Influence of PDI gene overexpression on heterological proteins production in yeast Pichia pastoris

Full Text

Введение

Дрожжи Pichia pastoris представляют собой удобную систему экспрессии гетерологичных генов. Особенностями P. pastoris являются простота культивирования, методики генетических манипуляций, сильные, сравнимые с бактериальными промоторы, например промотор гена GAP или строго регулируемый промотор гена AOX1, а аэробный тип метаболизма позволяет достигать высокой плотности клеточной суспензии. От прокариотических систем экспрессии P. pastoris выгодно отличает наличие ферментов посттранс ляционных модификаций эукариотических белков и высокая вероятность их успешного синтеза и правильного фолдинга [28]. P. pastoris, в отличие от распространенной эукариотической системы экспрессии гетерологичных генов на основе дрожжей Saccharomyces cerevisiae, синтезируют гликопротеины с меньшим количеством мономеров без иммуногенных α-1,3-связанных манноз [15]. Количество гетерологичных генов, экпрессированных в P. pastoris, постоянно увеличивается, а появление нуклеотидной последовательности генома в открытом доступе [29] открывает дополнительные возможности для изучения данного организма. Одновременно растет количество коммерческих препаратов на основе рекомбинантных белков, произведенных в P. pastoris, на данный момент их уже 16 [33].

Многие рекомбинантные белки продуцируют в дрожжах в виде секреторных продуктов. Прежде чем покинуть клетку после трансляции, белок должен проделать длинный путь, сопровождаемый посттрансляционными модификациями — из эндоплазматического ретикулума (ЭР) через транспортные везикулы в аппарат Гольджи (АГ) и через секреторные везикулы во внеклеточное пространство [18]. Многие секреторные гетерологичные белки в дрожжевых системах экспрессии продуцируются в количестве не более 1 % от теоретически возможного [25]. Очевидно, что изучение подходов к увеличению выхода таких белков в P. pastoris является актуальной задачей.

Было показано, что в P. pastoris синтез гетерологичных белков является стрессорным фактором и приводит к повышенному уровню транскрипции генов шаперонов, вспомогательных белков фолдинга, внутриклеточного транспорта и других [20]. Исходя из этого, можно предположить, что коэкспрессия генов белков, участвующих в секреции и фолдинге, может влиять на выход гетерологичного белка.

Одним из таких белков является протеиндисульфидизомераза (Pdi). Pdi — мультифункциональный белок массой 57 кДа, который находится в ЭР эукариотических клеток. Он катализирует формирование, восстановление и изомеризацию дисульфидных связей в синтезируемых белках. Помимо каталитической функции, Pdi выступает в качестве шаперона, ингибируя агрегацию неправильно свернутых белков, и является частью по крайней мере двух мультиэнзимных комплексов [40].

У эукариот Pdi была обнаружена в результате исследования окислительного рефолдинга in vitro Гилбертом и др. [8]. У хорошо изученных дрожжей S. cerevisiae найдены четыре паралога гена ScPDI [31], а у человека существует целое семейство Pdi, насчитывающее 20 белков, участвующих во многих физиологических и патологических процессах [14]. Нуклеотидная последовательность гена PpPDI в дрожжах P. pastoris была расшифрована Уорсеймом и др. [40]. Во всех организмах Pdi выполняет важные, незаменимые функции. Делеция у дрожжей S. cerevisiae основного гена ScPDI1 приводит к нежизнеспособности клеток [19], а у нематоды Caenorhabditis elegans один из трех паралогов — ген CePDI2 необходим для нормального постэмбрионального развития [41]. Сведений о наличии паралогов гена PpPDI в дрожжах P. pаstoris и влиянии делетирования гена PpPDI на жизнеспособность дрожжей нет.

Коэкспрессию гена PDI для увеличения синтеза гетерологичных белков использовали во многих системах экспрессии. Эффект был показан, начиная от бесклеточных систем трансляции при получении антител [37] до систем на основе гибридом [24] и клеток яичников китайского хомячка (CHO-линий) [16]. В клетках Esсherichia coli коэкспрессия эукариотической Pdi увеличивала выход антигенсвязывающего домена (Fab-домена) [23] и бычьего ингибитора трипсина [32]. В бакуловирусной системе коэкспрессия гена PDI повышала уровень раст воримых антител in vivo [22]. Влияние сверхэкспрессии гена PDI на продукцию гетерологичных белков изучали и в дрожжах. Например, внесение еще одной копии гена KlPDI1 в геном дрожжей Kluyveromyces lactis повышало продукцию сывороточного альбумина человека — белка, насыщенного дисульфидными связями [26]. В дрожжах Schizosaccharomyces pombe сверхэкспрессия каждого из двух паралогов гена SpPDI приводила к повышению продукции секретируемого сывороточного трансферрина человека [30]. Многочисленны примеры сверхэкспрессии гена PDI в дрожжах S. cerevisiae и P. pastoris [21].

