Plant flow cytometry: current problems, aspects of application and data analysis

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Проточная цитометрия как один из методов, связанный с изучением генетического аппарата клетки, наряду с методами определения первичных последовательностей нуклеиновых кислот и прямого подсчета хромосом, обеспечивает исследователей важной информацией о размере генома, предполагая точное определении количества ДНК в ядре путем измерения интенсивности флуоресценции ДНК, окрашенной специальными красителями. Содержание ДНК (2С-value или 2С) при этом выражается в единицах массы (обычно в пикограммах) или в виде числа пар нуклеотидов (1 пг = 0,978 x 109 пар нуклеотидов) [1]. Возможность исследования геномных перестроек, полиплоидии, гибридизации, и влияния различных факторов на структуру хроматина, делает метод проточной цитометрии незаменимым инструментом исследования геномов растений. Помимо этого, возможность быстрого получения результата, использование в качестве материала клеток из самых разных тканей и относительно низкие эксплуатационные расходы обеспечивают исследование большой выборкой (десятки и сотни образцов в день) и широтой географического охвата [2-6].

Развитие аппаратной части, применение сортеров и цитометрии изображений (ICM) позволяет исследовать содержание ДНК с высокой точностью не только в ядрах, но и в хлоропластах, спорах и пыльце растений, отдельных хромосомах и аквабионтах [7-10].

Возрастающий объем информации по размеру генома способствовал развитию баз данных. Хотя общей специализированной базы данных по всем группам организмов пока не создано, но в отношении растений, например, имеется обширная база данных Kew C-value database (cvalues.science.kew.org), в которой по состоянию на 2019 год содержалась информация о размере генома 12273 видов растений. В России разработана и поддерживается база данных размера генома растений Genome Altai Plants (genome.asu.ru), где размещены данные о размерах геномов хозяйственно-ценных, редких и эндемичных растений Алтая, подкреплённые цифровым изображением гербарного листа и сведениями о местах сбора. Помимо этого, опубликованы обширные работы по исследованию размеров генома тысяч видов растений как по отдельным группам, так и по флорам разных регионов в целом [11-15].

Попытки широкого обобщения данных, накопленных при сравнительном изучении содержания ДНК, выявили существенные различия в размере генома у самых разных групп организмов. Одновременно с этим были выявлены различия в оценках размера генома для одного и того же вида, получаемые с помощью разных методов, а также одним и тем же методом, но в разных лабораториях или для разных образцов, что может свидетельствовать о наличии определенных методологических проблем как у проточной цитометрии, так и денситометрии по Фельгену [16, 17].

Объем накопленных данных по размерам генома растений с использованием метода проточной цитометрии очень велик, и большое число работ посвящено методическим рекомендациям по работе с методом [18-25].

Богатство биохимического состава растительных клеток определило особые требования к процедуре подготовки материала к анализу, получаемым результатам и визуализации данных. Разрешающая способность метода проточной цитометрии такова, что при разнице в сопоставляемых значениях более 5 %, уже можно предполагать довольно крупные изменениях на уровне хромосом. По этой причине проблема, связанная с возможностью получения точных и воспроизводимых данных, остаётся актуальной.

Цель нашей работы – заострить внимание на необходимости критического отношения к своим и чужим данным прежде, чем делать вывод о вариабельности размеров генома. Кратко мы остановимся на описании некоторых особенностей геномов растений, которые могут помочь в интерпретации наблюдаемых различий при исследовании содержания ДНК, и рассмотрим некоторые методические аспекты, связанные с работой проточной цитометрии. В обзоре значения 2C в примерах и рисунках приведены в классических значениях по J. Doležel (калибровка по геному человека, 7,0 пг). Для иллюстраций все анализы проводили стандартным методом проточной цитометрии с окрашиванием йодидом пропидия (PI). Использовали одношаговый протокол с буферами LB01 и Tris-MgCl₂ [25, 26]. Анализ проводили на проточном цитометре Cytoflex (Beckman Coulter). Гистограммы обрабатывали в CytExpert (Beckman Coulter).

ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОМОВ РАСТЕНИЙ

Содержание ДНК на гаплоидный геном (величина С) является важной биологической характеристикой организма. В отличие от геномов других эукариот, для геномов растений, как правило, характерны большие колебания в количестве ДНК на ядро [27]. Заметные различия в размерах генома обнаружены во всех группах высших растений. Например, среди цветковых размер генома (1C) варьирует от 61 Мб у Genlisea tuberosa Rivadavia, Gonella & A.Fleischm. до примерно 150 Гб у Paris japonica (Franch. & Sav.) Franch. [28, 29]. Самый крупный геном (160 Гб) обнаружен у папоротника Tmesipteris oblanceolate Copel. [30].

Достижения пан-геномики показали, что геномы растений - высоко динамические системы. Значительная изменчивость размеров генома у растений может быть обусловлена несколькими причинами, среди которых ключевое значение имеет полиплоидия (кратное увеличение числа наборов хромосом). Многие современные виды растений представляют собой смешанные популяции диплоидных и полиплоидных особей [31-35].

Акты межвидовой гибридизации и полиплоидия дестабилизируют геном, вынуждают его встать на путь дисплоидии и вторичной диплоидизации и фракционирования, приводя к радикальной реорганизации [36-41]. Теория даунсайзинга генома полиплоидных растений, а именно потери части ДНК в процессе полиплоидизации, является одной из основных в эволюции растений [42]. Предполагается, что полиплоидия – один из механизмов адаптации и микроэволюции растений [43, 44].

В связи с распространением явления полиплоидии, в цитометрии растений различают размер моноплоидного генома (1Сх-value или 1Cx) – содержание ДНК одного нереплицированного моноплоидного генома с числом хромосом x, а также размер голоплоидного генома (1С или 1С-value) - cодержание ДНК одного нереплицированного голоплоидного генома с числом хромосом n [45].

