Ecological geneticsEcological geneticsЭкологическая генетика1811-09322411-9202Eco-Vector1623910.17816/ecogen16239Genetic toxicologyГенетическая токсикологияResearch ArticleTechnical aspects of the electrophoresis stage in the comet assayТехнические аспекты проведения этапа электрофореза в методе ДНК-кометhttps://orcid.org/0000-0002-7673-867265061034627070-0510ZhanataevAliy K.ЖанатаевАлий Курманович
Russian Federation

PhD, Main Researcher, Laboratory of Pharmacology and Mutagenesis

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник, лаборатория фармакологии мутагенеза

zhanataev@academpharm.ruAnisinaElena A.АнисинаЕлена Александровна
Russian Federation

Researcher, Laboratory of Pharmacology and Mutagenesis

научный сотрудник, лаборатория фармакологии мутагенеза

anisinalena@yandex.ru7315-5417PliginaKira L.ПлигинаКира Львовна
Russian Federation

PhD, Researcher, Laboratory of pharmacology and mutagenesis

канд. биол. наук, научный сотрудник, лаборатория фармакологии мутагенеза

kira-pligina@rambler.ruLisitsynArtem A.ЛисицынАртем Андреевич
Russian Federation

Researcher, Laboratory of pharmacology and mutagenesis

лаборант-исследователь, лаборатория фармакологии мутагенеза

nordikal@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0218-858070060607538426-0380DurnevAndrey D.ДурневАндрей Дмитриевич
Russian Federation

Doctor of Science, Professor, Corresponding member of Russian Academy of Sciences, Head of Institute

д-р мед. наук, профессор, чл.-кор. РАН, директор

addurnev@mail.ruZakusov Research Institute of PharmacologyФедеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова»14042020080720201822032142409201920012020Copyright ©; 2020, Zhanataev A.K., Anisina E.A., Pligina K.L., Lisitsyn A.A., Durnev A.D.Copyright ©; 2020, Жанатаев А.К., Анисина Е.А., Плигина К.Л., Лисицын А.А., Дурнев А.Д.2020Zhanataev A.K., Anisina E.A., Pligina K.L., Lisitsyn A.A., Durnev A.D.Жанатаев А.К., Анисина Е.А., Плигина К.Л., Лисицын А.А., Дурнев А.Д.http://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://journals.eco-vector.com/ecolgenet/article/view/16239

Inter- and intralaboratory variability of results is still a serious issue in the comet assay. There are several technical conditions of procedure, which may critically affect the results and electrophoresis terms were identified as main. A comparative assessment of the expected and actual electric field strength in five electrophoretic tanks and the contribution of the revealed differences to the variability in DNA damage carried out. Only for one tank, the measured electric field strength coincided with the expected 1 V/cm, while for four it ranged from 0.6 to 2.0 V/cm. The values of DNA damage assessed in the same samples of mouse kidney cells differed between tanks up to 4.7-fold for induced and up to 10-fold for spontaneous DNA damage. High local variations in the electric field strength and solution temperature across the platform as well as in %DNA in the tail of identical cell samples within electrophoresis runs also revealed. These variations were reduced by recirculation of electrophoresis solution. The results show that discrepancy between the estimated and the actual electric field strength can be reason of inter-laboratory variation of the comet assay results. Recirculation of the solution during electrophoresis will be useful to control of intra-laboratory and intra-assay variations.

Причины меж- и внутрилабораторной вариабельности данных, полученных в исследованиях методом ДНК-комет, на сегодняшний день не до конца ясны. Гель-электрофорез является определяющим этапом при использовании метода анализа поврежденности ДНК единичных клеток. В настоящей работе проведена сравнительная оценка расчетной и фактической напряженности электрического поля в пяти различных электрофоретических камерах и вклада выявляемых различий в вариабельность оцениваемой поврежденности ДНК. Только для одной камеры измеренная напряженность совпала с расчетной — 1 В/см, тогда как для четырех варьировала от 0,6 до 2,0 В/см. Оцененные в одних и тех же образцах клеток почек мышей значения поврежденности ДНК различались между камерами до 4,7 крат для индуцированной и до 10 крат для спонтанной поврежденности ДНК. Выявлена высокая локальная вариация напряженности электрического поля и температуры раствора по площадке камер и вариабельность поврежденности ДНК в идентичных образцах клеток в условиях одного электрофореза. Таким образом, несоответствие при электрофорезе расчетной (теоретической) и фактической напряженности электрического поля может служить причиной межлабораторной вариабельности данных метода ДНК-комет. Рециркуляция раствора в ходе электрофореза позволяет значимо снизить внутриэкспериментальную и внутрилабораторную вариабельность результатов.