Целью нашего исследования было оценить влияние сверхэкспрессии гена PpPDI на уровень продукции модельных гетерологичных белков: интерферона-альфа16 человека (IFNα16-hum) и интерферона-гамма курицы (IFNγ-chk).

Интерфероны — белки иммунной системы, участвующие в обеспечении противовирусной защиты организма, обладающие многообразными биологическими функциями. Выбор этих белков в качестве модельных был обусловлен несколькими причинами. Во-первых, препараты на основе интерферонов используются для лечения различных вирусных и онкологических заболеваний человека [9]. IFNγ-chk может быть использован как адъювант вакцин и фактор роста в птицеводстве [27]. Во-вторых, данные интерфероны различаются по своему строению: IFNα16-hum — негликозилированный белок, в котором присутствуют две дисульфидные связи (Uniprot No P05015, 01.09.2016), IFNγ-chk — гликозилированный белок без дисульфидных связей (Uniprot No P49708, 01.09.2016). Различия в строении белков позволят ответить на вопрос, как влияет сверхэкспрессия гена PpPDI на продукцию интерферонов, и оценить зависимость эффекта от присутствия в белках дисульфидных связей и сайтов гликозилирования.

Материалы и методы

Плазмиды

Для создания векторов экспрессии использовали плазмиды pPIC9 и pPICZαA (Invitrogen).

Штаммы

На этапе конструирования плазмид и их амплификации применяли штамм DH5a Escherichia coli (F’/ endA1 hsdR17 (rk- mk+) supE44 thi-1 recA1 gyrA (Nalr) relA1 D(lacZYA-argF)U169 deoR (f80dlacD(lacZ)M15). В работе были использованы штаммы дрожжей P. pastoris, экспрессирующие структурные гены интерферона-альфа16 человека (GS-humA16) [11] и интерферона-гамма курицы (GS-chkIG) [13], под контролем промотора гена AOX1 и секретирующие гетерологичные белки. Для получения штаммов фенотипа Mut+ и MutS, не секретирующих гетерологичные белки, применяли штамм P. pastoris GS115 (his4) (Invitrogen) (his4 — мутация, приводящая к потребности в гистидине). Полученные в работе штаммы приведены в таблице 1.

Трансформация

Трансформацию дрожжей плазмидными векторами производили методом электропорации по описанной ранее методике [42]; трансформацию бактерий — по стандартной методике [5].

Бактериальные штаммы культивировали в среде Луриа – Бертани [5]. Для отбора трансформантов, устойчивых к ампициллину, в среду добавляли антибиотик в концентрации 50 мг/л; для отбора трансформантов, устойчивых к зеоцину, в среду добавляли антибиотик в концентрации 25 мг/л. При работе на чашках Петри во все среды добавляли 20 г агара на 1 л среды. Штаммы E. coli выращивали при 37 °C.

Для отбора дрожжевых трансформантов, устойчивых к антибиотику зеоцину, использовали среду, содержащую на 1 литр: дрожжевой экстракт — 10 г, пептон — 20 г, глюкозу — 10 г и агар — 20 г, антибио тик — 150 мг/л.

Для отбора дрожжевых трансформантов, прототрофных по гистидину, использовали минимальную среду, содержащую 25 г/л агара и 6,8 г/л смеси витаминов, микроэлементов и источника азота (Y0626 (Sigma)). Для селекции трансформантов, имеющих фенотип MutS, штаммы высевали на минимальную среду (Mm), содержащую 0,5 % метанола в качестве единственного источника углерода, и визуально определяли клетки с замедленным ростом.

