BACKGROUND: Chlamydomonas reinhardtii P.A.Dang. – a model object for studying the genetics of green algae. In order to expand and improve the tools for genetic engineering of microalgae, we applied the CRISPR/Cas9 plant binary vector pKSE401 for knockout of the gene PSY1 (PHYTOENE SYNTHASE 1) encoding a key enzyme in the metabolic pathway of carotenoid biosynthesis in C. reinhardtii. Mutations in this gene provide a convenient phenotype-based selection system (white/pale green colonies).
AIM: The aim of our study was to examine the possibility of using the pKSE401 plant binary vector for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in microalga C. reinhardtii.
METHODS: We created the pKSE401-PSY1 vector, which carries a previously applied guide RNA spacer to the PSY1 gene of C. reinhardtii. Wild-type strains were used in the work: CC-124 (wt, mt-) and 137c (wt, mt+). The experiments were carried out in three biological and three technical repetitions. Cell culture and electroporation conditions, as well as screening protocol of psy1 transformants (white/pale green colony coloration as a selective system, PCR and sequencing for verification), were carried out in accordance with the published protocols.
RESULTS: As a result, 164 colonies of transformants were obtained and analyzed, of which 29 had a white/pale green phenotype (17.7%). Of these, 13 mutants were confirmed to have insertions/deletions in PSY1 gene target site by sequencing, and for 3 mutants we failed to generate a PCR product. The overall effectiveness of targeted editing of the PSY1 gene (in all experimental variants) reached 7.9%.
CONCLUSION: The preliminary results obtained demonstrate the possibility of using the plant binary vector pKSE401 to knockout genes in green alga C. reinhardtii, expanding the range of possible target species for its application. The system used has significant limitations (random plasmid insertion into the genome, low gene editing efficiency), but further improvement of the protocol may eliminate several of the identified shortcomings.
Обоснование. Chlamydomonas reinhardtii P.A.Dang. – модельный объект для изучения генетики зелёных водорослей. С целью пополнения и совершенствования инструментария генной инженерии микроводорослей мы применили бинарный растительный вектор pKSE401 на основе системы CRISPR/Cas9 для нокаута гена PSY1 (PHYTOENE SYNTHASE 1) C. reinhardtii, кодирующего ключевой фермент в метаболическом пути биосинтеза каротиноидов. Мутации в этом гене приводят к появлению характерной белой/бледно-зелёной окраски колоний, что позволяет отбирать трансформанты с нарушениями в гене PSY1 по фенотипу.
Цель исследования. Целью нашего исследования было изучить возможность использования бинарного растительного вектора pKSE401 для нокаута генов методом CRISPR/Cas9 у микроводоросли C. reinhardtii.
Методы. Мы создали вектор pKSE401-PSY1, который содержит ранее применённый спейсер гидовой РНК к гену PSY1 C. reinhardtii. В работе были использованы штаммы дикого типа: CC-124 (wt, mt-) и 137c (wt, mt+). Эксперименты проводили в трёх биологических и трёх технических повторностях. Культивирование клеток и условия трансформации (методом электропорации), а также протокол скрининга трансформантов psy1 (белый/бледно-зелёный цвет колоний как селективная система, ПЦР и секвенирование для верификации редактирования) были проведены в соответствии с опубликованными протоколами.
Результаты. Всего было получено и проанализировано 164 колонии трансформантов, из которых 29 имели белый/бледно-зелёный фенотип (17,7%). Из них для 13 мутантов методом секвенирования подтверждено наличие инсерций/делеций в целевом сайте гена PSY1, для 3 мутантов не удалось получить ПЦР-продукт. Общая эффективность направленного редактирования гена PSY1 (во всех вариантах эксперимента) достигла 7,9%.
Заключение. Полученные предварительные результаты продемонстрировали возможность использования растительного бинарного вектора pKSE401 для нокаута генов у зелёной водоросли C. reinhardtii, что расширяет список возможных целевых видов для его применения. Используемая система имеет существенные ограничения (случайное встраивание плазмиды в геном, низкая эффективность редактирования), однако дальнейшее совершенствование протокола может устранить некоторые из выявленных недостатков.