Следует отметить, что наряду с увеличением числа хромосом в процессе эволюции растений также отмечены случаи их редукции за счет слияния теломер и инактивации одной из центромер [46]. Геномы растений также содержат большое количество дуплицированных генов [47]. Варьирование размера генома у растений c одинаковым числом хромосом в основном связано с количественными изменениями повторяющихся последовательностей ДНК, а также присутствием мобильных элементов, которые также являются неотъемлемой частью генома растений [48].

Содержание ДНК гибридов обычно занимает промежуточное положение между содержанием ДНК родителей, что особенно явно для видов с разной плоидностью, большими геномами и большой разницей в содержании ДНК [49, 50]. У видов с большим и средним размером хромосом можно выявлять миксо- и анеуплоидию, которая проявляется раздвоением пиков на гистограмме или небольшим отклонением в содержании ДНК [51-53].

Особое место занимает исследование явленияе эндополиплоидии –- состояния, при котором клетки содержат несколько копий генома из-за эндорепликации — процесса, при котором репликация ДНК не сопровождается делением клетки. Эндополиплоидия отсутствует у голосеменных растений (за исключением Ginkgo biloba L.), редко встречается у папоротникообразных [54, 55], и особенно широко распространена у семенных растений [56], а среди споровых растений у мохообразных.

При эндополиплоидии наблюдается наличие разных уровней плоидности ядер внутри одного организма (2C, 4C, 8С и т.д.). У растений существует три основных типа эндоредупликации: эндоцикл, или, собственно, эндополиплоидия, эндомитоз и частичная прогрессирующая эндорепликация (PPE) [57]. Степень эндополиплоидизации варьирует в пределах органов. Специализированные органы или другие части растения могут иметь разные уровни эндополиплоидии [58]. Предполагают, что биологическое значение эндополиплоидии состоит либо в усилении метаболической активности и регуляции генов, либо в необходимости поддержания определенного уровня содержания ДНК для обеспечения определенного функционального состояния некоторых клеток [59].

Предположения о роли эндополиплоидии как механизма компенсации путем увеличения генома и, соответственно, количества копий генов, их экспрессии и комбинации, отмечались и ранее для природных популяций [60, 61]. Эндополиплоидия часто наблюдается в ответ на повреждение и, может быть, одним из механизмов ответа на стресс. Явление эндополиплоидии отмечено в культуре клеток и тканей растений in vitro. Ранее было показано, что высокое содержание НУК повышает уровень эндополиплоидии в соматических эмбрионах, а введение экзогенной АБК индуцирует эндополиплоидию в корнях [62]. Кроме регуляторов роста, стимулирующих эндоредупликацию клеток, уровень эндополиплоидизации зависит от различных внешних и внутренних факторов таких, как свет, температура, химический состав сред.

В качестве источника внутривидовой изменчивости генотипа можно упомянуть возникновение у растений разделения полов, которое встречается с разной частотой в пределах разных групп растений [63]. Если среди голосеменных 65% видов являются двудомными [64], у покрытосеменных двудомность — сравнительно редкое явление, охватывающее лишь 5-6% всех видов. При этом гетероморфные половые хромосомы обнаружены только у 20 видов из 6 неродственных родов [65, 66]. Однако различия в содержании ДНК между мужскими и женскими растениями обычно невелики, и находятся на пределе разрешения традиционной проточной цитометрии (в пределах 3%) [67].

АНАЛИЗ ДАННЫХ И ОСОБЕННОСТИ ВИЗУАЛИЗАЦИИ РЕЗУЛЬТАТА

Поскольку исследования с применением методов проточной цитометрии растений основаны на регистрации интенсивности сигнала флуоресценции ДНК внутри ядер, для расчетов размера генома и валидации результатов используют гистограммы флуоресценции, бокового и прямого рассеяния (FSC, SSC) и точечные гистограммы или дот-плоты параметра флуоресценции на SSC или FSC (рис. 1). Точечные гистограммы позволяют выделять или исключать из анализа объекты со схожей флуоресценцией, но различной структурой, а также удалять из анализа события, связанные с разрушением ядер и различными артефактами [22-24].

Среди основных артефактов можно выделить всевозможные формы дебриса, цитозольные элементы, разрушенные и поврежденные ядра, насекомых, пыльцу и прочие структуры, размеры которых позволяют им на стадии пробоподготовки проходить через фильтр [9, 19]. Большое количество шумов характерно для высушенных образцов, что связано с повреждением ядер и разбросом в содержании ДНК отдельных ядер в связи с разрушением ДНК в процессе сушки. В большинстве случаев данные артефакты достаточно легко вычленить на точечных гистограммах, так как они хорошо отличаются по боковому рассеянию. Появление на гистограмме дополнительных пиков, не кратных по флуоресценции основным, может говорить о загрязнении насекомыми. Ядра насекомых вычленить сложнее, особенно если размеры геномов сопоставимы, так как они обладают схожими характеристиками рассеяния.

На стандартной гистограмме живых образцов обычно наблюдается два пика, пик 2С – ядра в стадии G0/G1 митоза, и второй пик с удвоенным содержанием ДНК на стадии митоза G2/M. Количество ядер пика G2/M может различаться в зависимости от возраста и количества делящихся клеток вплоть до его отсутствия или даже преобладания по количеству. Однако часто встречаются гистограммы с тремя и более пиками отличающиеся по флуоресценции друг от друга в два раза, которые характеризуют эндорепликацию или эндополиплоидию, что не является редкостью для растений. Пик 4С содержит как эндореплицированные ядра, так и ядра на стадии митоза G2/M, последующие пики только эндореплицированные ядра (рис. 2, а, б).

Выбор метода обработки импульса флуоресценции также влияет на точность результата. Импульс обладает характеристиками, обозначаемыми как «площадь» (общая флуоресценция, pulse-a), «высота» (интенсивность, pulse-h) и «ширина» (длительность сигнала, pulse-w), что относится к способу обработки импульса флуоресценции. Анализ можно проводить по всем трём характеристикам, однако конечные данные будут различаться. В случае использовании характеристики pulse-h теряется линейность и увеличивается коэффициент вариации. В связи с этим в проточной цитометрии растений для измерения содержания ДНК обычно используется площадь (pulse-a), поскольку данная характеристика представляет собой интегральную флуоресценцию каждого объекта (рис. 2, в, г). Например, ECD-a, PI-a, DAPI-a и т. д. [18, 19, 68].

