Influence of oil pollution on the microbiocenosis of soils adjacent to the oil storage

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Увеличение объемов добычи и транспортировки нефти во второй половине XX в. и, как следствие, учащение аварийных ситуаций привели к появлению обширных нефтезагрязненных территорий. Особую опасность представляют автозаправочные комплексы с их нефтехранилищами и непосредственно нефтехранилища, которые окружают города с развитой промышленностью. Для таких предприятий характерны микроразливы нефти и нефтепродуктов. И хотя единовременно в окружающую среду попадает небольшое количество поллютантов, эти микроразливы осуществляются регулярно в течение многих лет [1] и загрязняют среду обитания человека в широких масштабах благодаря подвижности как сырой нефти, так и различных видов топлива.

Для оценки экологических последствий нефтезагрязнений активно изучается почвенная микрофлора, являющаяся чувствительным биоиндикатором изменений окружающей среды. Так как разложение нефти в почве в основном происходит в результате деятельности углеводородокисляющих микроорганизмов, оценка состояния микробоценоза необходима для прогнозирования способности почвы к самовосстановлению и разработки способов ее очистки.

Было установлено, что изменения свойств почвы, происходящие под действием нефти и нефтепродуктов, неизбежно влияют на почвенную микрофлору. Специфика изменений микробиоценоза зависит от концентрации, качественного состава углеводородов [2–4], климатических факторов и особенностей самой почвы. Различные группы микроорганизмов обладают разной устойчивостью к загрязнению [5]. Показано, что происходит изменение таксономического состава микробиоценоза и соотношения функциональных групп. Низкий уровень загрязнения (0,5–1 %) может оказывать на сообщество стимулирующее воздействие за счет активного размножения углеводородокисляющих микроорганизмов [3].

Для изучения изменений в состоянии почвенной микрофлоры под действием нефти актуальны прямые микробиологические методы, а также молекулярные методы, не связанные с культивированием, в частности метод высокопроизводительного секвенирования ампликонных библиотек гена 16SрРНК, снимающие ряд ограничений, присущих классическим микробиологическим методам, например идентификации некультивируемых микроорганизмов. Такие методические подходы позволяют детально выявить специфику реакции микробиоценоза на нефтезагрязнение в разных типах почв и прогнозировать процессы самоочищения в конкретных почвенно-климатических условиях.

Целью данной работы являлось изучение действия углеводородов на бактериальный и грибной ценозы дерново-подзолистой почвы при разливах нефти вблизи нефтехранилища в Ленинградской области.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Отбор образцов. Для проведения исследования был выбран участок площадью 800 м², непосредственно примыкающий к воротам нефтехранилища в поселке Малые Колпаны, Ленинградская область.

Рельеф обследованной территории имеет незначительный уклон от ворот к лесу. На участке обнаружены неглубокие ложбины, в которых скапливается нефть, вероятно текущая из-под ворот нефтехранилища. По визуальной оценке, разливы происходили в разное время. Вся территория засыпана слоем песка толщиной 5–10 см.

Образцы грунта отбирали в трех точках:

1. на расстоянии 5,1 м перпендикулярно от забора нефтехранилища из свежего нефтяного разлива;
2. на расстоянии 10,8 м от первой точки отбора из старого нефтяного разлива;
3. контрольный образец — на расстоянии 19,4 м перпендикулярно от забора нефтехранилища.

В каждой точке отбирали средний образец, для чего в разливах в 10 местах взяли пробы грунта с глубины 5–10 см. В контрольной точке 10 проб отобрали с площади, соответствующей размеру нефтяных разливов.

В образцах грунта содержание нефти определяли методом экстракции четыреххлористым углеродом c последующим определением ее количества в процентах от массы почвы на приборе АН-2 [6].

Выделение ДНК из образцов грунта. Для анализа таксономического состава и структуры бактериоценоза методом высокопроизводительного секвенирования после отбора проб образцы грунта были заморожены в камере при температуре –80°. Выделение ДНК проводили с использованием наборов MoBio Power Soil (MoBio, США) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Для выделения брали навеску почвы 0,2 г, а полученную ДНК элюировали в 100 мкл воды.

