Significance of glutathione peroxidases in endometrium function: facts, hypotheses, and research perspectives

Full Text

Ферменты группы глутатионпероксидаз (GPX) распространены по всему животному царству [1, 2]. Эти ферменты входят в суперсемейство тиолпероксидаз, катализирующих тиолзависимое восстановление неорганических (H2O2) и органических гидропероксидов.

Восстановленный глутатион (GSH) — тиол, который in vivo является донором электронов, вовлеченным в каталитический цикл GPX [1, 3]. Катализ восстановления гидропероксидов посредством GPX протекает в три этапа, два последних из которых являются тиолзависимыми (GSH-зависимыми); общая схема реакции выглядит следующим образом:

2 GSH + ROOH → GS-SG + H2O + ROH,

где GS-SG, ROOH и ROH означают соответственно окисленный глутатион, гидропероксид и гидроксипроизводное (в том случае, если восстанавливаемый гидропероксид H2O2 в качестве гидроксипроизводного выступает вторая молекула воды [1]). Аэробный метаболизм ведет к продукции пероксида водорода и органических гидропероксидов в тканях; GPX наряду с другими тиолпероксидазами принимает участие в регуляции уровня гидропероксидов, которые при повышенной продукции оказывают токсическое действие [4]. Среди других функций GPX — ингибирование апоптоза и воспалительных процессов, модуляция каскадов сигналинга, участие в активации транскрипционных факторов [1].

У человека различают восемь форм GPX, пять из которых (GPX1,2,3,4 и 6) являются селензависимыми, а именно содержат остаток селеноцистеина в активном центре. Селензависимые GPX преобладают у позвоночных, тогда как гомологи GPX, у которых вместо селеноцистеинового остатка в активном центре находится остаток цистеина, найдены у растений, дрожжей, простейших и бактерий. Селеновые GPX спорадически обнаруживаются у беспозвоночных, таких как членистоногие и трематоды; селеноцистеин-содержащая GPX также найдена у зеленых водорослей [1].

«Классическая», или цитоплазматическая, GPX (GPX1) состоит из четырех субъединиц, функционирует внутри клеток тканей и является необходимой в защите от генерализованного окислительного стресса. Мыши, мутантные по обоим аллелям гена Gpx1, гибнут при остром окислительном стрессе независимо от обеспечения организма селеном, тогда как мыши, имеющие аллели дикого типа, выживают в этих условиях при обеспечении селеном [5].

GPX желудочно-кишечного тракта (GPX2) — цитозольный гомотетрамер, сходный с GPX1. Экспрессируется главным образом в эпителии пищеварительного тракта, включая эпителий пищевода. У человека экспрессируется также и в печени. Наибольшие концентрации GPX2 найдены у основания крипт кишечника. В развивающемся эмбрионе экспрессия мРНК Gpx2 преобладает в быстрорастущих тканях. Очень вероятно, что функции GPX2 тесно связаны с пролиферацией тканей [5, 6].

GPX плазмы, или экстраклеточная GPX (GPX3), как и многие белки плазмы крови, является гликопротеином. Так же как GPX1 и GPX2, это гомотетрамерный фермент. Кроме плазмы крови GPX3 обнаруживается в других жидкостях тела, в том числе в амниотической жидкости. Основной источник секреции GPX3 — почки. GPX3, секретированная почками, обладает способностью связываться с базальными мембранами эпителиальных тканей в других органах. Для плазмы крови характерны низкие концентрации GSH, и поэтому предполагается, что GPX3 не может эффективно с ним взаимодействовать. Функции GPX3 во многом остаются загадкой. Гиперметилирование промотора гена Gpx3 встречается в подавляющем большинстве образцов при некоторых видах онкологических заболеваний, включая рак эндометрия и простаты [5, 7].

GPX гидроперекисей фосфолипидов (GPX4) — мономерный белок, существует в трех изоформах (цитозольная, митохондриальная и GPX4 ядер клеток спермы), синтезирующихся с одного и того же гена за счет наличия альтернативных транскрипционных стартов. Цитозольная изоформа экспрессируется во всех тканях, тогда как остальные две — преимущественно в семенниках. Системный нокаут всего гена Gpx4 летален (без цитозольной GPX4 невозможен нормальный эмбриогенез), но при нокауте, приводящем к отсутствию митохондриальной формы, мыши полностью жизнеспособны (правда, самцы при этом полностью инфертильны). Цитозольная GPX4 важна не только в эмбриогенезе, она выполняет нейропротекторную функцию у взрослых, возможно, благодаря своему высокому сродству к гидроперекисям липидов [5].