comet assayinter- and intralaboratory variabilityDNA damageelectric field strengthvoltageelectrophoresis tankметод ДНК-кометповреждение ДНКмеж- и внутрилабораторная вариабельностьэлектрофоретическая камеранапряженность электрического полянапряжениеГосударственное задание ФГБНУ НИИФState task FSBIArrayKoppen G, Azqueta A, Pourrut B, et al. The next three decades of the comet assay: a report of the 11th international comet assay workshop. Mutagenesis. 2017;32(3):397-408. https://doi.org/10.1093/mutage/gex002.Møller P. The comet assay: ready for 30 more years. Mutagenesis. 2018;33(1):1-7. https://doi.org/10.1093/mutage/gex046.Azqueta A, Gutzkow KB, Brunborg G, Collins AR. Towards a more reliable comet assay: optimizing agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 2011;724(1-2):41-45. https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2011.05.010.Azqueta A, Muruzabal D, Boutet-Robinet E, et al. Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme-modified comet assay in human biomonitoring studies. Mutat Res. 2019;843:24-32. https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2019.04.007.Forchhammer L, Johansson C, Loft S, et al. Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG inter-laboratory validation trial. Mutagenesis. 2010;25(2):113-123. https://doi.org/10.1093/mutage/gep048.Johansson C, Møller P, Forchhammer L, et al. An ECVAG trial on assessment of oxidative damage to DNA measured by the comet assay. Mutagenesis. 2010;25(2):125-132. https://doi.org/10.1093/mutage/gep055.Ersson C, Möller L. The effects on DNA migration of altering parameters in the comet assay protocol such as agarose density, electrophoresis conditions and durations of the enzyme or the alkaline treatments. Mutagenesis. 2011;26(6):689-695. https://doi.org/10.1093/mutage/ger034.Speit G, Trenz K, Schütz P, et al. The influence of temperature during alkaline treatment and electrophoresis on results obtained with the comet assay. Toxicol Lett. 1999;110(1-2):73-78. https://doi.org/10.1016/S0378-4274(99)00137-X.Sirota NP, Zhanataev AK, Kuznetsova EA, et al. Some causes of inter-laboratory variation in the results of comet assay. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2014;770:16-22. https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2014.05.003.Møller P, Möller L, Godschalk RW, Jones GD. Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay validation group. Mutagenesis. 2010;25(2):109-111. https://doi.org/10.1093/mutage/gep067.Godschalk RW, Ersson C, Riso P, et al. DNA-repair measurements by use of the modified comet assay: an inter-laboratory comparison within the European Comet Assay validation group (ECVAG). Mutat Res. 2013;757(1):60-67. https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2013.06.020.Ersson C, Møller P, Forchhammer L, et al. An ECVAG inter-laboratory validation study of the comet assay: inter-laboratory and intra-laboratory variations of DNA strand breaks and FPG-sensitive sites in human mononuclear cells. Mutagenesis. 2013;28(3):279-286. https://doi.org/10.1093/mutage/get001.Plappert-Helbig U, Guérard M. Inter-laboratory comparison of the in vivo comet assay including three image analysis systems. Environ Mol Mutagen. 2015;56(9):788-793. https://doi.org/10.1002/em.21964.Olive PL, Wlodek D, Durand RE, Banáth JP. Factors influencing DNA migration from individual cells subjected to gel electrophoresis. Exp Cell Res. 1992;198(2):259-267. https://doi.org/10.1016/0014-4827(92)90378-l.Brunborg G, Rolstadaas L, Gutzkow KB. Electrophoresis in the comet assay. (September 12th 2018). In: Bolduna OM, Balta C, eds. Electrophoresis – Life Sciences Practical Applications. London: Intech Open; 2018. Р. 63-80. https://doi.org/10.5772/intechopen.76880.Sambrook J, Russel DW. Molecular cloning – a laboratory manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.Olive PL, Banáth JP. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 2006;1(1):23-29. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.5.OECD. Test No. 489: In vivo mammalian alkaline comet assay [Internet]. Paris: OECD Publishing; 2016. Available from: https://www.oecd.org/env/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay-9789264264885-en.htm.Gutzkow KB, Langleite TM, Meier S, et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 2013;28(3):333-340. https://doi.org/10.1093/mutage/get012.Tice RR, Agurell E, Anderson D, et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 2000;35(3):206-221. https://doi.org/10.1002/(SICI)1098-2280(2000)35:33.0.CO;2-J.Collins AR, Oscoz AA, Brunborg G, et al. The comet assay: topical issues. Mutagenesis. 2008;23(3):143-151. https://doi.org/10.1093/mutage/gem051.Collins AR, El Yamani N, Lorenzo Y, et al. Controlling variation in the comet assay. Front Genet. 2014;5:359. https://doi.org/10.3389/fgene.2014.00359.Roy M, Hamel A, Cardoso R. Effect of slide positioning in electrophoresis chamber over comet assay results [Internet]. Charles River Laboratories, Senneville, Quebec, Canada, H9X 3R3. Available from: https://www.criver.com/sites/default/files/resources/EffectofSlidePositioninginElectrophoresisChamberOverCometAssayResults.pdf.Brody JR, Kern SE. Sodium boric acid: a tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis. Biotechniques. 2004;36(2):214-216. https://doi.org/10.2144/04362BM02.O’Conner JL, Wade MF, Zhou Y. Control of buffer pH during agarose gel electrophoresis of glyoxylated RNA. Biotechniques. 1991;10(3):300-302.