Не стоит забывать о возможном появлении дублетов (двойных событий, агрегатов ядер) и их контроле. Исключение из анализа дублетов осуществляется с использованием точечных гистограмм флуоресценции по площади (pulse-a) на высоту (pulse-h). Для нормальной одиночной частицы (синглета) значения высоты и площади пика коррелируют строго линейно. Дублеты и прочие агрегаты будут иметь те же характеристики флуоресценции по площади, но ниже по высоте, тем самым внося ошибку в пик G2 стадии митоза, эндополиплоидные пики или могут сливаться с пиком стандарта.

В проточной цитометрии растений сигнал можно оценить как качественный и заслуживающий доверия, если соблюдены следующие рекомендации: для расчётов использовано не менее 1000 ядер для каждого пика; коэффициент вариации пиков (CV) меньше 3 % (допускается 5 % для сложных объектов или фиксированных образцов); отсутствуют перекрытия и слияния пиков, используемых для расчетов; размеры геномов образца и стандарта не должны отличаться друг от друга более чем в три раза; пики стандарта и образца должны быть сопоставимы по высоте (количеству ядер) [18-25].

Для расчета среднего значения 2C для вида, стандартного отклонения и CV достаточно трех-пяти измерений [18]. Более точный подход заключается в исследовании не менее трех растений в три разных дня (9 измерений) [20]. В популяционных исследованиях число измерений обычно колеблется от трех растений на популяцию до нескольких десятков или даже сотен растений. Вариации в содержании ДНК выше 3–5 %, при соблюдении всех рекомендаций, могут указывать на внутривидовой полиморфизм, изменение числа или структуры хромосом.

Данные рекомендации обусловлены требованиями исследований абсолютного содержания ДНК и размера генома и, по сути, призваны гарантировать, что такие оценки будут точными (т.е. отражать истинное содержание ДНК) и воспроизводимыми (т.е. иметь достаточно низкую дисперсию, чтобы обеспечить разрешение небольших различий в абсолютном содержании ДНК). Для многих приложений, использующих относительное содержание ДНК для определения плоидности, такие точные измерения размера генома излишне или, в лучшем случае, вторичны, и требуемый уровень разрешения может быть ниже, чем требуется для оценки размера генома. Однако, данные пороги не являются жесткими требованиями, возникли в результате обобщения множества методических работ, и не всегда применимы для сложных объектов. Так, на современных цитометрах, среднее пика практически не меняется при количестве событий более 500, но не стоит забывать, что исследовать нужно именно позитивные события, используя гейтирование и исключая шумы. Т. е. ядра схожие по характеристикам рассеяния и флуоресценции, формирующие так называемые популяции или облака на дот-плотах. Тогда как одним из ключевых показателей, действительно влияющих на результат, является коэффициент вариации пика.

МАТЕРИАЛ

Проточная цитометрия растений основана на измерении содержания ДНК в изолированных ядрах. Выделение ядер растений более трудоемкая процедура, чем аналогичная для животных клеток, что связано с наличием твердой клеточной стенки. В большинстве случаев, ядра выделяют комбинированными способами, механическим или энзиматическим разрушением клеточных стенок и обработкой эндоплазматической мембраны ферментами или детергентам для лизиса клеток.

Для анализа можно использовать все части растений (листья, стебли, корни, части цветка и семена), при этом требуется очень малое количество материала. Обычно в качестве материала используют живые молодые листья. Однако, в случае проблем, вызванных метаболитами, возможно использование других частей или органов растений [69], преимущественно черешков, почек, семян или проростков. В некоторых случаях улучшает качество гистограмм предварительное подвяливание образца, выдерживание в темноте при низких температурах. Может потребоваться оптимизация протокола выделения ядер, использование буферов различного состава, детергентов, ингибиторов полифенолов или центрифугирование и отмывка ядер (рис. 3, а, б, в).

Особое внимание следует уделить использованию в цитометрии растений фиксированных образцов (высушенных в силикагеле или гербарных), если нет возможности использовать живой материал из-за удаленности лаборатории или продолжительности экспедиции. Считается, что высушенный материал подходит для исследования плоидности и ориентировочного размера генома. Гистограммы высушенных образцов в большинстве случаев отличаются завышенными показателями CV пиков и большим количеством шумов. Значение содержания ДНК высушенного материала, как гербарного, так и в силикагеле, в большинстве случаев может быть завышено до 30% по сравнению с живыми [19] и постепенно снижается по мере хранения [70-72] (рис. 3, г, д, е). Эффект высушивания очень видоспецифичен и должен быть проверен на объекте исследования. Папоротники и многие споровые растения хорошо переносят высушивание. Например, ядра хорошо сохраняются в гербарных образцах рода Selaginella возрастом более 50 лет. Удалось даже выделить ядра из почти столетнего гербарного сбора [73]. У многих групп растений, используя высушенные образцы, с учетом отклонений, вызванных высушиванием и различий в содержании ДНК диплоидов практически невозможно различить по содержанию ДНК виды с плоидностью выше четырех.

Более существенные отклонения в содержании ДНК и CV пиков нами наблюдались при замораживании образцов или фиксации образцов в спирте и уксусном алкоголе. Фиксация в формалине с последующей отмывкой фиксатора также не приводит к полноценному восстановлению флуоресценции, что может говорить о химической фиксации как не подходящем способе хранения материала [24, 74]. Возможно замораживание уже выделенных ядер в глицерине, однако данный метод менее удобен в полевых условиях, и исключает использование внутренней стандартизации, а отклонения в значениях содержания ДНК мало изучены.