Для контроля выделения проводили электрофорез экстракта в 1 % агарозе (буфер 0,5 × ТАЕ), для чего в гель вносили 1, 2, 5 и 10 мкл экстракта. Применяли гель, содержащий заранее добавленный бромистый этидий (0,5 мкг/мл) [7].

При конструировании и секвенировании ампликонных библиотек очищенный препарат ДНК (по 10–15 нг) использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР (температурный профиль: 95 °C — 30 с, 50 °C — 30 с, 72 °C — 30 с; всего 30 циклов) с добавлением полимеразы Encyclo («Евроген», Россия) и универсальных праймеров к вариабельному участку V4 гена 16SрРНК — F515 (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA) и R806 (GGACT-ACVSGGGTATCTAAT) [8]. Секвенирование библиотек осуществляли на приборе GS Junior компании Roshe методом пиросеквенирования. Таксономический анализ библиотек проводили с использованием пакета QIIME [9]. Результатом таксономического анализа была таблица ОТЕ (операционных таксономических единиц), в которой для каждой ОТЕ приведена ее доля в библиотеке.

Для оценки состояния бактериоценоза на основании данных, полученных методом ПЦР, рассчитывали индекс общего разнообразия Шеннона () по следующей формуле:

где n — оценка «значимости» каждого рода; N — общая «значимость» родов.

Индекс Шеннона дает характеристику стабильности микробного сообщества. Чем выше этот индекс, тем стабильнее сообщество.

Индекс Симпсона (С) рассчитывался по следующей формуле:

где n — число особей каждого вида, N — общее число особей.

Индекс Симпсона показывает концентрацию доминирования и общее видовое богатство сообщества [10].

Оценка состояния грибного ценоза. Определение длины грибного мицелия и численности спор осуществляли прямым методом Демкиной – Мирчинк [23]. Для этого к 10 г свежего грунта приливали 100 мл 0,1 % пирофосфата натрия и встряхивали на ротаторе 30 мин. Отбирали 30 мл вытяжки и добавляли к ней 30 мл 9 % лактозы. Предварительно мембранные фильтры «Милипор» с размером пор 0,2 мкм окрашивали 0,1 % спиртовым раствором анилинового синего и помещали на фарфоровую воронку, подсоединенную к водоструйному насосу. Из вытяжки с лактозой отбирали 2 мл, переносили на фильтр и ожидали, пока с его поверхности уйдет вся жидкость. Фильтр с осадком помещали на фильтровальную бумагу, пропитанную спиртовым раствором акридина оранжевого (60 % спирт, соотношение спирт : акридин = 2500 : 1), и выдерживали 15 мин во влажной камере. Фильтры во влажном состоянии просматривали под люминесцентным микроскопом при увеличении × 200 и × 400. Анализировали 20–80 полей зрения на вариант. Для этого делали фотографии полей зрения, на которых измеряли длину грибного мицелия и подсчитывали количество спор.

Частоту встречаемости мицелия рассчитывали по следующей формуле:

где a — количество просмотренных полей зрения; А — количество полей зрения с мицелием.

Статистический анализ. Математическую обработку проводили в SPSS-Statistics и Microsoft Excel. Результаты анализа таксономического состава бактерий обрабатывали с помощью кластерного и факторного анализов, проведенных в среде R (R Core Development Team, 2014; внутренние пакеты ggplot2, ggrepel, dplyr). Длины мицелия в образцах грунта сравнивали по критерию Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика образцов грунта. В лесу, примыкающем к дальней от ворот границе обследованного участка, был сделан почвенный разрез глубиной 1,5 м. Визуальное обследование почвенных горизонтов позволило идентифицировать почву как тяжелосуглинистую дерново-подзолистую.

Непосредственно в точках взятия образцов и по краю участка делали прикопки на глубину 30 см. Было обнаружено, что под слоем песка находятся ненарушенные почвенные горизонты. Так как отобранные для исследования образцы представляют собой смесь песка и верхнего почвенного горизонта, представляется целесообразным назвать их грунтом, в котором присутствует почвенная микрофлора дерново-подзолистой почвы.

