BACKGROUND: Retrotransposons are mobile genetic elements that replicate via reverse transcription and constitute substantial fractions of eukaryotic genomes; they are also considered evolutionary precursors of retroviruses, and can affect host fitness. Intriguingly, some retrotransposon proteins share motifs with amyloids—fibrous protein aggregates with cross-β architecture that readily self-assemble into polymeric structures and can, in some cases, self-propagate in an infectious manner (prions).
AIM: To identify and characterize potential amyloid-forming regions within the integrase of Saccharomyces cerevisiae Ty1 retrotransposon, which mediates integration of transposon copies into the host genome.
METHODS: Computational analysis of the Ty1 integrase sequence was performed with the ArchCandy algorithm to identify putative amyloidogenic motifs. To evaluate the amyloidogenic potential of candidate regions, we employed a yeast-based nucleation assay. Aggregation was visualized by expressing Ty1Int(AD)-GFP fusion constructs. Colocalization of Ty1 amyloidogenic domain with full length in yeast cells was evaluated by confocal microscopy.
RESULTS: We identified and experimentally validated an amyloidogenic region within the Ty1 integrase, designated Ty1Int(AD). ArchCandy predicted the region with amyloidogenic potential, and these predictions were confirmed in a yeast prion-nucleation assay and by expression of the Ty1Int(AD)-GFP fragment, which formed detergent-resistant aggregates. Confocal microscopy showed co-localization of these aggregates with native Ty1 integrase fused with YFP, indicating recruitment of the full-length protein into inclusions.
CONCLUSION: Together, these results identify a previously unrecognized amyloidogenic region within Ty1 integrase, possessing amyloid-like properties, and suggest that aggregation of this domain may regulate retrotransposon activity by altering integrase availability and/or function. This is therefore important for the design, optimization, and biosafety assessment of retrotransposon based vectors and other GMO constructs.
Обоснование. Ретротранспозоны — мобильные генетические элементы, реплицирующиеся через механизм обратной транскрипции и составляющие значительную долю генетического материала у многих эукариот. Они рассматриваются как эволюционные предшественники ретровирусов и могут влиять на приспособленность хозяина. У ряда белков ретротранспозонов выявлены структуры, сходные с обнаруженными в белках, формирующих амилоиды — фибриллярные белковые агрегатами с кросс-β-архитектурой, которые способны к самосборке и в ряде случаев к нуклеированной пролиферации по механизму самовоспроизводимых изоформ (прионов).
Цель исследования. Выявить и охарактеризовать потенциально амилоидогенные участки в интегразе ретротранспозона Ty1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae, ферменте, ответственном за интеграцию копий транспозона в геном хозяина.
Методы. Выявление предполагаемых амилоидогенных мотивов в последовательности интегразы Ty1 осуществляли с помощью алгоритма ArchCandy. Анализ амилоидогенного потенциала фрагмента интегразы in vivo проводили при помощи дрожжевой модели фенотипической детекции амилоидов. Для визуализации агрегатов, формируемых интегразой Ty1 или её фрагментом, использовали конструкции, в которых последовательности, кодирующие белки интереса, слиты с последовательностью, кодирующей белок GFP. Колокализацию амилоидогенного домена Ty1 с полноразмерной интегразой оценивали методом конфокальной микроскопии.
Результаты. Выявлено и экспериментально подтверждено наличие амилоидогенного участка в интегразе Ty1, обозначенного как Ty1Int(AD). Участок с амилоидогенным потенциалом был предсказан при помощи алгоритма ArchCandy; предсказания были подтверждены в дрожжевой системе фенотипической детекции амилоидов, а также при экспрессии фрагмента Ty1Int(AD)-YFP, который формировал детергент-устойчивые агрегаты. Конфокальная микроскопия показала колокализацию этих агрегатов с полноразмерной интегразой Ty1, слитой с YFP.
Заключение. Выявлен ранее неописанный амилоидогенный участок в интегразе Ty1, агрегация которого может модулировать активность ретротранспозона за счёт изменения доступности и/или функциональной активности интегразы. Учёт риска агрегации интегразы важен при проектировании, оптимизации и оценке биобезопасности векторов на основе ретротранспозонов и других конструкций генетически модифицированных организмов.