Влияние трифенилтетрадецилфосфония бромида и трибутилгексадецилфосфония бромида на клеточную проницаемость у лиц, имеющих генетически обусловленное нарушение проницаемости клеточных мембран

Полный текст

Биологически активные вещества (БАВ) С14 (трифенилтетрадецилфосфония бромид) и С16 (трибутилгексадецилфосфония бромид) синтезированы на кафедре высокомолекулярных и элементоорганических соединений Химического института им. A.M. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета. Их фармакологические свойства изучали на кафед­ре высокомолекулярных и элементоорганичес­ких соединений. Доказан антибактериальный и фунгицидный фармакологический эффект этих БАВ [2]. Один из факторов, определяющих биодоступность лекарственных форм, - интенсивность высвобождения из них лекарственных веществ, которая служит также одним из критериев выбора оптимального состава веществ [3]. Кинетику высвобождения лекарственного вещества из лекарственных форм изучают методом равновесного диализа через полупроницаемую мембрану. В настоящее время для изучения проницаемости стали активно использовать мембраны клеток крови. В клинической практике можно оценивать проницаемость клеточной мембраны по Na+, изучая так называемую облегчённую диффузию Na+, осуществляемую белком-переносчиком, то есть Na+-Li+-противотранспорт (Na+-Li+-ПТ), по методике M. Canessa и соавт. [11]. Важно отметить, что Na+-Li+-ПТ на 80% генетически детерминирован. В.Н. Ослоповым и соавт. [1, 8, 9, 11] были определены границы квартилей (КВ) популяционного (у 643 человек - 417 мужчин и 226 женщин) распределения величин скорости Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита [в микромолях Li на 1 л клеток (эритроцитов) в час, далее «в мкМ Li»]: I КВ - 38-203, II КВ - 204-271, III КВ - 272-345, IV КВ - 346-730. Условно считают, что величины скорости Na+-Li+-ПТ I КВ соответствуют низкой проницаемости по Na+, II КВ - средней, III КВ - умеренно высокой, IV КВ - высокой проницаемости по Na+. IV КВ Na+-Li+-ПТ - мембранные нарушения («мембранный дефект»). Цель исследования - сравнительное изучение влияния новых БАВ С14 (трифенилтетрадецилфосфония бромида) и С16 (трибутилгексадецилфосфония бромида) на проницаемость мембран клеток по Na+ путём определения скорости Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита с позиции её генетически особого исходного состояния, в данным случае - у людей с исходно высокой проницаемостью по Na+, то есть имеющих генетически детерминированные мембранные нарушения (по Ю.В. Постнову). На основе полученных данных будет проводиться выбор БАВ для создания лекарственной формы с антибактериальным и фунгицидным действием, наиболее эффективной для людей IV КВ скорости Na+-Li+-ПТ. Исследована кровь 8 здоровых добровольцев, относящихся к IV КВ популяционного распределения величин скорости Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита (лица с высокой проницаемостью по Na+). Ранее нами были подобраны параметры определения скорости Na+-Li+-ПТ в мембране эрит­роцита применительно к задачам исследования и концентраций веществ для исследования in vitro [5-7], на что был получен патент [10]. Изучали влияние различных концентраций исследуемых веществ на скорость Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита in vitro. Определение скорости Na+-Li+-ПТ в мембране проводили по методу M. Canessa и соавт. [13], при котором изучают (путём определения концентрации ионов) обмен внутриклеточного лития в загруженных этим ионом клетках на внеклеточный натрий и магний из среды инкубации. Концентрацию лития регистрировали методом атомной абсорбционной спектрофотометрии в эмиссионном режиме (СА-455 ПО КОМЗ). Исследования проводили в лаборатории клеточных мембран кафедры пропедевтики внутренних болезней Казанского государственного медицинского университета (КГМУ) и в лаборатории спектроскопии кафедры медицинской и биологической физики КГМУ. Кровь в количестве 3 мл забирали из вены самотёком в пластиковые пробирки, смоченные гепарином (20 ЕД на 1 мл крови), содержимое перемешивали, пробирки помещали в контейнер с тающим льдом. Максимальная скорость Na+-Li+-ПТ (V) в мик­ромолях Li на 1 л клеток (эритроцитов) в час определялась как разность между концентрациями лития в среде, богатой натрием (ANa), и в среде, свободной от натрия (AMg), через 60 мин инкубации по формуле: V = (ANa - AMg) × k, где коэффициент k=33. Исследуемые вещества в различных концентрациях вносили в среду В (среда с Na+ при 1-часовой инкубации). Исследования проводили со следующими концентрациями веществ: 0,001; 0,005; 0,01; 0,025 и 0,05 мкМ. Оценку влияния изучаемого вещества на проницаемость клеточных мембран по Na+ проводили