Также было установлено, что на территории, примыкающей к нефтехранилищу, имеет место латеральный разлив нефти — по почвенному профилю углеводороды не распространялись. Анализ показал, что в точке № 1 содержание нефти составляло 5,8 %, в точке № 2 — 2,2 %, в контроле — следы углеводородов.

Агрохимический анализ показал, что отобранные образцы грунта характеризуются рН, близким к нейтральному, низким содержанием общего азота, нитратов и калия, средним содержанием аммония и высоким содержанием фосфора. Наиболее высокое количество общего азота, его подвижных форм и фосфора отмечено в образцах с 6 % нефти (табл. 1).

Количество углерода и соотношение С : N возрастали в вариантах с нефтью в прямо пропорциональной зависимости от дозы поллютанта.

 

Таблица 1. Агрохимическая характеристика образцов
Agrochemical characteristics of the samples

Образец	Собщ, %	Nобщ, %	рНводн	N-NH4, мг/кг	N-NO3, мг/кг	Р2О5, мг/кг	К2О, мг/кг
Контроль	0,5 ± 0,181	0,016 ± 0,0064	6,5 ± 0,17	27,0 ± 2,25	5,05 ± 0,37	241,0 ± 10,33	6,3 ± 0,21
2 % нефти	1,6 ± 0,152	0,018 ± 0,001	6,1 ± 0,001	25,0 ± 2,86	6,05 ± 0,76	163,0 ± 28,6	3,4 ± 0,27
6 % нефти	3,4 ± 0,22	0,021 ± 0,0017	6,1 ± 0,065	32,0 ± 4,58	10,55 ± 1,25	294,0 ± 21,24	3,4 ± 0,27

 

Влияние нефтезагрязнения на состояние бактериального ценоза. Исследования, проведенные методом высокопроизводительного секвенирования, показали, что нефтезагрязнение влияло на широту разнообразия комплекса почвенных бактерий, таксономический состав и структуру бактериоценозов.

Структура бактериоценоза на уровне филотипов позволила охарактеризовать процессы, происходящие в нефтезагрязненных образцах (рис. 1). Так, в контроле доминировали филотипы Acidobacteria, Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria, Alphaproteobacteria и Actinobacteria. Это филотипы, которые почти всегда доминируют как в загрязненных, так и в не загрязненных нефтью почвах [11]. В контроле долевое участие этих филотипов было примерно одинаковым.

 

Рис. 1. Таксономическая структура бактериоценоза на уровне филотипов и родов

 

В образце с 6 % нефти резко возросла доля Gammaproteobacteria. Среди этого филотипа известно большое количество нефтедеструкторов, имеющих высокую устойчивостью к углеводородам нефти. Доминирование Gammaproteobacteria указывает на то, что в разливе проходит начальная стадия разложения нефти [12].

В образце с 2 % нефти сократилась доля Gammaproteobacteria, но возросла доля Actinobacteria. По мнению некоторых исследователей, именно Actinobacteria осуществляют анаэробную деградацию циклических и ароматических углеводородов на более поздних стадиях биодеградации нефти [13, 14].

Таким образом, можно предположить, что в исследуемых образцах грунта процесс деградации нефти находился на разных стадиях: в образце с 6 % нефти — на начальной стадии, с 2 % нефти — на поздней стадии.

Анализ изменений в бактериоценозе на уровне рода подтверждает высказанное предположение. Так, максимальное количество родов прокариот (94) обнаружено в образце с 2 % нефти, где процесс деградации поллютанта находится на поздней стадии, когда из грунта уже удалены наиболее токсичные компоненты. В этой ситуации расширение разнообразия связано, с одной стороны, с бактериями-нефтедеструкторами, которые способны использовать углеводороды в качестве источника углерода, а с другой — с гетеротрофной микрофлорой, неспособной к нефтедеструкции, но устойчивой к низкой дозе циклических углеводородов [3, 15].