GPX5 — гомотетрамерная неселеновая GPX, специфичная для придатков семенников (образуется в эпителии головки придатка семенника), ее ближайший гомолог — GPX3, вместе с которой они составляют более 95 % мРНК и белков GPX в эпидидимисе. GPX5 секретируется в лумен эпидидимиса, связывается с головками сперматозоидов и предотвращает их повреждение гидропероксидами. Возможно, GPX5 предотвращает преждевременную реакцию акросом сперматозоидов во время их хранения в хвосте придатка яичка [5, 8].

GPX6 — гомотетрамер, также гомолог GPX3, селенопротеин у человека и неселеновая GPX у грызунов и других животных. Экспрессия Gpx6 выявлена в эмбрионах мышей и в боуменовых железах под обонятельным эпителием. О функциях GPX6 не известно ничего определенного [5].

GPX7 — мономерная неселеновая GPX гидроперекисей фосфолипидов, гомологичная селеновой GPX4. Это белок цитозоля и лумена эндоплазматического ретикулума, не тканеспецифичен. GPX8 — GPX, по своим структурным характеристикам также относимая к белкам эндоплазматического ретикулума. Предполагается, что GPX7 и GPX8 участвуют в фолдинге белков, включающем в себя формирование дисульфидных связей [5].

Строгая зависимость функционирования селензависимых GPX от GSH характерна не для всех ферментов этого семейства. Хотя GPX принято называть глутатионзависимыми ферментами, GPX3 (секретируемая GPX) хорошо функционирует как тиолпероксидаза с широкой тиоловой специфичностью и может использовать цистеин, тиоредоксин и глутаредоксин вместо GSH [3, 9], становясь полностью независимой от GSH в своем каталитическом цикле при наличии других тиолов в среде. Статистически обосновано (на фракциях белков плазмы крови), что GPX3 способна использовать гомоцистеин (HcySH) вместо GSH; опять же присутствие GSH в среде совершенно не требуется [10]. Для GPX4 также характерна способность использовать другие тиоловые восстановители вместо GSH — белки хроматина, цистеинбогатые белки, связанные с митохондриями клеток спермы, и даже саму GPX4 в качестве тиолового восстановителя. При этом, правда, GPX4 не способна использовать для своей функции тиоредоксин. Внутриклеточная GPX1, напротив, довольно строго специфична к GSH, но в условиях недостатка GSH GPX1 успешно использует его предшественник (гамма-глутамилцистеин) [5]. В старых работах, когда еще не было известно вышеперечисленное разнообразие GPX, для GPX митохондрий печени было установлено, что на одном из двух тиолзависимых этапов каталитической реакции GPX строго специфична к GSH; на другом тиолзависимом этапе GSH может быть заменен на другой тиол [11, 12].

Как GPX могут функционировать и некоторые другие белки, не относимые к данному семейству: это пероксиредоксины, входящие вместе с GPX в суперсемейство тиолпероксидаз, а также глутатионтрансферазы, селенопротеин Р и даже сывороточный альбумин. Последние три из упомянутых белков и групп ферментов, правда, имеют иную, более узкую субстратную специфичность по отношению к гидропероксидам в тиолпероксидазной реакции [3, 13–15].

Исследования экспрессии глутатионпероксидаз в ткани эндометрия женщин

Эндометрий человека — сложная ткань, подвергающаяся циклическим изменениям, что требует взаимодействия друг с другом сотен биохимических факторов. В идеале нормальный эндометрий человека имеет 28-дневный цикл изменений, контролируемых половыми стероидными гормонами — эстрогеном и прогестероном. Стероидные гормоны осуществляют свое действие посредством связывания со своими рецепторами (эстрогеновые рецепторы-α и -β (ER-α и ER-β) и рецептор прогестерона (PR)). Рецепторы лиганд-зависимым путем регулируют транскрипцию генов в клетках эндометрия. Для запуска транскрипции рецепторы образуют гомодимеры и связываются с соответствующим гормоном; образовавшийся комплекс связывается со стероид-реактивным участком ДНК (стероид-реактивным элементом), регулирующим ген-мишень, что активирует транскрипционные факторы и инициирует транскрипцию гена. Вышеописанные события происходят в стромальных клетках эндометрия, которые в ответ на стероидный стимул продуцируют паракринные факторы, приводящие к митозам клеток эпителия матки [16].