Хорошей альтернативой фиксированным и живым тканям для анализа содержания ДНК и плоидности растений являются семена, особенно в случае затруднений, связанных с метаболитами или невозможностью сохранить живые растения до начала эксперимента [75]. Предпочтительнее исследовать проростки, однако можно использовать и сами семена. Из-за различной структуры хроматина и большого количества РНК возможны небольшие отклонения в содержании ДНК [24, 76, 77].

Интерпретация результатов, получаемых с помощью метода проточной цитометрии при использовании в качестве материала семян, более сложная, чем в случае листьев. У покрытосеменных разные структуры в составе семян формируются вследствие разных биологических процессов и отличаются по уровням плоидности [78]. При интерпретации результата важно понимать не только плоидность различных структур семени (зародыш, запасающая ткань, семенная оболочка), но и их объем, что будет пропорционально интенсивности сигнала на гистограмме. Например, у растений семейства Зонтичные зародыш по размеру несопоставимо меньше эндосперма, и пик 2С на гистограмме, соответствующий зародышу, может практически не наблюдаться, тем самым можно принять пик 3С эндосперма за пик зародыша (рис. 4). В таких ситуациях нужно внимательно изучать точечные гистограммы и валидировать данные с использованием живых или высушенных образцов. В случае длительно хранящихся в не оптимальных условиях семян, сигнал маленького зародыш может быть обусловлен только разрушенными ядрами и не наблюдаться даже на точечных гистограммах [19]. Как и в случае с высушиванием, сохранность ядер в клетках семян может различаться в зависимости от семейства или рода. Так у представителей семейства зонтичные, ядра эндосперма более 100 лет [79, 80].

В контексте работ с биологическими коллекциями метод проточной цитометрии полезен при исследовании чистоты коллекций семян и видов растений в интродукции, и наоборот, проводить отбор новых форм, гибридов по уровню плоидности и отклонению в содержании ДНК. Анализируя состояние пиков и их соотношение, наличие разрушенных ядер и шумов в области зародыша или эндосперма, можно сделать выводы о качестве семян, причинах низкого процента прорастания и энергии прорастания (рис. 4, г, д). В качестве внешнего стандарта необходимо взять свежие семена того же вида с нормальными показателями прорастания. В сравнении со стандартом, можно сделать вывод о разрушенном или не сформированном зародыше, если пик зародыша очень низкий или имеет высокий коэффициент вариации. Те же выводы можно сделать и при отклонениях пика эндосперма, а также предположить о слабом развитии эндосперма. Подобные исследования полезны и в экспериментальных работах по влиянию физических или химических факторов на развитие семян, а также в банках семян и генетических коллекциях. В интродукции возможен полиморфизм семенного потомства в случае гибридизации или апомиксиса, на одном растении могут формироваться семена с различной плоидностью и гибриды (Рис. 4 в).

Другая проблема, связанная с материалом, состоит в наличие явления эндополиплоидии. У многих видов Brassicaceae, Orchidaceae и некоторых других семейств в разных частях и органах растения пик 2C может быть очень низким и трудно различим из-за шума, но ядра пика 2C можно наблюдать на точечных гистограммах. Пик 4C можно принять за пик 2C, что приведёт к ошибкам в интерпретации данных. Поэтому необходимо убедиться, что на гистограмме нет событий с флуоресценцией в два раза меньшей основного пика, в том числе оформленных популяций на дот-плотах. Также должен проводиться контроль дублетов. Прогрессивная частичная эндорепликация (PPE), которая, как и эндомитоз, характерна для растений семейства Orchidaceae, также осложняет интерпретацию данных содержания ДНК и плоидности. В PPE соотношение пиков может значительно отличаться от стандартных значений. Часто пик 2C отсутствует в листьях, а неравномерное соотношение между пиками, и отсутствие пика 2C может привести к ошибкам в измерениях и неправильной интерпретации содержания ДНК и плоидности. В связи с этим для орхидных необходимо исследовать органы, в которых присутствуют активные митотические деления, а именно почки и зоны роста, меристематические ткани, зародышевые мешки и прочие генеративные части, семена. Так как уровень PPE различается в разных органах, предполагается, что данный тип эндорепликации в большей степени ткане- и органоспецифичен [81-83].

Пробоподготовка

В основе метода проточной цитометрии лежит анализ индивидуальных частиц (ядер или клеток) по ряду параметров. Для работы метода требуется суспензия ядер, выделенных из клеток. Наличие буфера обеспечивает среду для поддержания ядер в тонусе и создает условия для проникновения красителя через оболочку ядра. Кроме солей, буферных агентов, детергентов и, собственно, интеркаллирующего красителя в состав буферов включают РНКазу, ингибиторы ДНКаз и полифенолов, а также стабилизаторы хроматина. В качестве стабилизаторов выступают катионы металлов и полиамины, например спермин в буфере LB01. В качестве ингибиторов полифенолов используют сорбенты и восстановители, такие как меркаптоэтанол, DTT, метабисульфит натрия и ПВП [19, 84, 85].

Существует два основных подхода в пробоподготовке - одношаговый и двухшаговый протоколы [20]. Отличие заключается в том, что в случае одношагового протокола выделение и окрашивание ядер производится в одном буфере, в случае с двухшаговым протоколом ядра выделяют в буфере для выделения, затем окрашивают, добавляя буфер для окрашивания. Чаще всего для одношагового протокола используют буферы Tris-MgCl₂, LB01, Galbraith и другие [86-88]. Двухшаговый протокол в большинстве случаев основан на буфере Otto I для выделения и Otto II для окрашивания [89].

Результаты, полученные с использованием буферов Otto, очень стабильны между измерениями, и отличаются низкими коэффициентами вариации пиков. Ключевым достоинством является возможность хранить ядра после выделения в буфере Отто I на льду или при комнатной температуре в течение нескольких часов, так как лимонная кислота, входящая в его состав, консервирует нуклеиновые кислоты, а pH не оптимальна для нуклеаз. Тем самым удобно подготовить большое количество образцов на первом этапе и хранить их до добавления буфера Отто II. Буферы Otto подходят для живого материала с низким уровнем метаболитов и РНК.