Напротив, в образце с 6 % нефти разнообразие сужается до 55 родов как по сравнению с контролем, где количество родов составляет 84, так и с бактериоценозом, сформировавшемся при 2 % уровне загрязнения. По-видимому, такой уровень нефтезагрязнения токсичен для почвенных прокариот, включая нефтедеструкторы. Многие исследователи отмечают, что превышение 5 % уровня содержания нефти приводит к ингибированию всей почвенной микрофлоры [3, 16].

Таксономический состав на уровне рода позволил охарактеризовать специфические изменения бактериальной микрофлоры дерново-подзолистой почвы при нефтезагрязнении (табл. 2). Так, в контроле доминировали роды Arenimonas и Novosphingobium, среди которых неизвестны или малочисленны виды-нефтедеструкторы, а также роды Sphingomonas и Mycobacterium, в которых такие виды присутствуют. При рассмотрении доминант нефтезагрязненных образцов обращает на себя внимание тот факт, что наряду с наличием родов Pseudomonas, Nocardioides, Arthrobater, Mycobacterium, Sphingomonas, виды которых являются активными нефтедеструкторами в разных типах почв [18–20], в грунте преобладали представители рода Pseudoxanthomonas. Известно, что виды рода Pseudoxanthomonas разлагают в естественных условиях разные сорта нефти, дизельное топливо и другие нефтепродукты [20, 21]. Вероятно, бактерии этого рода оказались наиболее приспособленными к почвенно-климатическим условиям территории, прилегающей к нефтехранилищу.

 

Таблица 2. Доля (%) доминирующих родов бактерий в образцах почвы по данным высокопроизводительного секвенирования библиотек гена 16SрРНК
Proportion (%) of major bacterial genera in soil samples accordingly to sequencing 16S rRNA libraries

Филотип	Род	Процент ДНК в пробах
		6 % нефти	2 % нефти	Контроль
Acidobacteria	Blastocatella	0	< 1	2,1
	Segetibacter	0	2,6	< 1
Actinobacteria	Blastococcus	0	6,3	0
	Conexibacter	0	3,2	1,4
	Mycobacterium	< 1	6,5	4,5
	Nocardioides	< 1	49,2	1,4
	Rhodococcus	0	2,3	0
	Williamsia	0	2,3	0
Alphaproteobacteria	Altererythrobacter	< 1	1,4	< 1
	Brevundimonas	< 1	5,4	< 1
	Caulobacter	< 1	1,8	0
	Ferruginibacter	0	0	2,1
	Methylobacterium	12,7	1,6	0
	Novosphingobium	< 1	1	5,6
	Roseomonas	< 1	2,5	0
	Skermanella	0	1,6	0
	Sphingobium	< 1	4,7	0
	Sphingomonas	1,8	3,7	7,5
	Sphingorhabdus	0	1	1,9
	Xanthobacter	< 1	1,4	0
Bacteroidetes	Ohtaekwangia	0	1,6	0
Betaproteobacteria	Acidovorax	0	0	1,9
	Polaromonas	4,4	1,6	2,6
Gammaproteobacteria	Alkanindiges	0	2,3	0
	Arenimonas	0	< 1	9,4
	Arthrobacter	< 1	2,8	3,1
	Aquicella	0	0	1,4
	Pseudomonas	1,2	12,7	< 1
	Pseudoxanthomonas	61	0	0
Gemmatimonadetes	Gemmatimonas	0	0	1,4
Nitrospira	Nitrospira	0	0	1,4
Sphingobacteria	Dyadobacter	0	2,1	< 1
	Sediminibacterium	1,3	< 1	0

 

Дендрограмма, полученная в результате кластерного анализа родов бактерий, показала, что таксономический состав бактериоценоза в образце с 2 % нефти сходен с таковым в контроле (рис. 2, a). Это еще одно свидетельство завершающей стадии процесса самоочищения почвы, в результате которого условия в грунте с 2 % нефти приблизились к условиям в контроле без загрязнения. В образце с 6 % нефти сформировался ценоз, резко отличный по таксономическому составу как от контроля, так и от показателей в грунте с 2 % нефти. На фоне сужения разнообразия такой результат указывает на начальную стадию разложения углеводородов. Некоторые исследователи считают, что такая ситуация складывается в бактериоценозе в период с 7-го по 21-й день после загрязнения нефтью почвы [17].