Существует ряд работ по изучению транскрипционного профиля эндометрия человека в ходе менструального цикла и при нарушениях рецептивности эндометрия; при этом среди генов ферментов группы GPX исследователи наблюдают существенные изменения в активности гена GPX3 [16–20]. GPX3-транскрипт имеет очень низкий уровень в эндометриальной ткани в пролиферативной фазе менструального цикла, тогда как в секреторной фазе, когда доминирует уровень прогестерона, уровень GPX3-транскрипта повышается в десятки раз [16]. При этом в промоторной части гена GPX3 идентифицируется три вероятных прогестерон-реактивных элемента и два вероятных эстроген-реактивных элемента. (Аналогичным образом у других генов, транскрибируемых преимущественно в секреторной фазе, количество вероятных прогестерон-реактивных элементов преобладает над количеством вероятных эстроген-реактивных элементов.) Данные факты свидетельствуют в пользу того, что ген GPX3 позитивно регулируется прогестероном [16]. Поскольку уровень экспрессии гена GPX3 растет и после времени имплантации (т. е. далее после 7-го дня, считая от времени пика секреции лютеинизирующего гормона), есть мнение, что экспрессия GPX3 в эндометрии важна больше в процессах, связанных с менструацией нежели с имплантацией эмбриона [19].

Свободнорадикальные повреждения вовлечены в патофизиологию многих органов и тканей, включая эндометрий. Биосинтез секретируемой GPX, GPX3, устраняющей продукты перекисного окисления биомолекул во внеклеточной среде, зависит от наличия селена. При этом имеются данные о том, что дефицит селена ассоциирован со спонтанными абортами и бесплодием [21]. На основании этих данных и совокупности перечисленных данных о GPX3 остается обоснованным предположение, что GPX3 эндометрия функционирует в периимплантационный период для защиты развивающегося эмбриона от окислительных повреждений, в том числе для обеспечения его безопасной (в этом же смысле) имплантации в стенку матки [16].

Другим ферментом семейства GPX, для которого показаны циклические изменения экспрессии в эндометрии в ходе менструального цикла, является GPX1 [16, 22]. Экспрессия GPX1 была идентифицирована в поверхностных и железистых эпителиальных клетках иммуногистохимически с использованием поликлональных антител к белку-ферменту. Уровень экспрессии GPX1 в железистых клетках эпителия был низким в ранней пролиферативной фазе, затем постепенно увеличивался, достигал максимума в ранней секреторной фазе и снижался к концу секреторной фазы. В поверхностном эпителии динамика экспрессии была аналогичной. Получается, что, в отличие от экспрессии GPX3, уровень мРНК которой высок в период имплантации, уровень экспрессии GPX1 в данный период уже снижается. Вероятно, цикличность продукции GPX1 в эпителии эндометрия и цикличность экспрессии GPX3 эндометрием имеют существенные различия в функциональном отношении.

Исследования экспрессии глутатионпероксидаз в ткани эндометрия лабораторных животных

В 2014 г. в FEBS Letters была опубликована работа [23], выполненная главным образом на мышах, указывающая на тесную связь экспрессии GPX3 в стромальных клетках эндометрия с децидуализацией эндометрия и имплантацией бластоцисты в стенку матки. Результаты этой работы объясняют механизмы, по которым происходит регуляция экспрессии GPX3 в эндометрии.

Заранее оговоримся, что у грызунов имплантация эмбриона в стенку матки у разных особей может происходить очень несинхронно, начиная с начала 4-го дня беременности. Даже в конце 5-го дня нормальной беременности имплантация может все еще не произойти [24]. Но, вероятно, мыши, используемые в работе [23], были очень сходны между собой по времени имплантации при нормальной беременности. С использованием меченной дигоксигенином кРНК (комплементарной к мРНК Gpx3 (метод гибридизации in situ)) было установлено, что мРНК Gpx3 не экспрессируется в регистрируемых количествах с 1-го по 4-й день нормальной беременности. Начиная с 5-го дня мРНК Gpx3 проявляется в строме эндометрия ближе к просвету матки, причем непосредственно вокруг имплантирующейся бластоцисты. В последующие дни беременности экспрессия мРНК Gpx3 усиливается и распространяется по строме в процессе децидуализации. В ходе количественной оценки методом ПЦР (ПЦР в реальном времени) установлено, что к 8-му дню беременности экспрессия мРНК Gpx3 в эндометрии возрастает в сотни раз по сравнению с 4-м днем (при использовании этого метода в эндометрии на 4-й день беременности регистрируется некоторый (не нулевой) уровень мРНК Gpx3, принятый за единицу). Экспрессия мРНК Gpx4 тоже повышается к 8-му дню по сравнению с уровнями в 4-й и 5-й дни, но не столь значительно, а экспрессия мРНК Gpx2, наоборот, к 8-му дню сильно снижается. Выявленное авторами увеличение экспрессии мРНК Gpx1 на 8-й день беременности, возможно, не является статистически значимым, поскольку из работы не ясно, каким методом пользовались авторы для статистических сравнений, а прирост экспрессии по сравнению с 4-м и 5-м днями сравнительно мал. Экспрессия мРНК Gpx5, Gpx6 и Gpx7 в эндометрии была очень слабой в исследуемый период (1–8-й дни беременности) [23].