Результаты, получаемые при использовании разных буферов для одношагового протокола, сопоставимы между собой, тогда как сравнивая данные, полученные с использованием буферов Otto, могут наблюдаться незначительные отклонения. Что, по-видимому, связано с разрушением белок-нуклеиновых комплексов и плотно упакованных структур ДНК лимонной кислотой и освобождением дополнительных регионов ДНК для связывания с красителем [19, 90].

Кроме солей, буферных агентов, детергентов и, собственно, интеркаллирующего красителя в состав буферов включают РНКазу, ингибиторы ДНКаз и полифенолов, стабилизаторы хроматина. В качестве стабилизаторов выступают катионы металлов и полиамины, например спермин в буфере LB01. В качестве ингибиторов полифенолов используют сорбенты и восстановители, такие как меркаптоэтанол, DTT, метабисульфит натрия или ПВП. Однако наш опыт показал, что PVP лучше использовать в сочетании с метабисульфитом натрия, DTT или тиосульфатом натрия.

Образцы инкубируют обычно при комнатной температуре, 10-15 минут. Положение пика стабилизируется через пару минут. Также возможна инкубация на льду в течение 30 минут. Инкубация в течение 15 минут при 37–42 °C может быть полезна для сложных образцов с метаболитами, древесными видами растений, высоким содержанием РНК или плохими гистограммами с шумом и высоким CV.

Вторичные метаболиты такие как антоцианины, танины, каротиноиды и флавоноиды способны снижать флуоресценцию, связываясь с хроматином [91, 92]. В данной ситуации решением проблемы выступает только использование подхода внутренней стандартизации. Предполагают, что вторичные метаболиты либо влияют на связывание интеркаллятора, либо сами взаимодействуют с ДНК [93]. Осложняют анализ и полисахариды, снижая выход ядер и нарушая равномерность потока.

При высоком CV и большом количестве шумов стоит попробовать сменить буфер, использовать ингибиторы полифенолов, инкубировать на разных температурах, использовать другие органы, проростки или семена. Для снижения количества метаболитов полезно поставить растение на несколько дней в холодильник или слегка «подвялить».

В том случае если при смене буферов и дополнительных компонентов качество гистограмм не улучшается, необходимо использовать различные органы растений, семена или проростки. К сложным для исследования объектам можно причислить виды из семейств Rosacea, Boraginaceae, Violacea и некоторые другие.

Влияние РНКаз заметно на богатых РНК образцах, особенно в случае анализа молодых растений и семян. Добавление РНКаз значительно уменьшает коэффициенты вариации пика, но практически не влияет на соотношения пиков (рис. 5, a, б).

Влияние ДНКаз на конечный результат, на наш взгляд, несколько преувеличено. Действительно, выделенную ДНК ДНКазы разрушают довольно быстро, но в случае проточной цитометрии ДНК изолировано в ядре и связано в нуклеопротеидные комплексы. Наши эксперименты по добавлению экзогенных ДНКаз показали, что буферы для цитометрии не оптимальны для ДНКаз, ионы магния также не оказывают значительного влияния (рис. 5, в, г, д, е). Несколько ускоряют работу ДНКаз ионы кальция, а значительно увеличивает активность только ресуспендирование ядер в буфере для ДНКаз. В буферах для цитометрии наблюдается изменение флуоресценции только при высоких концентрациях ДНКазы после получасовой инкубации при комнатной температуре. На льду активность практически не проявляется. Интересен тот факт, что добавление ДНКаз приводит к общему увеличению флуоресценции без изменения соотношения пиков, в то время как снижение флуоресценции и увеличение коэффициента вариации пиков фиксируется только после достаточно длительной инкубации. Подобное увеличение флуресценции мы наблюдаем при использовании Otto буфера и высушенных образцов.

КРАСИТЕЛИ

Для окрашивания ДНК внутри ядер используют проникающие интеркаллирующие красители, которые взаимодействуют со всей молекулой ДНК или проявляют специфичность к участкам богатым основаниями А/Т или Г/Ц. Величина флюоресценции пропорциональна количеству ДНК, что позволяет, при сравнении с образцом с известным содержанием ДНК (например, стандартом), рассчитывать содержание ДНК исследуемого образца или оценивать ГЦ-состав. Количество красителей для окрашивания ядер велико [18]. Среди прочих можно упомянуть этидий бромид, митрамицин, хромомицин А3, оливомицин, а также перспективные красители серии Hoechst. Но самыми распространенными являются пропидий йодид, взаимодействующий со всей молекулой ДНК, и 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), проявляющий специфичность к участкам, богатым основаниями А/Т.

Для исследования ядер, окрашенных пропидий йодидом, используют цитометры, оснащенные зеленым (532 нм) или голубым (488 нм) лазером, и фильтром в красной области флуоресценции (обычно ECD 600-630 нм).

При использовании DAPI, а также красителей серии Hoechst, которые специфичны к участкам богатым аденином и тимином, в качестве источника возбуждения требуются УФ-диод или редкий УФ-лазер; более распространенный фиолетовый лазер (405 нм) позволяет получить только около 5% флуоресценции от максимума (Hoechst 34580 около 20%).

Исследования желательно проводить на оптимальном для красителя фильтре эмиссии. Для пропидий йодида обычно 600-630 нм. Анализ на фильтре FITC (525 нм) или PE (585 нм) приводят к повышению CV, изменению линейности и как следствие к ошибкам в результатах.

Используя красители, специфичные к ДНК или РНК, или красители, которые при связывании с ДНК или РНК флуоресцируют в разных спектрах (например, акридиновый оранжевый), можно исследовать соотношение и состав нуклеиновых кислот, а также их изменчивость в зависимости от условий эксперимента.

Различия в действии красителей позволяют проводить исследование АТ/GC-состава ДНК. Для этих целей берут стандартыс известным соотношением нуклеотидного состава. Обычно это те же стандарты, которые используют для исследования содержания ДНК [94]. Выделенный образец разделяют на две части и окрашивают DAPI, который связывается с АТ-богатыми участки ДНК, и пропидий йодидом. Далее рассчитывается DF фактор красителя (dye factor), который представляет собой соотношение индексов разницы между пиками при анализе с пропидий йодидом и DAPI [95, 96].