Выращивание штаммов-продуцентов гетерологичных белков

Дрожжи P. pastoris культивировали двумя методами — одностадийным и двухстадийным в трех повторностях. При двухстадийном культивировании на первом этапе дрожжи выращивали 48 часов при 30 °C в 200 мл среды, содержащей на литр: дрожжевой экстракт — 10 г, пептон — 20 г, глицерин — 20 г. Затем клетки отбирали центрифугированием при 5000 об/мин 10 минут и переносили в 50 мл среды, содержащей на литр: дрожжевой экстракт — 10 г, пептон — 20 г, метанол — 20 мл и 0,1М калий фосфатный буфер pH = 6,0 (YPM-КФБ). Культивировали при 20 °C 48 часов. При одностадийной схеме выращивания клетки дрожжей одного возраста с твердой среды ресуспендировали в стерильной воде и одинаковое количество клеток засевали в 50 мл среды YPM-КФБ. Культивирование проводили 48 часов при 25 °C. Несмотря на то что 20–22 °C — оптимальная температура для индукции интерферонов, при которой количество белка в культуральной среде максимально [3], для одностадийного культивирования мы выбрали температуру 25 °C, чтобы обеспечить достаточную биомассу продуцента и количество гетерологичного белка. Плотности клеточной суспензии измеряли при длине волны 600 нм.

Для определения влияния сверхпродукции Pdi на удельную скорость роста выращивали инокулюм до стационарной фазы роста на среде с YPM-КФБ, затем засевали одинаковое количество клеток в 120 мл среды Mm. Культивирование проводили 3 суток при 30 °C. Каждые 2 часа измеряли плотность клеточной суспензии. В качестве контроля использовали штамм GS-HIS. Эксперименты выполняли в двух повторностях. Культивирование во всех случаях осуществляли при 150 об/мин.

Для определения влияния восстанавливающих агентов на штаммы со сверхэкспрессией гена PpPDI дрожжи высевали в разных разведениях на твердые среды, содержащие анализируемые вещества, в условиях индукции дополнительной копии гена PpPDI по методике, описанной ранее [17].

Анализ гетерологичных белков

Анализ гетерологичных белков электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) и гибридизацию с антителами выполняли по методике, использованной нами ранее [10].

Пробы готовили концентрированием культуральной жидкости в 10 раз при помощи центрифужных ультрафильтров Amicon Ultra 0,5 mL (Merck Millipore). В качестве контроля на гель наносили культуральную жидкость штамма GS-aox1, выращенного в тех же условиях. Для оценки количества целевого белка в пробах на гель наносили известное количество трипсиногена А, имеющего молекулярную массу 25 кДa, близкую гетерологичным интерферонам. Электрофореграммы анализировали с помощью компьютерной программы GelQuantNET (BiochemLabSolutions).

Для определения интерферона-альфа16 человека использовали первичные кроличьи IgG-поликлональные антитела PA5-54146 (Thermo scientific). В качестве вторичных применяли конъюгат видоспецифических антител к иммуноглобулинам кролика и пероксидазы хрена A-0545 (Sigma). Все антитела разводили в 1000 раз.

Выделение ДНК

Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора реактивов Plasmid Miniprep (Евроген) по методике, рекомендованной производителем; хромосомную ДНК из клеток дрожжей — по методике Smash&Grab [7].

Полимеразная цепная реакция

Для амплификации гена PpPDI использовали праймеры: прямой (f-HindIII-PDI) 5`-ACCCAAGCTTACGATGCAATTCAACTGGGA-3` и обратный (r-PDI-XhoI) 5`-GCCGCTCGAGTTAAAGCTCGTCGTGAGCGT-3`. Прямой праймер содержал сайт узнавания для рестриктазы HindIII, а обратный праймер — для рестриктазы XhoI. Для проверки ориентации гена PpPDI, клонированного под промотором гена AOX1, в качестве прямого использовали праймер (5-AOX1) 5`-CATCCAAAGACGAAAGGTTG-3`, комплементарный 3`-концу промотора гена AOX1. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в приборе Techne TC-3000 (Daigger) по следующей программе: плавление цепей ДНК при 95 °C в течение 45 с, отжиг праймеров в течение 90 с при температуре 55 °C, полимеразная реакция при 72 °C в течение 120 с. После окончания ПЦР пробу инкубировали при 72 °C в течение 5 минут. Всего 35 циклов.

