Ecological geneticsEcological geneticsЭкологическая генетика1811-09322411-9202Eco-Vector62292610.17816/ecogen622926Genetic basis of ecosystems evolutionГенетические основы эволюции экосистемResearch ArticleHairy roots biochemical characteristics of vegetable pea’s morphotype with modified leafБиохимическая характеристика трансформированных корней Pisum sativum L. subsp. sativum var. Sativum с модифицированным морфотипом листа7758-9906TiminaOlga O.ТиминаОльга Олеговна
Moldova, Republic of

Dr. Sci. (Biology), Professor, Faculty of Natural Geography, Department of Botany and Ecology

доктор биол. наук, профессор, естественно-географический факультет, кафедра ботаники и экологии

otimina@mail.ru6471-1117TiminOleg Yu.ТиминОлег Юрьевич
Moldova, Republic of

Cheif of laboratory "Protection and restoration phytocenosises", Cand. Sci. (Agricultural), Assistant Professor

заведующий лаборатории "Защиты и восстановления фитоценозов", к. с.-х. н., доцент

otimin@mail.ru6895-2705StepanovaAnna Yu.СтепановаАнна Юрьевна
Russian Federation

Cand. Sci. (Biology), transformation roots chief group, senior staff scientist

заведующая группой трансформированных корней, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

step_ann@mail.ruShevchenko State UniversityПриднестровский государственный университет им. Т.Г. ШевченкоResearch Institute of Ecology and Natural ResourcesНаучно-исследовательский институт экологии и природных ресурсовK.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology RASИнститут физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук030420241405202422123320111202331032024Copyright ©; 2024, Eco-VectorCopyright ©; 2024, Эко-Вектор2024Eco-VectorЭко-Векторhttps://journals.eco-vector.com/ecolgenet/article/view/622926

BACKGROUND: In the literature, data on the successful production of high-protein pea root cultures with mutant alleles tl and af tl and their biochemical characteristics are not presented.

AIM: The aim of this study is the biochemical characteristic of the obtained transformed cultures of mutant pea lines with a modified leaf morphotype was. Rol genes clarification of transformed pea mutant lines by wild strains of Agrobacterium rhizogenes and amino acid analysis of the total protein of the obtained roots cultures were objectives of the research.

MATERIALS AND METHODS: Total DNA has been isolated from pea mutant root cultures. The studies were carried out on the equipment of the thermal cycler Tertsik of the company DNA-Technology (Russia). Amplicons were detected by electrophoresis in a 2% agarose gel. The gel was visualized and photographed under ultraviolet light (λ = 312 nm). The quantitative and qualitative amino acid composition of root cultures was determined by ion exchange chromatography on the amino acid analyzer AAA-339 (Microtechna, Czech Republic).

RESULTS: PCR analysis revealed the absence of agrobacterial contamination in the transformed cultures and their stable growth on liquid and agar hormone-free media for 5 years. PCR assay showed the presence of rol C and D genes in culture with the tltl genotype and four rol genes A, B, C, and D in culture with the afaftltl genotype. A differentiated content of a number of amino acids in the biomass of transformed cultures was found depending on the genotype of the culture and the insertion of rol genes. Seven essential amino acids were identified in both cultures.

CONCLUSIONS: Tryptophan turned out to be the limiting essential amino acid for both cultures. In terms of the sum of essential, ketogenic and sulfur-containing amino acids, the culture with the rol genes A, B, C, and D turned out to be the richest and most balanced.

Актуальность. В литературных источниках данные об успешном получении высокобелковых корневых культур гороха с мутантными аллелями tl и af tl и их биохимическая характеристика не представлены.

Цель — биохимическая характеристика полученных трансформированных культур мутантных линий гороха с модифицированным морфотипом листа. Задачи исследований: уточнение состава генов rol трансформированных культур гороха дикими штаммами Agrobacterium rhizogenes и аминокислотный анализ общего белка полученных культур.

Материалы и методы. Тотальная ДНК была выделена из культуры корней мутантов гороха. Исследования выполнены на оборудовании термоциклер «Терцик» фирмы «ДНК-Технология» (Россия). Выявление ампликонов проводили методом электрофореза в 2 % агарозном геле. Гель визуализировали и фотографировали в ультрафиолетовом излучении (λ = 312 нм). Количественный и качественный аминокислотный состав корневых культур определяли методом ионообменной хроматографии на аминокислотном анализаторе ААА-339 (Microtechna, Чехия).