путём подбора такой концентрации, которая не вызывала бы гемолиза эритроцитов (гемолиз определяли визуально). Средняя величина скорости Na+-Li+-ПТ у людей IV КВ - 569±5 мкМ Li. У добровольцев, принадлежащих к IV КВ скорости Na+-Li+-ПТ, при внесении исследуемых веществ в среду В были получены следующие результаты. БАВ С14 в концентрациях 0,001 и 0,005 мкМ не оказало влияния на проницаемость по Na+ (588±6 и 550±9 мкМ Li соответственно), в то же время при концентрации 0,05 мкМ проницаемость по Na+ уменьшилась (465±6* мкМ Li) (рис. 1). БАВ С16 в концентрациях 0,001 и 0,005 мкМ (668±6* и 642±5* мкМ Li), наоборот, повысило проницаемость по Na+ (рис. 2). Таким образом, изменение проницаемости клеточной мембраны по натрию под влиянием трифенилтетрадецилфосфония бромида (C14) и трибутилгексадецилфосфония бромида (C16) зависит от исходного генетически детерминированного состояния клеточной мембраны. Вещество трифенилтетрадецилфосфония бромид в концентрации 0,05 мкМ уменьшило скорость Na+-Li+-ПТ до 465 мкМ Li (на 8,2%), вещество трибутилгексадецилфосфония бромид при концентрации 0,001 мкМ повысило скорость Na+-Li+-ПТ до 668 мкМ Li (на 11,7%), при концентрации 0,005 мкМ - до 642 мкМ Li (на 11,3%). Более низкие концентрации (0,001-0,025 мкМ) трифенилтетрадецилфосфония бромида не оказывали существенного влияния на проницаемость клеточной мембраны для Na+, а более высокая концентрация трибутилгексадецилфосфония бромида (0,01 мкМ) не оказала влияния на проницаемость клеточной мембраны для Na+. Поясним, что мембранные нарушения по Ю.В. Постнову представляют собой определённую цепь событий и структурно-функциональных изменений в клетке, к которым относятся: - динамические мутации и модификация функций генов, кодирующих структуру мембранных белков (в том числе переносчиков ионов); - изменение в фосфатидилинозитной трансмембранной сигнальной системе клеток; - повышение активности протеинкиназы С; - усиление цитоскелет-зависимых реакций и фосфорилирования некоторых белков; - повышение микровязкости липидного бислоя; - увеличение скорости Na+/H+-, Na+/Na+-обменов и Na+,K+-котранспорта; - понижение величины трансмембранного потенциала; - увеличение скорости входа Ca2+ в клетку; - уменьшение Ca2+-связывающей способности внутренней поверхности плазматической мембраны; - уменьшение кальмодулин-стимулируемой компоненты АТФ-зависимого транспорта Ca2+; - повышение концентрации свободных Ca2+ и Na+ в клетке; - повышение рН в цитоплазме (защелачивание клетки); - изменение преобразования энергии в митоходриях с уменьшением синтеза АТФ. Результатом мембранных нарушений и их главной составляющей - избыточного накоп­ления внутриклеточного Ca2+ - является клеточный ресетинг, то есть механизм клеточной адаптации, предохраняющий и сохраняющий специфическую функцию клеток в условиях хронического повышения концентраций цитоплазматического Ca2+. Отметим, что большая скорость Na+-Li+-ПТ - маркёр мембранных нарушений, так как физиологическое значение Na+-Li+-ПТ пока остаётся неизвестным, скорее всего, оно совсем незначимо. Таким образом, у исследуемых, принадлежащих к IV КВ скорости Na+-Li+-ПТ, БАВ С14 в дозе 0,05 мкМ уменьшает проницаемость мембраны клетки по Na+, БАВ С16 в концентрациях 0,001 и 0,005 мкМ повышает проницаемость мембраны клетки по Na+. ВЫВОДЫ 1. Изменение проницаемости клеточной мембраны по Na+ под влиянием веществ трифенилтетрадецилфосфония бромида (С14) и трибутилгексадецилфосфония бромида (С16) зависит от исходного генетически детерминированного состояния клеточной мембраны. 2. Трифенилтетрадецилфосфония бромид (С14) уменьшает проницаемость мембран эритроцитов по Na+ у исследуемых, принадлежащих к IV квартилю скорости Na+-Li+-противотранспорта (в концентрации 0,05 мкМ). 3. Трибутилгексадецилфосфония бромид (С16) увеличивает проницаемость мембраны эрит­роцитов по Na+ у исследуемых, принадлежащих к IV квартилю скорости Na+-Li+-противотранспорта (в концентрациях 0,001 и 0,005 мкМ). 4. Для создания лекарственной формы с антибактериальным и фунгицидным действием, наиболее эффективным для индивидуумов IV квартиля скорости Na+-Li+-противотранспорта, если ставится задача увеличить проницаемость мембран, является трибутилгексадецилфосфония бромид; а если ставится задача уменьшить проницаемость мембран, то таким веществом является трифенилтетрадецилфосфония бромид.

Об авторах

Ольга Валериановна Орлова

Казанский государственный медицинский университет

Email: olqa570821@yandex.ru

Владимир Николаевич Ослопов

Казанский государственный медицинский университет

Светлана Анатольевна Сидуллина

Казанский государственный медицинский университет

Список литературы

Дополнительные файлы