Относительное количество копий гена PpPDI в дрожжевых штаммах определяли при помощи ПЦР в реальном времени (РТ-ПЦР) на приборе АНК-32 (Синтол) методом TaqMan [12]. В качестве референсного гена был взят ген PpACT1. Использовали праймеры следующего состава: прямой к гену PpPDI (F-PDI) 5`-TCGGTAAGCATGCCAAGAAC-3`, обратный к гену PpPDI (PDI-R) 5`-CAACTTCATCGTGGGCCTTT-3`, зонд, меченный флуорофором ROX и гасителем флуо ресценции BHQ-2 (PDI-p) 5`-AGAAATTCATCGCAGGAGAGGCAGA-3`; прямой к гену PpACT1 (F-ACT1) 5`-AGTGTTCCCATCGGTCGTAG-3`, обратный к гену PpACT1 (ACT1-R) 5`-GGTTCATTGGAGCCTCAGTC-3`, зонд, меченный флуорофором ROX и гасителем флуоресценции BHQ-2 (ACT1-p) 5`-CACCACACCTTCCTACAACGAGTTGCGT-3`. Проводили 25 циклов по следующей программе: первоначальное плавление цепей ДНК при 95 °C — 10 мин, 60 °C — 60 с, 95 °C — 20 с.

Результаты

Клонирование гена PpPDI и получение вектора, содержащего ген PpPDI под промотором гена AOX1

В качестве матрицы для амплификации гена PpPDI была использована хромосомная ДНК штамма GS115. Праймеры к началу и концу структурного гена содержали сайты узнавания рестриктазами HindIII и XhoI соответственно. Для транскрипции гена PpPDI в дрожжах был выбран промотор гена AOX1, так как целью исследования было выявить влияние сверхэкспрессии гена PpPDI на продукцию гетерологичных белков, структурные гены которых также работают под контролем промотора гена AOX1. Таким образом достигается одновременная индукция целевого гена и гена-помощника.

Для создания вектора экспрессии гена PpPDI использовали плазмиду pPICZαA, которую обрабатывали рестриктазами HindIII и XhoI, чтобы удалить альфа-фактор дрожжей. Ген PpPDI, полученный при помощи ПЦР, содержал нативную сигнальную последовательность для транслокации белка в ЭР и был фланкирован сайтами узна вания рестриктаз HindIII и XhoI. Подтверждение структуры полученной плазмиды и ориентацию встройки осуществляли при помощи ПЦР и рестрикционного анализа. Схема получения плазмиды представлена на рис. 1a.

 

Рис. 1. Получение плазмид

 

Получение штаммов

Штамм GS-aox1 с фенотипом HIS+ MutS был получен трансформацией штамма GS115 плазмидой pPIC9, обработанной рестриктазой BglII (рис. 1b). Встраивание полученной линейной конструкции, фланкированной 5`- и 3`-областью гена AOX1, происходит с замещением хромосомного гена AOX1экспрессионной кассетой и маркерным геном HIS4.

Штамм GS-HIS с фенотипом HIS+ Mut+ был также получен из штамма GS115 трансформацией плазмидой pPIC9. Плазмиду обрабатывали рестриктазой StuI (рис. 1c), таким образом вставка в геном происходила в локус HIS4, что обеспечивало появление в геноме функ циональной копии гена HIS4 и прототрофность штамма по гистидину. Штамм GS-HIS был использован в качестве контрольного при оценке влияния сверхэкспрессии гена PpPDI на скорость роста дрожжей. Штамм GS-aox1 был использован в качестве контрольного при анализе культуральной жидкости штаммов, продуцирующих гетерологичные белки. Для оценки роста клеток при сверхэкспрессии гена PpPDI применяли штамм GS-AOX1PDI, который получали трансформацией штамма GS-HIS плазмидой pPICZαA-AOX1PDI. Вектор обрабатывали рестриктазой SacI, которая гидролизовала его в 5`-области промотора AOX1 (см. рис. 1), вставка экспрессионной кассеты происходила в хромосомный локус AOX1 за счет кроссинговера с сохранением функциональности гена AOX1.

Для оценки влияния сверхэкспрессии гена PpPDI на продукцию гетерологичных белков штаммы, полученные ранее в нашей лаборатории, секретирующие в культуральную среду интерферон-альфа16 человека [11] и интерферон-гамма курицы [13], трансформировали плазмидой pPICZαA-AOX1PDI. Гены, кодирующие гетерологичные интерфероны, находятся под контролем промотора гена AOX1, штаммы были получены замещением хромосомного гена АОХ1 экспрессионной кассетой и имеют фенотип HIS+ MutS. Плазмиду pPICZαA-AOX1PDI также обрабатывали рестриктазой SacI, сайт расщепления которой находится в 5`-области промотора AOX1 (см. рис. 1). Интеграция в геном осуществлялась в промоторную область гена AOX1 без нарушения функции промотора и гена АОХ1. В итоге на некотором расстоянии работают два промотора гена AOX1, каждый из которых контролирует свой ген и имеет свою область терминации транскрипции.