Для анализа плоидности классически используют окрашивание с DAPI, и в качестве стандарта выступает диплоидный образец. Полиплоидные образцы обладают кратно большей флуоресценцией. Однако уровень плоидности можно рассчитать и через сравнение содержания ДНК, тем самым окрашивание пропидий йодидом является более универсальным подходом.

Разнообразие способов взаимодействия красителей с ДНК также оказывает влияние на получаемые значения в определении размера генома. Не стоит путать термины «абсолютное содержание ДНК» и «относительное содержание ДНК». Относительное содержание ДНК применяется к данным, полученным при окрашивании образцов с помощью DAPI и другими красителями, специфичными к АТ/GC-составу, и будет близким к абсолютному только при тщательном подборе стандарта со схожими с образцом показателями АТ/GC. На данный момент такой подход почти не применяется, т.к. в большинстве случаев исследования содержания ДНК проводят с пропидий йодидом.

Также следует иметь в виду, что с точки зрения химии поведение интеркаллирующих красителей при связывании с ДНК исследовано мало, а настоящими интеркалляторами являются пропидий йодид и этидий бромид. Механизмы связывания с ДНК остальных, особенно цианиновых красителей, изучены мало, и здесь возможны бис-интеркалляция или связывание с бороздками ДНК [97]. Появление УФ-лазеров позволило изучить различия в связывании специфичных к основаниям красителей. Например, ранее было показано различие в данных по содержанию ДНК, полученных при использовании лампы и лазера, для митрамицина [16]. Мало изучено поведение флуоресценции в зависимости от структуры хроматина и белок-нуклеиновых комплексов. Например, удаление гистонов соляной кислотой приводит к двукратному усилению флуоресценции DAPI [90].

вопросы стандартизации

Понятие "стандарт" является ключевым в определении содержания ДНК у растений и других организмов. Стандарт в цитометрии растений — это организм (вид или даже конкретный сорт) с известным содержанием ДНК или плоидностью. Именно путем сопоставления интенсивности флуоресценции ядер образца и стандарта становится возможным определение размера генома исследуемого объекта [52]. При этом в зависимости от решаемых задач возможна реализация нескольких подходов к стандартизации [98], каждый из которых имеет достоинства и недостатки, влияющие на конечный результат.

Внутренняя стандартизация, когда образец и стандарт измельчаются совместно и исследуются в одной пробирке, является наиболее распространенной и предпочтительной, поскольку исключает погрешности, связанные с влиянием метаболитов клетки, так как соединения, содержащиеся в стандарте и образце, с одинаковой степенью влияют друг на друга.

В случае внешней стандартизации образец и стандарт измельчаются и исследуются по-отдельности, измерение проводят без изменения настроек цитометра, в первую очередь усиления на датчике флуоресценции (ФЭУ или фотодиода). Данный подход используется для быстрого скрининга плоидности, подбора стандартов и измерения ориентировочного содержания ДНК. Положение пика стандарта на гистограмме в данном случае нужно постоянно перепроверять (каждые 5-10 измерений) и заново исследовать стандарт, в случае изменения усиления на датчике. Не кратные отклонения, и сомнительные результаты требуют проверки с использованием внутренней стандартизации.

Псевдо-внутренняя стандартизация подразумевает подготовку образца и стандарта к анализу по-отдельности с последующим объединением их в одной пробирке перед проведением процедуры анализа. Данный подход вмещает в себя все минусы внешней стандартизации, однако позволяет изменять настройки цитометра. Внешняя и псевдо-внутренняя стандартизации требуют тщательного контроля влияния метаболитов клетки на флуоресценцию ядер [98]. Проверить влияние метаболитов на анализ можно, сравнив данные внутренней и внешней стандартизации

Другая проблема, связанная с использованием стандартов, кроется в понимании значений содержания ДНК самих стандартов, используемых для расчетов. Например, одним из самых распространенных стандартов является Pisum sativum. В разных работах он используется в значении 2С = 9,09 пг, 8,76 пг, 8,37 пг и 8,018 пг [16, 98-100]. Несмотря на то, что отсутствие полиморфизма в содержании ДНК между сортами гороха и многих других видов, используемых в качестве стандартов ранее было доказано [19, 101, 102].

Соответственно и данные, полученные на основе одних и тех же видов, используемых в качестве стандартов, будут довольно сильно различаться. Поэтому при сравнении результатов особенно важно обращать внимание на то, какой стандарт и в каком значении авторы используют в своих работах. Это необходимо для пересчёта содержания ДНК на другое значение стандарта.

В 1970-90-х годах стандарты для проточной цитометрии одновременно разрабатывались в разных лабораториях. Для объективного расчёта содержания ДНК использовали различные виды и сорта растений с известным размером генома и иногда с известным AT/GC-составом. За это время сформировалось несколько школ цитометрии, и было разработано несколько наборов стандартов. Набор стандартов включает виды с различным содержанием ДНК для охвата всего диапазона размеров геномов растений. Различия между наборами стандартов разных авторов в основном связаны с выбором первичного стандарта. С этим же связаны различия в полученных данных по содержанию ДНК для одного и того же вида [19]. Первичный стандарт представляет собой вид с известным содержанием ДНК, часто определенный биохимическим методом или с помощью полногеномного секвенирования. Далее на основе полученных данных рассчитывается содержание ДНК остальных стандартов путем прямого измерения или косвенно, с применением каскадного подхода через уже измеренные стандарты [94].

