются сразу в двух монослоях мембраны симметрично относительно межмонослойной поверхности. В настоящее время причина бислойной природы рафтов не установлена [26]. Обычно считается, что между углеводородными хвостами сфин- гомиелина, находящегося в разных монослоях, действует эффективное притяжение, однако его величина и причина возникновения неиз- вестны. Ранее в работах [27, 28] была обсуждена другая возможная причина двуслойности рафта. Авторы предположили, что монослои рафта сдвинуты друг относительно друга. На основа- нии расчетов было показано, что относительный латеральный сдвиг границ доменов в монослоях и возможность деформации межмонослойной поверхности являются для системы дополни- тельными степенями свободы, что приводит к уменьшению граничной механической энер- гии. Основная движущая сила, стабилизирую- щая двуслойную структуру, - упругие деформации мембраны, вызванные различием толщин монослоев рафта и окружающей мембраны. Раз- меры рафтов (порядка нескольких нанометров), позволяют изучать их методом молекулярной динамики [29-32]. В данной работе мы прове- ряли гипотезу о двуслойности рафтов в мембра- нах и роли сдвига монослоев в этом процессе. Методы Параметры для липидов, протоколы моде- лирования были взяты из [32]. Молекулярная динамика проводилась с использованием про- граммного пакета GROMACS [33] Во всех чис- ленных экспериментах использовали силовое поле GROMOS (тяжелоатомное приближение) и модель воды TIP3P. Расчет равновесных тра- екторий проводился в NPT-ансамбле при темпе- ратуре 323К с термостатом Нозе-Гувера и баро- статом Парринелло-Рамана (давление 1 бар). Для потенциала Леннарда-Джонса радиус обре- зания составлял 1.2 нм, для расчета электроста- тических взаимодействий использовался метод PME. Шаг интегрирования - 2 фс. Данные по составу системы представлены в таблице. Все мембраны перед расчетом свободной энергии взаимодействия были эквилибрированы (рис.1). Размер систем - более 450 000 атомов. Рис. 1. Вид мембраны со встроенным рафтом: расстоя- ние между центрами масс двух монослоев рафта - 5,4 нм. Серым цветом показаны липиды ПОФХ, синим - СМ, жел- тым - ХОЛ. Атомы фосфора - оранжевые сферы, атомы кислорода ХОЛ - красные. Для изучения взаимодействия монослоев рафта был построен профиль свободной энергии для процесса их сдвига друг относительно друга. Были построены мембраны с заранее сформиро- ванным рафтом в центре (рис. 2) и различными сдвигами монослоев друг относительно друга. При расчете потенциала средней силы (ПСС) [34] использовался метод зонтичной выборки со следующими параметрами: Энергия взаимодей- ствия двух монослоев рассчитывалась только для x-составляющей. Константа жесткости k=1000 кДж/моль/нм2 Расстояние между монослоями (position restraints, плоскость yz) - постоянное Рис. 2. Схема сборки рафтов со сдвигами монослоев в мем- бране. Подробное описание каждого этапа представлено в тексте. Результаты и обсуждение Изучение взаимодействия монослоев в рафте - трудоемкая задача, так как требует боль- ших вычислительных мощностей, а также под- бора оптимального алгоритма расчета. Схема сборки представлена на рис. 2. Сначала (1) были собраны мембрана длиной 36 нм (ПОФХ) и рафт длиной 12 нм (СМ и ХОЛ) по отдельно- сти. На следующем этапе (2) монослои рафта сдвигались друг относительно друга на рассто- яние 1 нм, т.е. было получено 7 структур рафта со сдвигами: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 нм. После этого (3) рафты вставлялись в центр мембраны ПОФХ. Рис. 3. Профиль свободной энергии двух монослоев рафта при различных сдвигах. В полученной системе были выбраны несколько молекул ПОФХ (по 2 нм) с обоих концов рафта (4), которые присовокуплялись к группам верх- него («up») и нижнего («down) монослоя рафта. Это было сделано для более точного описания модели [28]. Наконец, после релаксации каж- дой из семи систем (5), мембрана и рафт слегка «ужались», рафт стал толще, а мембрана тоньше. Во время релаксации рафт и прилегающие к ним липиды ПОФХ, входящие в группы «up» и «down», изогнули мембрану (Рис. 1). Изгиб мембраны связан со сдвигом монослоев рафта, ранее также были описаны искривления при формировании рафтов [35]. После релакса- ции полученных структур методом зонтичной выборки была рассчитана кривая взаимодей- ствия монослоев друг с другом в зависимости от сдвига монослоев друг относительно друга. Из начальных точек (0-6 нм) верхний монослой со скоростью 10-5 нм/пс сдвигался на 1 нм. Из траектории движения выбирались положения, в которых будет рассчитана свободная энергия: 0,15, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,4 - всего 12 точек. Траектории зонтичной выборки обраба- тывались по алгоритму WHAM [36]. Кривая расчетов свободной энергии сдвига монослоев представлена на Рис. 3. Из кривой видно, что основной минимум (100 кДж/моль) приходится на сдвиг, равный 3,1 нм. Кривая, рассчитанная методом молекулярной динамики, не совпала с предложенной в [27]. Скорее всего, это связано с тем, что теоретическая модель не учитывает изгиб мембраны, возникающий при сдвиге монослоев рафта. Заключение В данном исследовании впервые методами молекулярной динамики был рассчитан про- филь свободной энергии сдвига монослоев рафта друг относительно друга в тяжелоатом- Характеристика исследуемых систем Таблица Мембрана Рафт Количество атомов в системе Сдвиги монослоев, нм Время расчета, нс ПОФХ СМ ХОЛ 97943 0,15, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3,3,5, 4, 4,5, 5, 5,4 Равновесная МД ПСС 413 104 106 50 50 Примечание: ПОФХ - пальмитоилолеилфосфатидилхолин,СМ - сфингомиелин,ХОЛ- холестерин ном приближении. При сдвиге границ фазы рафта образовался изгиб в мембране, который ранее не учитывался авторами в теоретических расчетах. В работе была численными методами под- тверждена теория о сдвиге монослоев рафтов друг относительно друга. Это косвенно может являться доказательством бислойности раф- тов по причинам, описанным выше. Кроме того, возникающий изгиб при сдвиге монослоев рафта друг относительно друга, может играть существенную роль в процессах, связанных с образованием кавеол мембран [37, 38], пере- даче сигналов и кластеризации рафтов и рафт- ассоциированных белков [39], изменять проницаемость мембраны для различных веществ и организмов [38]. Понимание процессов возникновения и фор- мирования рафтов, их ультраструктуры может помочь в борьбе со многими инфекционными заболеваниями, вызванными различными пато- генами (вирус гриппа, ВИЧ, стрептококками, клостридиями и проч.) [40, 41]. Знание механиз- мов взаимодействия рафтов между собой и с дру- гими молекулами позволит найти эффективные способы борьбы со многими старческими патоло- гиями, в том числе такими как болезнь Альцгей- мера и прионными заболеваниями [19, 42]. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ #16-34-01047мол_а.

About the authors

M E Bozdaganyan

Email: m.bozdaganyan@gmail.com

K V Shaitan

References

Supplementary files