Наличие в штаммах реципиентов нужных генетических конструкций и ориентацию встройки определяли при помощи ПЦР. Появление в культуральной жидкости целевого белка подтверждали электрофорезом культуральных жидкостей штаммов-продуцентов (рис. 2). ИФА-анализ исходных штаммов, подтверждающий наличие целевого белка, был проведен ранее [11, 13].

 

Рис. 2. Электрофореграмма белков культуральной среды штаммов-продуцентов со сверхэкспрессией гена PpPDI: M1, M2 — маркеры молекулярного веса белков; (K- ,1,2,3,4) — белковые компоненты из культуральной среды штаммов: [K-] — GS115, [1] —  GS-humIFNA16, [2] — GS-humIFNA16-AOX1PDI, [3] — GS-chkIFNG, [4] — GS-chkIFNG-AOX1PDI

 

Определение копийности гена PpPDI

При трансформации методом электропорации возможна множественная встройка вектора в геном дрожжей P. pastoris [44]. Количество копий генов определяли методом относительной количественной оценки при помощи РТ-ПЦР, в частности ΔCt-методом c применением референсного гена [2]. В качестве контрольных были взяты исходный штамм GS115 и штамм GS-HIS. РТ-ПЦР осуществляли в трех параллельных повторностях. Данные РТ-ПЦР представлены на рис. 3. Значения относительного количества гена PpPDI в исходном штамме и штаммах-реципиентах обрабатывали при помощи критерия Манна – Уитни [6]. Полученные значения находятся в зоне значимости.

 

Рис. 3. Определение копийности гена PpPDI в полученных штаммах: штаммы: [1] — GS115, [2] — GS-humIFNA16-AOX1PDI, [3] — GS-chkIFNG-AOX1PDI, [4] — GS-HIS, [5] — GS-AOX1PDI

 

Скорость роста штаммов со сверхэкспрессией гена PpPDI

Для оценки влияния сверхэкспрессии гена PpPDI на скорость роста контрольный штамм GS-HIS и штамм GS-AOX1PDI выращивали на жидких средах Mm в условиях индукции промотора гена AOX1. Культивировали в двух параллельных экспериментах. Удельную скорость роста культуры рассчитывали по формуле

µ = (lnX1–lnX0)//(T1 –T0),

где X1 и X0 — значения биомассы, соответствующие времени роста T1 и T0 [1]. Данные скорости роста изучаемых штаммов, приведенные на рис. 4, показывают замедленный рост клеток со сверхэкспрессией гена PpPDI.

 

Рис. 4. Влияние сверхэкспрессии гена PpPDI на скорость роста клеток

 

Влияние сверхэкспрессии гена PpPDI на устойчивость штаммов к восстанавливающим агентам

Исходя из данных, что мутанты pdi бактерий чувствительны к восстанавливающему агенту дитиотрейтолу (DTT), в учебном пособии Мюльберга [8] было высказано предположение, что сверхэкспрессия PpPDI будет придавать устойчивость к восстановителям — DTT и β-меркаптоэтанолу. Данных о влиянии этих соединений на P. pastoris нет. У близких к P. pastoris дрожжей Pichia methanolica добавление в среду 2–3 мМ β-меркаптоэтанола приводило к 50 % ингибированию роста вне зависимости от источника углерода [4]. Дрожжи S. cerevisiae дикого типа растут при 32 мМ концентрации DTT в среде, хотя такая концентрация препятствует росту чувствительных к DTT мутантов hac1 [35].

Мы показали, что при 8 мM DTT и 0,01 мM β-меркаптоэтанола характер роста у исходного штамма и штамма со сверхэкспрессией гена PpPDI не отличался. Повышение концентрации DTT до 16 мM и β-меркаптоэтанола до 2 мM приводило к гибели клеток обоих штаммов.