 

Рис. 2. Кластерный (a) и факторный (b) анализ таксономического состава микробных сообществ почвенных образцов на уровне рода

 

С помощью факторного анализа установлено, что в контроле определяющим фактором были бактерии рода Arenimonas. Прокариоты рода Pseudoxanthomonas выступали определяющим фактором как в варианте с высоким, так и с низким уровнем нефтезагрязнения. Помимо представителей этого рода в образце с 2 % нефти определяющим фактором были бактерии рода Nocardioides, в образце с 6 % — рода Methylobacterium (рис. 2, b).

Таким образом, можно заключить, что в исследованной дерново-подзолистой почве активно идет процесс разложения нефти. По-видимому, наибольшее значение в процессе самоочищения почвы от углеводородов имеют виды-нефтедеструкторы, относящиеся к родам Pseudoxanthomonas, Methylobacterium и Nocardioides. На основании полученных результатов следует рекомендовать представителей этих родов для поиска микроорганизмов-нефтедеструкторов с целью создания биопрепаратов для очистки от нефти территорий в Ленинградской области.

Еще одной особенностью реакции бактериальной микрофлоры исследованного грунта на нефтезагрязнение является формирование наиболее сбалансированного и устойчивого ценоза в образце с 2 % нефти (рис. 3, a). По-видимому, это связано с низким содержанием углерода в дерново-подзолистой почве и в особенности в образцах грунта, которые представляют собой смесь песка и почвы (см. табл. 1). В таких условиях углеводороды нефти, из которых уже удалены наиболее токсичные низкомолекулярные компоненты, выступают дополнительным источником углерода и стимулируют развитие почвенной микрофлоры. Формируется устойчивый ценоз, в котором доминируют бактерии-нефтедеструкторы и широко представлены гетеротрофные микроорганизмы, не обладающие способностью к разложению углеводородов, но при этом способные перерабатывать продукты промежуточного окисления, которые часто бывают токсичными для нефтедеструкторов [22]. Индекс Симпсона (рис. 3, b) отражает последовательное возрастание степени доминирования отдельных групп бактерий в загрязненных образцах в зависимости от дозы нефти по сравнению с контролем, где, несмотря на присутствие в биоценозе родов, включающих в себя виды-нефтедеструкторы, их доминирование не выражено.

 

Рис. 3. Изменение индекса общего разнообразия Шеннона (a) и индекса доминирования Симпсона (b) под действием нефти

 

Влияние нефтезагрязнения на состояние грибного ценоза. Микоценоз исследованного грунта оказался более чувствительным к нефти, чем бактериальный. Если в контроле грибной мицелий присутствовал во всех полях зрения (табл. 3), то в образце с 2 % нефти его частота встречаемости снизилась более чем в 4 раза. В еще большей степени этот показатель уменьшился в образце с 6 % нефти.

 

Таблица 3. Влияние нефти на частоту встречаемости грибного мицелия
Influence of oil on the incidence of fungal mycelium

Вариант	Частота встречаемости, %
Контроль	100,0
2 % нефти	24,1
6 % нефти	12,5

 

Определение длины грибного мицелия показало его низкое количество как в контрольных, так и в загрязненных нефтью образцах, что связано с олиготрофными условиями в грунте.

При попадании нефти в почву длина грибного мицелия резко снизилась: в свежезагрязненном грунте с содержанием 6 % нефти этот показатель уменьшился в 50 раз по сравнению с контролем (рис. 4, а). На фоне снижения количества мицелия произошло увеличение количества спор почти в 10 раз. Сокращение длины мицелия, сопровождающееся увеличением количества спор, свидетельствует об изменении биоморфологической структуры микоценоза. Характер изменения указывает на крайне неблагоприятные для микромицетов условия в грунте на начальной стадии нефтезагрязнения высокой дозой поллютанта [23].

