BACKGROUND: The CRISPR/Cas9 technology enables the generation of genetically modified founder animals (F0 generation) already at the stage of zygote editing. However, the resulting offspring are often mosaic, meaning they carry different mutations in different cells, which complicates accurate genotyping using standard tissue samples. To establish a stable knockout line, it is necessary to identify F0 individuals carrying the target mutations, which requires subsequent crossing with wild-type mice and a large-scale analysis of the F1 offspring, involving significant costs. Therefore, the efficient prediction of inheritable mutations at the F0 generation stage is a critical task.
AIM: A comparative evaluation of the efficiency of the TIDE and ICE bioinformatic algorithms for analyzing Sanger sequencing data to accurately predict inheritable mutations in the vldlr gene in F0 mosaic mice.
METHODS: The study was conducted on five F0 mosaic mice with mutations in the vldlr gene, obtained by microinjection of CRISPR/Cas9 components into zygotes. Genomic DNA was isolated from ear tissue, the target region of the vldlr gene was amplified by PCR and sequenced by the Sanger method. The resulting chromatograms were analyzed using the TIDE and ICE algorithms. The predictions were validated by crossing the F0 mice with wild-type mice and analyzing the inheritance of mutations in the F1 generation.
RESULTS: The comparison of the algorithms showed that both programs correctly predicted all mutations that were subsequently detected in the F1 generation. In total, 31 F1 offspring were analyzed.
CONCLUSION: Both tools are suitable for primary screening. The analysis of the offspring confirmed that all actually inherited mutations were predicted by both methods.
Обоснование. Технология CRISPR/Cas9 позволяет проводить редактирование генома зигот и получать генетически модифицированных животных в поколении F0. Однако полученное потомство часто является мозаичным, то есть несёт целый спектр мутаций в разных клетках организма и затрудняет точное генотипирование с использованием стандартных образцов тканей. Для создания стабильной нокаутной линии необходимо идентифицировать особей F0, несущих целевые мутации, что требует скрещивания мышей F0 с мышами дикого типа и масштабного анализа потомства F1, сопряженного со значительными затратами. Поэтому эффективное прогнозирование наиболее вероятных мутаций с высокой вероятностью наследования уже на стадии поколения F0 рассматривается как критически важная задача.
Цель исследования. Сравнительная оценка эффективности биоинформатических алгоритмов TIDE и ICE для анализа данных секвенирования по Сэнгеру с целью предсказания мутаций в гене vldlr с наибольшей вероятностью наследования у мозаичных мышей поколения F0.
Методы. Исследование проведено на 5 мозаичных мышах F0 с мутациями в гене vldlr, полученных путем микроинъекции компонентов системы CRISPR/Cas9 в зиготы. Геномная ДНК была выделена из ткани уха, целевой участок гена vldlr был амплифицирован с помощью ПЦР и секвенирован методом Сэнгера. Полученные хроматограммы были проанализированы с использованием алгоритмов TIDE и ICE. Варианты предсказанных мутаций были валидированы путем скрещивания мышей F0 с мышами дикого типа и анализа наследования мутаций в поколении F1.
Результаты. Сравнение алгоритмов показало, что обе программы корректно предсказали все мутации, которые впоследствии были обнаружены в поколении F1. Всего было проанализировано 30 мышей поколения F1.
Заключение. Оба алгоритма пригодны для первичного скрининга. Анализ потомства подтвердил, что все фактически унаследованные мутации были предсказаны обоими методами.