Сравнение одностадийного и двухстадийного культивирования

В качестве несомненного плюса дрожжей P. Pastoris, как системы для продукции гетерологичных белков, указывается возможность их роста до высокой густоты клеточной суспензии, что увеличивает возможный выход белка. Мы провели культивирование при разных условиях: двухстадийное, искусственно обеспечивающее высокую плотность клеток в среде, и одностадийное, при росте до естественной плотности клеточной суспензии. При одностадийном культивировании плотность биомассы достигала 10 г/л, при двухстадийном — 73 г/л после 48 часов индукции.

Выход белка в исходных штаммах-продуцентах при одностадийном культивировании составил 3,4 ± 1,2 мг/л среды IFNα16-hum и 2,1 ± 0,7 мг/л IFNγ-chk, при двухстадийном — 6,0 ± 1,3 мг/л IFNα16-hum и 6,9 ± 1,5 мг/л IFNγ-chk. При двухстадийном культивировании целевого белка в культуральной жидкости оказалось больше на 76 % для IFNα16-hum и на 228 % для IFNγ-chk.

Средняя продуктивность клеток (количество белка, отнесенное к клеточной массе, мкг/мг) при одностадийной индукции составила 0,37 ± 0,14 мкг/мг для IFNα16-hum и 0,22 ± 0,08 мкг/мг для IFNγ-chk. При двухстадийной индукции продуктивность составила 0,07 ± 0,03 мкг/мг для IFNα16-hum и 0,10 ± 0,02 мкг/мг для IFNγ-chk. Видимо, несмотря на снижение продуктивности клеток, при двухстадийной индукции выход белка увеличивается, что обусловлено большей биомассой.

Влияние сверхэкспрессии гена PpPDI на продукцию гетерологичных белков

Сверхэкспрессия гена PpPDI при одностадийной схеме культивирования привела к увеличению продукции обоих целевых белков: на 30 ± 10 % для IFNα16-hum и на 30 ± 4 % для IFNγ-chk. При двухстадийном культивировании увеличилась продукция только IFNα16-hum — на 19 ± 3 %, а для IFNγ-chk такого влияния не наблюдалось.

Мы столкнулись с тем, что в культуральной жидкости при росте штаммов-продуцентов как IFNα16-hum, так и IFNγ-chk при сверхэкспрессии гена PpPDI появляется большое количество растворимого белка с молекулярной массой около 50 кДА, не присутствующего в культуральных средах контрольных штаммов (см. рис. 2).

Для того чтобы выяснить, не является ли этот белок производным целевых белков, мы провели ИФА культуральной жидкости штамма GS-humIFNA16 с антителами к IFNalfa16-hum. Данные ИФА на рис. 5 свидетельствуют, что белок массой 50 кДА не имеет отношения к IFNalfa16-hum. Определение природы белка, секретируемого в культуральную среду дрожжами при сверх экспрессии гена PpPDI, — дело дальнейших экспериментов. Тонкая полоса в районе 40 кДА на рис. 5 может объясняться наличием в пробе IFNalfa16-hum в виде димера, так как интерфероны альфа-типа способны образовывать нековалентно связанные димеры [34].

 

Рис. 5. Иммуноблотинг белков культуральных сред: [M] — маркер молекулярной массы белков. Культуральные жидкости штаммов: [K-] — GS-aox1 при одностадийном культивировании, [1] — GS-humIFNA16 при одностадийном и [2] — при двухстадийном культивировании

 

 

Обсуждение

Уровень продукции секреторного белка не только зависит от уровня транскрипции соответствующего гена и трансляции, но и определяется эффективностью работы всего секреторного аппарата клетки дрожжей. Сворачивание (фолдинг) секреторных белков в ЭР является ключевым этапом в ходе синтеза как собственных, так и гетерологичных белков в клетке и происходит при участии молекулярных шаперонов, в частности Pdi-фермента, катализирующего образование дисульфидных связей. Эксперименты, проведенные нами, позволяют оценить влияние сверхпродукции Pdi в дрожжевой клетке на продукцию гетерологичных интерферонов — IFNα16-hum и IFNγ-chk.

Данные РТ-ПЦР говорят о встройке не более одной дополнительной копии гена. Даже одна дополнительная копия гена под контролем сильного промотора оказывает эффект на скорость роста штамма и продукцию гетерологичных белков. Полученное дробное количество копий гена PpPDI можно объяснить анеуплоидией исследуемого штамма по четвертой хромосоме, где и находится ген PpPDI, а так как референсный ген находится в третьей хромосоме, то он в данном случае не теряет своих референсных свойств.