На данный момент наиболее распространены стандарты в значениях J. Doležel основанные на размере генома человека [16, 26, 103], стандарты на основе генома риса [99, 104, 105] и реже стандарты на основе эритроцитов курицы [100]. Каждый набор стандартов может включать одни и те же виды, но отличаются первичным стандартом. Так в работе Marie, Brown, 1993 использовали эритроциты курицы (2,33 пг) в качестве первичного стандарта. Содержание ДНК в них было определено биохимическим методом в работе Galbraith et al., 1983. Для измерения содержания ДНК стандартов J. Doležel в качестве первичного стандарта использовались лейкоциты человека (7 пг), исследованные в работе Tiersch et al., 1989 [106]. К слову, в настоящее время 2C человека, определённый с помощью полногеномного секвенирования, составляет 6,11 Гб (6,25 пг) [107].

В связи с распространением методов полногеномного секвенирования был усовершенствован набор стандартов J. Doležel. Стандарты J. Doležel были пересчитаны относительно размера генома Oryza sativa, который на тот момент считался полностью секвенированным и включал 777,64 Мб (0,795 пг) [99]. Таким образом, данные, полученные на основе O. sativa, на данный момент являются наиболее точными и близкими к реальным значениям [99]. Однако авторы напрямую измерили относительно риса только часть стандартов, остальные были пересчитаны на основе соотношений из работы Doležel et al., 1992 с поправкой на новые данные полногеномного секвенирования человека. Фактически данный набор основан на двух первичных стандартах рисе и человеке, и присутствует небольшая нелинейность при использовании некоторых стандартов из данного набора [19] Данное несоответствие также отсылает к вопросу о сопоставимости данных полногеномного секвенирования и цитометрии.

Таким образом, используемые сегодня стандарты были определены разными методами, в разное время, с использованием разного оборудования и разных первичных стандартов. Часто значения содержания ДНК представляют собой среднее арифметическое данных нескольких исследований или данные различных подходов [19]. Например, стандарт Allium cepa в значении 2С = 34,89 пг рассчитан путем усреднения данных полученных в четырех разных лабораториях с использованием как лазерных, так и ламповых цитометров. Подобное «усреднение» в цитометрии растений встречалось повсеместно. Или такой стандарт как Zea mays часто используемый в значении 2С = 5,433 пг, исследован в той же работе, однако для расчета среднего содержания ДНК использованы усредненные данные, полученные на ламповых цитометрах только в двух разных лабораториях [16].

Тем самым для обеспечения сопоставимости результатов, при использовании более одного стандарта, для каждого образца следует указывать с каким стандартом и при каком значении 2С проводились измерения. Данная рекомендация необходима для пересчета содержания ДНК на другое значение 2С стандарта другими лабораториями. Естественно, стандарты должны быть из одного набора (работы) и линейны между собой, пересчитываться друг относительно друга в пределах 3 %. При этом для расчета среднего значения содержания ДНК образца рекомендуется использовать метод линейной регрессии [19, 94, 108]. При работе с таксонами с несколькими уровнями плоидности и необходимости применения двух и более стандартов можно откалибровать диплоидный образец для большей точности и использовать его в качестве стандарта в сочетании с основным стандартом [96, 109].

Развитие методов полногеномного секвенирования лишь заострило проблему точности и воспроизводимости получаемых данных о размере генома. Так, при сравнении данных по содержанию ДНК, полученных методом цитометрии и полногеномного секвенирования, можно видеть, что они чаще различаются и намного реже оказываются близки. Например, размер генома Arabidopsis thaliana, рассчитанный цитометрически, превышает значения, полученные при секвенировании. Согласно данным гибридного секвенирования (комбинация коротких и длинных прочтений), содержание ДНК (2С) A. thaliana составляет 0,273 пг (1C = 133,7 Мб) [110]. Одна из последних полных сборок на уровне хромосом показывает значение 2С = 0,286 пг [111]. В то же время цитометрическое измерение с использованием в качестве стандарта генома риса (0,795 пг) оценивает 2С A. thaliana в 0,304 пг [12].

Более новые геномные сборки риса определяют содержание его ДНК в 0,788 пг, что хорошо согласуется с принятыми ранее данными. Однако одна из последних гаплотип-разрешенных сборок риса оценивает его геном в 0,743 пг. Пересчет через цитометрически полученные соотношения риса к арабидопсису (0,376 и 0,366 по данным с использованием этого уточненного значения (0,743 пг) дает для A. thaliana величины 0,279 и 0,272 пг, которые уже сопоставимы с геномными сборками на уровне хромосом [19, 112-114].

Сходная ситуация наблюдается и для других видов, используемых в качестве стандартов: их оценки в разных работах либо сопоставимы, либо различаются в разной степени. Так на основе данных секвенирования, содержание ДНК (2С) томата варьирует от 1,634 до 1,84 пг [115, 116], сои — от 1,975 до 2,096 пг [117, 118], кукурузы — от 4,454 до 4,683 пг [119, 120], редиса — от 0,974 до 1,032 пг [121, 122]. Для гороха приводится значение 8,016 пг [123], для бобов — 24,3 пг [124], для лука — 30,55 пг [125].

Стандарты в классическом значении 2С, измеренные относительно первоначальных стандартов как человек, курица, или лук, которые были в свою очередь получены биохимическими способами, используют по сей день для обеспечения сопоставимости результатов с уже опубликованными данными. Новые полногеномные сборки высокого качества, появляющиеся в последнее время, и постоянный пересмотр стандартов под новые данные вносят определенную неразбериху при сопоставлении результатов, что вызывает трудности перед исследователями, не погруженными в тему стандартизации. По этой причине до сих пор остаются актуальными и используются самые распространенные линейки стандартов на основе генома человека (7 пг) и более точная на основе риса (0,795 пг). При публикации данных крайне важно указывать для каждого вида какой стандарт и в каком значении 2С использовался. Тогда как в работах по оценке размера генома для последующего секвенирования всегда остается возможность пересчитать уже опубликованные данные размеров генома или полученные в оригинальном исследовании под значение 2С стандарта, используя соотношения и значение 2С стандарта из более актуальной работы.

СОПОСТАВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ С ОПУБЛИКОВАННЫМИ ДАННЫМИ

При обработке собственных данных важен крайне аккуратный подход к интерпретации и сравнении с уже опубликованными значениями поскольку ранее опубликованные данные часто базируются на разных первичных стандартах, получены разными методами, на цитометрах разной степени совершенства. По этой причине при сравнении своих результатов с опубликованными ранее, требуется тщательный анализ методов, использованных авторами в конкретной статье.

В первую очередь необходимо сравнить используемые стандарты и их значения содержания ДНК. Часто возникают ошибки при сопоставлении данных, полученных на основании различных линеек стандартов, разница в размерах геномов между которыми доходит до 10-20 процентов. Отчасти это связано также с формированием школ цитометрии в разных странах и лабораториях в одно время, и классические стандарты разработаны не только Я. Долежелем, но и М. Беннетом, Д. Галбрайтом и Д. Мари [19, 86, 87, 100].

Другим важным моментом, на который необходимо обратить внимание, – это использованный для получения данных 2С метод. В базах данных размеров генома зачастую представлено значительное количество значений 2С, полученных методом денситометрии по Фёльгену. Данный метод позволяет сравнивать крупные и небольшие геномы, например лук и рис, отличающиеся друг от друга более чем в 30 раз. На практике сравнивая данные денситометрии и цитометрии разница может доходить до 10 – 30 % и более. Тоже самое относится и к данным, полученным на старых моделях цитометра, или ламповых приборах. Так в работе Doležel et al., 1998, самая большая разница в содержании ДНК исследованных видов выявлена для сои (50 %) между ламповым и лазерным цитометрами [16].

Нюансы пробоподготовки в разной степени могут влиять на различие в результатах. Значительные отклонения могут возникать в случае использования подхода внешней стандартизации. Тип стандартизации, внешняя или внутренняя (или стандарт внешний/внутренний) должен указываться в разделе методы. Небольшие различия, до 3%, выявлены между образцами, подготовленными в Отто буферах [19]. Также не стоит забывать, что множество исследований проводилось с использованием нуклеотид-специфичных красителей (ДАПИ, митрамицин и т.д.). В этом случае погрешность возникает из-за различий в АТ/ГЦ составе стандарта и образца. В таких ситуациях к термину содержание ДНК, добавляют приставку относительное. При использовании не специфичных красителей (пропидий иодид, этидий бромид) – абсолютное. Значительно влиять на результат может использование фиксированных (в спирте) или высушенных образцов, в большинстве случаем 2С увеличивается, но при длительном хранении отклонение предугадать сложно. Значительные трудности при интерпретации данных проточной цитометрии возникают в группах, где у диплоидных представителей разных секций или подродов наблюдается высокий внутривидовой или внутриродовой разброс значений 2С ДНК. В таких случаях оценка плоидности выше тетраплоидного уровня становится неоднозначной: гексаплоидные и более высокоплоидные формы могут демонстрировать размер генома, перекрывающийся с таковым у диплоидов из других таксономических групп, что делает невозможным надежное заключение о плоидности без дополнительных цитогенетических данных. Нельзя не учитывать влияние вторичных метаболитов, а также физиологическое состояние образцов (например, весенние и осенние растения), которое также во многом определяется метаболическим профилем. Все эти факторы могут ухудшать качество гистограмм, однако степень их негативного эффекта поддается контролю — в первую очередь, по величине коэффициента вариации (CV) исследуемого пика.

Если в случае с различиями в стандартах экспериментальные и литературные данные можно сравнить, пересчитав значения через соотношение 2С стандарта и образца, то инструментальные и методические погрешности учесть сложно. Считается, что разница в результатах между лабораториями может доходить в норме до 10 %, также как и разница между живыми и высушенными образцами [71]. Однако стоит понимать, что в проточной цитометрии результат — это не просто одно измерение, а сумма последовательных этапов, и погрешность накапливается. Коэффициенты вариации (CV) складываются не линейно, а квадратично. К таким коэффициентам можно отнести CV самого цитометра (на современных порядка 2%), CV пика, CV между измерениями. Качество пробоподготовки имеет решающее значение. Не стоит забывать и о постоянном контроле линейности цитометра, дублетов, гейтировании шумов. На современных цитометрах при использовании живых образцов и получении высоко качественных гистограмм, можно получать вполне сопоставимые результаты с ошибкой в десятые процента.

Заключение

Как показывают современные исследования, геномы растений очень динамичные, что оказывает влияние на их размер и содержание ДНК. Хотя мы уже располагаем большим количеством фактов, которые могут быть использованы для интерпретации наблюдаемых изменений, тем не менее вопрос о причинах вариабельности количества ДНК на ядро продолжает оставаться открытым. Отчасти определенную ошибку в определение размера генома вносят используемые методы. В случае выявления различий с опубликованными данными не стоит делать преждевременных выводов, необходимо внимательно исследовать методологию и в первую очередь систему стандартов на которую ориентируются авторы. В большинстве случаев различия вызваны используемым стандартом, реже разница в значениях связана с используемым методом (цитометрия или денситометрия). Однако в целом, на современных цитометрах при использовании одного и того же стандарта, в том же значении 2С, одном и том же протоколе пробоподготовки, с соблюдением всех требований, прежде всего к качеству образца и CV, результаты получаются сопоставимы и укладываются в стандартную ошибку цитометрии около 3%. Вариации в содержании ДНК выше 3–5 %, при соблюдении всех рекомендаций, могут указывать на внутривидовой полиморфизм, изменение числа или структуры хромосом.

About the authors

Mikhail Skaptsov

Email: mr.skaptsov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4884-0768
SPIN-code: 4762-1760

Galina Degtyareva

Email: degavi@belozersky.msu.ru
ORCID iD: 0000-0002-8198-5360
SPIN-code: 4758-1180

Sergey Smirnov

Email: serg_sm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9657-3959
SPIN-code: 2706-6346

Maxim Kutsev

Email: m_kucev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2284-6851
SPIN-code: 3424-9252

Alexander Shmakov

Author for correspondence.
Email: ssbgbot@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1052-4575
SPIN-code: 2428-4653

References

Supplementary files