При задержке имплантации с последующей ее активацией эстрогеном опять-таки выявлено увеличение экспрессии мРНК Gpx3 методом гибридизации in situ до хорошо детектируемого уровня в строме, окружающей имплантирующийся эмбрион. При искусственной децидуализации посредством инъекции масла в рог матки также выявлен высокий уровень экспрессии мРНК Gpx3 в клетках стромы. В роге матки, который не подвергался инъекции, экспрессия мРНК Gpx3 регистрировалась в поверхностном эпителии эндометрия и в меньшей степени в железистом эпителии, но не в клетках стромы [23].

На овариэктомированных мышах и на эндометриальных стромальных клетках in vitro было установлено, что прогестерон усиливает экспрессию мРНК Gpx3; этот эффект опосредован рецептором прогестерона и транскрипционным фактором HIF1α. При децидуализации in vitro (при обработке прогестероном вместе с эстрогеном) экспрессия мРНК Gpx3 усиливается в клетках стромы в несколько десятков раз в течение 96 часов от начала обработки. В опытах in vitro установлена необходимость добавления соединений селена (селенит натрия — в концентрациях порядка 0,1 мкМ) в культуральную среду с клетками эндометрия для экспрессии в них белка GPX3, что понятно, поскольку селен включается в состав молекулы фермента при трансляции (без него белковая молекула не синтезируется [25]). Получены данные, свидетельствующие в пользу того, что GPX3 снижает концентрацию пероксида водорода в строме [23].

В других исследованиях показано наличие GPX3 в жидкостях, окружающих развивающийся эмбрион. Gpx3 экспрессируется в тканях на контакте развивающегося эмбриона и материнского организма — материнском децидууме, эндодерме желточного мешка и в эмбриональной коже [21].

Ранние этапы беременности уязвимы для стрессовых состояний, что может выражаться как в нарушении имплантации, так и в патологиях развития раннего эмбриона. Реактивные формы кислорода часто вовлечены в возникновение различных патологий, включая инфертильность. Как видно из рассмотренных данных, среди GPX, устраняющих продукты реакций свободнорадикальных соединений кислорода, в эндометриальной ткани во время беременности, по-видимому, основную роль в защите развивающегося плода (в этом смысле) со стороны материнского организма играет секретируемая эндометрием GPX3. Большинство генов других ферментов группы GPX не претерпевают столь серьезных изменений экспрессии в эндометрии во время беременности, как это имеет место в случае Gpx3; сопоставимого внимания, вероятно, заслуживает лишь факт сильного снижения экспрессии Gpx2, отмеченный в работе X. Xu et al [23].

Хотя Gpx3 обильно экспрессируется в децидууме, мыши, генетически дефектные по обоим аллелям Gpx3, не проявляют отклонений в репродуктивной функции по сравнению с мышами дикого типа. При этом неизвестно, что происходит с другими GPX в эндометрии, компенсируют ли они отсутствие GPX3 у таких генетически дефектных мышей. В отношении одного маркера децидуализации, белка DTPRP, известно, что мыши, гомозиготные по его выключенному гену, Dtprp, жизнеспособны, фертильны и дают приплод нормальной численности — явление, сходное с тем, что наблюдается при выключенном гене Gpx3. Однако у Dtprp-дефектных мышей протекание беременности уязвимо к гипоксии — количество погибших и подвергшихся резорбции зародышей значимо больше в условиях гипоксии, чем у мышей дикого типа в тех же условиях. Это свидетельствует об утрате материнской способности адаптироваться к влиянию стрессирующего фактора в ходе беременности. Возможно, в случае утраты нормальных аллелей Gpx3 могут быть получены аналогичные результаты в условиях стресса. GPX3, возможно, является белком, присутствие которого в эндометрии необходимо для сохранения беременности в условиях гипоксии, в стрессовых условиях. На возможность этого также указывает известный факт зависимости экспрессии Gpx3 от гипоксия-индуцибельного фактора HIF1α [23, 26].