Полученные штаммы со сверхэкспрессией гена PpPDI жизнеспособны и могут быть использованы в дальнейших исследованиях. Наблюдаемое замедление скорости роста в логарифмической фазе согласуется с данными, полученными для дрожжей S. cerevisiae, в которых сверхэкспрессия гена PDI приводит к такому же эффекту [35]. Как уже было сказано, Pdi — мультифункциональный белок и может действовать в клетке и как фермент, и как шаперон. Есть данные, что Pdi в условиях теплового стресса может брать на себя часть функций шаперона ЭР — калнексина [43]. Полученные данные позволяют предположить, что повышенная продукция Pdi оказывает влияние на различные внутриклеточные процессы. Замедленный рост можно объяснить тем, что сверхэкспрессия гена PpPDI под сильными промотором гена AOX1, работающим в дополнение к нативной копии AOX1, приводит к перегрузке аппарата трансляции.

Учитывая функцию Pdi в окислительном фолдинге белка, можно было ожидать, что устойчивость штаммов, содержащих лишнюю копию гена PpPDI, к восстанавливающим агентам повысится. Это бы открыло возможность для создания нового вектора для трансформации дрожжей, содержащего дополнительную копию гена PpPDI в качестве маркера устойчивости. Однако повышенная устойчивость к DTT или β-меркаптоэтанолу штаммов со сверхэкспрессией гена PpPDI обнаружена не была. Более того, в сравнении с другими видами дрожжей исходные штаммы P. pastoris проявляли меньшую устойчивость к исследуемым веществам. Исходя из данных, что Pdi действует координированно с белком Ero1p, который является донором окисляющих эквивалентов [8], можно предположить, что только совместное повышение экспрессии генов PpPDI и PpERO1 способно повысить устойчивость клетки к восстанавливающим агентам.

Выход белка при двухстадийном культивировании оказался выше по сравнению с одностадийным, но наблюдалось падение продуктивности клеток. Возможно, на выход целевого белка негативно влияла высокая густота клеточной суспензии в начале стадии индукции. Нахождение оптимальных условий культивирования штаммов-продуцентов может быть важным фактором повышения выхода рекомбинантных белков.

Несмотря на замедление роста штаммов со сверх экспрессией гена PpPDI, продукция целевого белка в случае одностадийного культивирования возрастала для обоих целевых белков. При двухстадийном культивировании положительный эффект наблюдался только для IFNalfa16-hum. Можно сделать вывод, что эффект сверхэкспрессии генов-помощников может зависеть от метода культивирования и конкретного гетерологичного белка.

В нашей работе наибольшее положительное влияние сверхэкспрессии гена PpPDI наблюдали для IFNalfa16-hum, содержащего дисульфидные связи, что предсказуемо, исходя из основной функции Pdi. Тем не менее данные о повышении продукции разных модельных белков, отличающихся по строению, наличию дисульфидных связей, углеводного компонента, можно рассматривать как еще одно доказательство того, что помимо непосредственной функции фермента, контролирующего образование дисульфидных связей, Pdi является также шапероном и может неспецифично повышать продукцию секретируемых гетерологичных белков. Использование штаммов со сверхэкспрессией гена PpPDI в сочетании с оптимизацией культивирования можно рассматривать как способ повышения эффективности производства интерферонов IFNalfa16-hum и IFNγ-chk. Исходя из механизмов окислительного фолдинга, включающего слаженную работу Pdi с Ero1p [8], было бы логично ожидать положительного синергичного эффекта при одновременной сверхэкспрессии генов PpPDI и PpERO1 на выход рекомбинантных белков.

Благодарности

Авторы выражают благодарность А.М. Румянцеву и A.E. Зобниной (СПбГУ, лаборатория биохимической генетики) за методическую помощь.

Работа поддержана грантами: СПбГУ 1.38.229.2014, НШ 9513.2016.4.

About the authors

Mikhail A Tsygankov

St Petersburg State University

Author for correspondence.
Email: mial.tsygankov@yandex.ru

engineer-researcher, Laboratory of biochemical genetics, Department of Genetics and Biotechnology

Russian Federation, Saint Petersburg, Russia

Marina V Padkina

St Petersburg State University

Email: mpadkina@mail.ru

PhD, leading researcher, Department of Genetics and Biotechnology

Russian Federation, Saint Petersburg, Russia

References

Supplementary files