Результаты. Методом ПЦР выявлено отсутствие агробактериальной контаминации в трансформированных культурах и их стабильный рост на жидких и агаризованных безгормональных средах в течение 5 лет. ПЦР-анализ показал наличие двух генов rol C и D в культуре с генотипом tltl и четырех генов rol A, B, C и D в культуре с генотипом afaftltl. Обнаружено дифференцированное содержание ряда аминокислот в биомассе трансформированных культур в зависимости от генотипа культуры и вставок генов rol. Выявлены семь незаменимых аминокислот в обеих культурах. Лимитирующей незаменимой аминокислотой для обеих культур оказался триптофан.

Вывод. По содержанию суммы незаменимых, кетогенных и серосодержащих аминокислот корневая культура с генами rol A, B, C, D оказалась наиболее богатой и сбалансированной.

transformationPisum sativummutantsAgrobacterium rhizogeneshairy rootsPCRamino acid compositionтрансформацияPisum sativumмутантыAgrobacterium rhizogeneshairy rootsПЦРаминокислотный составBobkov SV, Uvarova OV. Peas use perspectives for production of storage proteins isolates. Zemledelie. 2012;(8):47–48. EDN: PHIQBHБобков С.В., Уварова О.В. Перспектива использования гороха для производства изолятов запасных белков // Земледелие. 2012. № 8. С. 47–48. EDN: PHIQBHZelenov AN, Shelepina NV, Mamaeva MV. Peculiarities of aminoacid composition of proteins leaf pea mutants. Legumes and groat crops. 2013;(1):21–25. EDN: QCSQJDЗеленов А.Н., Шелепина Н.В., Мамаева Н.В. Особенности аминокислотного состава белка листовых мутантов гороха // Зернобобовые и крупяные культуры. 2013. № 1. С. 21–25. EDN: QCSQJDZelenov AN, Kondykov IV, Uvarov VN. Vavilov’s principles in breeding of peas of the XXIst century. Legumes and groat crops. 2012;(4):19–27. EDN: QCPAYHЗеленов А.Н., Кондыков И.В. Уваров В.Н. Вавиловские принципы в селекции гороха XXI века // Зернобобовые и крупяные культуры. 2012. № 4. С. 19–27. EDN: QCPAYHKrasilnikov VN, Gavrilyuk IP. Prospects of production of protein nutraceuticals. In: Braudo EE, editor. Vegetable protein: new perspectives. Moscow: Pischepromizdat, 2000. P. 24–39. (In Russ.)Красильников В.Н., Гаврилюк И.П. Перспективы производства белковых нутрицевтиков. В кн.: Растительный белок: новые перспективы / под ред. Е.Е. Браудо. Москва: Пищепромиздат, 2000. С. 24–39.Bogracheva T, Topliff I, Meares C. Starch thermoplastic films from a range of pea (Pisum sativum) mutants [ABSTRACT]. In: 5th European conferences on grain legumes. France, Dijon, 2004. P. 47–48.Bogracheva T., Topliff I., Meares C. Starch thermoplastic films from a range of pea (Pisum sativum) mutants [ABSTRACT]. В кн.: 5th European conferences on grain legumes. France, Dijon, 2004. P. 47–48.Kosterin OE. Prospects of using wild relatives in pea breeding (Pisum sativum L.). Vavilov journal of genetics and breeding. 2015;19(2):154–164. EDN: UCRFJVКостерин О.Э. Перспективы использования диких сородичей в селекции гороха (Pisum sativum L.) // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2015. Т. 19, № 2. С. 154–164. EDN: UCRFJVShelepina NV. Component composition of protein of non-traditional forms of peas. In: Proceeding of the VIII International Symposium: “New and non-traditional plants and prospects of their use”. Vol. 3. Moscow, 2009 Jun 22–26. Moscow, 2009. P. 304–307. (In Russ.)Шелепина Н.В. Компонентный состав белка нетрадиционных форм гороха. В кн.: Материалы VIII Международного симпозиума: «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» в 3-х т. Т. 3. Москва, 22–26 июня 2009 г. Москва, 2009. С. 304–307.Selikhova TN, Bobkov SV. Improving of protein quality in pea with use of convicilin polymorphism. Zemledelie. 2015;(2):47–48. EDN: TNVPINСелихова Т.Н., Бобков С.В. Повышение качества белка гороха с использованием полиморфизма конвицилина // Земледелие. 2015. № 2. С. 47–48. EDN: TNVPINScherbakov VG, Moskvich IA. Influence of proteinases and their inhibitors on the nutritional value of proteins. Izvestiya vuzov. Food technology. 