 

Рис. 4. Длина грибного мицелия (a) и количество грибных спор (b) в образцах, определенные прямым методом

 

По мере разложения нефти грибная микрофлора в грунте восстанавливалась, хотя заметно медленнее, чем бактериальная. Так, в образце с 2 % нефти возросло количество мицелия и снизилось количество спор, однако эти показатели были соответственно значительно ниже и выше, чем в контроле. По-видимому, среди микромицетов дерново-подзолистой почвы было мало видов, которые могут существовать в неблагоприятных условиях исследованного грунта и способны к окислению углеводородов. Кроме того, гетеротрофные виды, обитавшие в грунте, проявили высокую чувствительность к нефтезагрязнению и с трудом восстанавливались даже при снижении дозы поллютанта и испарении/разложении его наиболее токсичных компонентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наиболее распространенным способом устранения локальных разливов нефти на территориях нефтехранилищ и прилегающих к ним участках является засыпание загрязненной почвы песком. Со временем песок, перемешиваясь с верхним слоем почвы, образует грунт, который заселяют микроорганизмы, типичные для данных почвенно-климатических условий и способные существовать в неблагоприятных условиях грунта. От их таксономического состава, численности и активности деструкторов нефти зависит скорость процесса самоочищения почвы от углеводородов.

На основании проделанной работы можно заключить, что в Ленинградской области, где распространены дерново-подзолистые почвы, микробиологическое разложение нефти в грунтах, покрывающих разливы, осуществляют в основном прокариоты, что характерно для большинства нефтезагрязненных почв и субстратов. При этом в грунте формируется бактериоценоз, в котором доминантами выступают бактерии-нефтедеструкторы, относящиеся к родам Pseudoxanthomonas, Methylobacterium и Nocardioides, содержащим многочисленные виды нефтедеструкторов, окисляющих нефть и ее компоненты на разных стадиях разложения. Таксономический состав и высокая устойчивость бактериоценоза свидетельствуют об активном процессе самоочищения грунта, покрывающего разливы нефти. Особенность территории вблизи нефтехранилища в поселке Малые Колпаны заключается в том, что определяющим фактором в процессе самоочищения выступают виды бактерий-нефтедеструкторов из рода Pseudoxanthomonas. По-видимому, представители этого рода наиболее приспособлены к условиям грунта, неблагоприятным для большинства нефтедеструкторов, относящихся к другим родам прокариот. Остается открытым следующий вопрос: будут ли бактерии-нефтедеструкторы из рода Pseudoxanthomonas, в силу своих биологических особенностей, доминировать в грунтах, покрывающих разливы нефти в других регионах, или это частный случай, характерный для территории поселка Малые Колпаны?

Участие микоценоза в самоочищении исследованного грунта представляется минимальным. Грибная микрофлора слабо развивалась в олиготрофных условиях смеси песка с почвой и проявила высокую чувствительность к нефтезагрязнению. Биоморфологическая структура микоценоза как в контрольных, так и в загрязненных образцах свидетельствует о низкой адаптивности микромицетов дерново-подзолистой почвы к условиям грунта и возможном выпадении этой группы из числа педобионтов вблизи нефтехранилищ.

Работа поддержана грантом РНФ 14-26-00094П.

About the authors

Anna S. Zhuravleva

Saint Petersburg State University

Author for correspondence.
Email: yardgrave@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7204-9653

Master of Soil Sciences, Saint Petersburg State University; graduate student, engineer, Agrophysical Research Institute

Russian Federation, 7/9, Universitetskaya embankment, Saint-Petersburg, 199034

Natal'ya M. Labutova

Saint Petersburg State University

Email: labutovanm@gmail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5229-6104

Doctor of Biological Sciences, Saint Petersburg State University; All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology

Russian Federation, 7/9, Universitetskaya embankment, Saint-Petersburg, 199034

Evgeniy E. Andronov

Saint Petersburg State University

Email: eeandr@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5204-262X

head of laboratory, All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology; senior scientist, Saint Petersburg State University; leading scientist, V. Dokuchaev Soil Science Institute.

Russian Federation, 7/9, Universitetskaya embankment, Saint-Petersburg, 199034

References

Supplementary files