2006;(4):35–36. EDN: KVKABHЩербаков В.Г., Москвич И.А. Влияние протеиназ и их ингибиторов на пищевую ценность белков // Известия ВУЗов. Пищевая технология. 2006. № 4. С. 35–36. EDN: KVKABHVilmorin P. Recherches sur heredite mendeliene. Comp Rend Acad Sci. 1910;151:548–551.Vilmorin P. Recherches sur heredite mendeliene // Comp Rend Acad Sci. 1910. Bd. 151. S. 548–551.Titenok TS, Zelenov AN. Leaf mutants in pea selection. Agrarian Russia. 2002;(1):34–36. EDN: TUPZKFТитенок Т.С., Зеленов А.Н. Листовые мутанты в селекции гороха // Аграрная Россия. 2002. № 1. С. 34–36. EDN: TUPZKFTimina O, Timin O, Alecsandrova T. Hairy roots of pea mutants with a modified morph leaf type. BIO Web Conf. 2020;24:86. doi: 10.1051/bioconf/20202400086Timina O., Timin O., Alecsandrova T. Hairy roots of pea mutants with a modified morph leaf type // BIO Web Conf. 2020. Vol. 24. ID 86. doi: 10.1051/bioconf/20202400086Lloyd G, McCown B. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. Comb Proc Intern Plant Propagator Soc. 1981;30:421–427.Lloyd G., McCown B. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture // Comb Proc Intern Plant Propagator Soc. 1981. Vol. 30. P. 421–427.Stepanova AY, Solov´eva AI, Malunova MV, et al. Hairy roots Scutelaria spp., (Lamiaceae) as promising producers of antiviral flavones. Molecules. 2021;26(13):3927. doi: 10.3390/molecules26133927Stepanova A.Y., Solov´eva A.I., Malunova M.V., et al. Hairy roots Scutelaria spp., (Lamiaceae) as promising producers of antiviral flavones // Molecules. 2021. Vol. 26, N. 13. ID 3927. doi: 10.3390/molecules26133927Garaeva SN, Redkozubova GV, Postolati GV. Amino acids in living organism. Chisinau: ASM, 2009. (In Russ.)Гараева С.Н., Редкозубова Г.В., Постолати Г.В. Аминокислоты в живом организме. Кишинев: АСМ, 2009.Intrieri MC, Buiatti M. The horizontal transfer of Agrobacterium rhizogenes genes and the evolution of the genus Nicotiana. Mol Phylogenetics Evol. 2001;20(1):100–110. doi: 10.1006/mpev.2001.0927Intrieri M.C., Buiatti M. The horizontal transfer of Agrobacterium rhizogenes genes and the evolution of the genus Nicotiana // Mol Phylogenetics Evol. 2001. Vol. 20, N. 1. P. 100–110. doi: 10.1006/mpev.2001.0927Švábová L, Griga M. The effect of co cultivation treatments on transformation efficiency in pea (Pisum sativum L.). Plant Cell Tiss Organ Cult. 2008;95:293–304. doi: 10.1007/s11240-008-9443-4Švábová L., Griga M. The effect of co cultivation treatments on transformation efficiency in pea (Pisum sativum L.) // Plant Cell Tiss Organ Cult. 2008. Vol. 95. P. 293–304. doi: 10.1007/s11240-008-9443-4Grant JE, Cooper PA. Genetic transformation in pea. In: Jaiwal K, Singh RP, editors. Applied genetics of leguminosae biotechnology. Kluwer Academic Publishers, 2003. P. 23–34. doi: 10.1007/978-94-017-0139-6_2Grant J.E., Cooper P.A. Genetic transformation in pea. В кн.: Jaiwal K., Singh R.P., editors. Applied genetics of leguminosae biotechnology. Kluwer Academic Publishers, 2003. P. 23–34. doi: 10.1007/978-94-017-0139-6_2Pniewski T, Kapusta J. Efficiency of transformation of Polish cultivars of pea (Pisum sativum L.) with various regeneration capacity by using hypervirulent Agrobacterium tumefaciens strains. J Appl Genet. 2005;46(2):139–147.Pniewski T., Kapusta J. Efficiency of transformation of Polish cultivars of pea (Pisum sativum L.) with various regeneration capacity by using hypervirulent Agrobacterium tumefaciens strains // J Appl Genet. 2005. Vol. 46, N. 2. P. 139–147.Krejčí P, Matušková P, Hanáček P, et al. The transformation of pea (Pisum sativum L.): applicable methods of Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer. Acta Physiol Plant. 2007;29:157–163. doi: 10.1007/s11738-006-0020-3Krejčí P., Matušková P., Hanáček P., et al. The transformation of pea (Pisum sativum L.): applicable methods of Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer // Acta Physiol Plant. 2007. Vol. 29. P. 157–163. doi: 10.1007/s11738-006-0020-3Clemow SR, Clairmont L, Madsen LH, Guinel FC. Reproducible hairy root transformation and spot-inoculation methods to study root symbioses of pea. Plant Methods. 2011;7:46. doi: 10.1186/1746-4811-7-46Clemow S.R., Clairmont L., Madsen L.H., Guinel F.C. Reproducible hairy root transformation and spot-inoculation methods to study root symbioses of pea // Plant Methods. 2011. Vol. 7. ID 46. doi: 10.1186/1746-4811-7-46Leppyanen IV, Kirienko AN, Dolgikh EA. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of Pisum sativum L. roots as a tool for studying the mycorrhizal and root nodule symbioses. Peer J. 2019;7:e6552. doi: 10.7717/peerj.6552Leppyanen I.V., Kirienko A.N., Dolgikh E.A. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of Pisum sativum L. roots as a tool for studying the mycorrhizal and root nodule symbioses // Peer J. 2019. Vol. 7. ID e6552. doi: 10.7717/peerj.6552Novikova NE. Physiological substantiation of the role of plant morphotype in the formation of yield of pea varieties [dissertation ABSTRACT]. Orel, 2002. 46 p. (In Russ.)Новикова Н.Е. Физиологическое обоснование роли морфотипа растений в формировании урожайности сортов гороха: автореф. дис. … д-ра с.-х. наук. Орёл, 2002. 46 с.Trovato M, Maras B, Linhares F, Costantino P. The plant oncogene rol D encodes a fuctional ornithine cyclodeaminase. PNAS USA. 2001;98(23):13449–13453. doi: 10.1073/pnas.231320398Trovato M., Maras B., Linhares F., Costantino P. The plant oncogene rol D encodes a fuctional ornithine cyclodeaminase // PNAS USA. 2001. Vol. 98, N. 23. P. 13449–13453. doi: 10.1073/pnas.231320398Trovato M, Forlani G, Signorelli S, Funck D. Proline metabolism and its functions in development and stress tolerance. In: Hossain M, Kumar V, Burritt D, et al., editors. Osmoprotectant-mediated abiotic stress tolerance in plants. New York: Springer, 2019. P. 41–72. doi: 10.1007/978-3-030-27423-8_2Trovato M., Forlani G., Signorelli S., Funck D. Proline metabolism and its functions in development and stress tolerance. В кн.: Hossain M., Kumar V., Burritt D., et al. editors. Osmoprotectant-mediated abiotic stress tolerance in plants. New York: Springer, 2019. P. 41–72. doi: 10.1007/978-3-030-27423-8_2Matveeva TV, Sokornova SV. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of plants for improvement of yields of secondary metabolites. In: Pavlov A, Bley T, editors. Bioprocessing of plant in vitro systems. Reference series in phytochemistry. Cham (Switzerland): Springer, 2016. P. 161–202. doi: 10.1007/978-3-319-32004-5_18Matveeva T.V., Sokornova S.V. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of plants for improvement of yields of secondary metabolites. В кн.: Pavlov A., Bley T., editors. Bioprocessing of plant in vitro systems. Reference series in phytochemistry. Cham (Switzerland): Springer, 2016. P. 161–202. doi: 10.1007/978-3-319-32004-5_18Khafizova GV, Matveeva TV. The rolC gene of agrobacteria: towards the understanding of its functions. Plant Biotechnology and Breeding. 2021;4(1):36–46. EDN: SAQSGF doi: 10.30901/2658-6266-2021-1-o4Хафизова Г.В., Матвеева Т.В. Ген rolC агробактерий: на пути к пониманию функции // Биотехнология и селекция растений. 2021. Т. 4, № 1. С. 36–46. EDN: SAQSGF doi: 10.30901/2658-6266-2021-1-o4Zelenov AA. Morpho-physiological features and breeding value of split-leaf pea form [dissertation ABSTRACT]. Orel: Orel State Agrarian University, 2017. P. 1–25. (In Russ.)Зеленов А.А. Морфофизиологические особенности и селекционная ценность рассеченнолисточковой формы гороха: автореф. … дис. канд. с.-х. наук. Орел: Орловский государственный аграрный университет, 2017. С. 1–25.Putina OV. Breeding value of vegetable pea of different morphotypes in conditions of Krasnodar region [dissertation ABSTRACT]. Saint Petersburg, 2018. P. 1–24. (In Russ.)Путина О.В. Селекционная ценность овощного гороха разных морфотипов в условиях Краснодарского края: автореф. … дис. канд. биол. наук. Санкт-Петербург, 2018. С. 1–24.