Перспективы определения активности и исследования роли глутатионпероксидаз в функционировании эндометрия

Обратим внимание на то, что в большинстве вышеперечисленных работ для изучения была доступна экспрессия генов разных GPX; также регистрировались уровни белков GPX. Об изменениях ферментативной активности судили косвенно [23]; при этом не проводились полноценные количественные измерения активности различных форм GPX как скорости каталитической реакции, отнесенной к количеству биоматериала (или конкретнее — белка-фермента). Между тем именно каталитическая активность является показателем функциональной активности фермента, а не само количество белка-фермента, измеренное, например, иммунохимически, и тем более не уровень экспрессии его гена.

В наших пилотных исследованиях выявлено, что как в гомогенатах цельной матки, так и в гомогенатах эндометрия лабораторных животных принципиально возможно определять ферментативную активность тиолпероксидаз, причем можно подобрать условия, в которых определяется очень высокая активность. В цельной матке мышей тиолпероксидазная активность (Me (q1–q3)) составляет 154 (122–214) нмоль HcySH/мин/мг белка (субстраты — HcySH (0,9–1,1 мМ) и трет-бутилгидропероксид (1,6 мМ), рН 8,5, t = 37 °C; другие параметры метода см. в работе [27]). Тиолпероксидазная активность (Me (q1–q3)) в эндометрии матки крыс составляет 112 (98–112) нмоль HcySH/мин/мг белка (субстраты — HcySH (1,1 мМ) и пероксид водорода (0,192 мМ), рН 8,5, t = 37 °C; использовался метод из работы [10]). Отметим, что в случае сочетания HcySH и пероксида водорода нами получено статистическое подтверждение того, что такая тиолпероксидазная активность принадлежит ферменту GPX3 [10] (при этом использовалась плазма крови в качестве источника ферментативной активности). Цистеин, также являясь хорошим субстратом для GPX3, аналогичным образом может быть использован для определения активности этой формы GPX [9, 10, 28, 29].

Как показано в вышеизложенном обзоре, существуют данные, служащие основаниями для гипотезы о том, что GPX3 является ферментом, активность которого служит фактором, обеспечивающим успешную имплантацию бластоцисты в стенку матки и последующую защиту эмбриона от окислительного стресса. В связи с этим перспективным подходом для проверки этой гипотезы являются оценка размера приплода у животных, содержащихся на селенодефицитной диете в периимплантационный период и подвергающихся воздействию стрессовых факторов, и оценка гомоцистеинпероксидазной активности в эндометрии в тех же условиях и в тот же период. Как известно, помещение генетически нормальных мышей в условия гипобарической гипоксии (концентрация кислорода — 11 %) с 5,5-го по 11,5-й день беременности приводит к гибели части эмбрионов [26]. Перспективной представляется попытка предотвращения гибели имплантировавшихся эмбрионов в данных условиях за счет применения препаратов селена. Оценка гомоцистеинпероксидазной активности в ткани стенки матки, проводимая в параллельной группе в тех же условиях, позволит оценить связь между изменениями в количестве погибших эмбрионов и активностью GPX3.

Актуально также провести измерение динамики активности GPX3 в эндометрии при искусственной задержке и активации имплантации, а также в децидуоме, вызванной инъекцией масла в рог матки животного. Это также, вероятно, позволит дополнительно подтвердить увеличение активности фермента при децидуализации (напомним, что ранее аналогичные опыты проводились с изучением экспрессии гена Gpx3, а не с изучением активности фермента GPX3 [23]).

Как уже упоминалось выше, перспективным является получение нокаутных животных по гену Gpx3 с последующей оценкой влияния гипоксии в пери- или постимплантационный период на исход беременности. Контроль над гомоцистеинпероксидазной активностью (с высокой вероятностью, свойственной ферменту GPX3) в ткани стенки матки остается актуальным и в таких экспериментах, несмотря на генетический дефект по Gpx3. Таким образом может быть получен ответ на вопрос об активации компенсаторных биохимических механизмов в условиях физиологического стресса во время беременности при отсутствии данного фермента.

Такого рода исследования не только могут подтвердить необходимость минимизации физиологического стресса в периимплантационный и ранний постимплантационный периоды, вскрывая при этом механизмы его негативного влияния на исход беременности, но и могут послужить обоснованием увеличения потребления физиологически безопасных соединений селена в рационе в период ранней беременности (в особенности, если в силу обстоятельств не удается полностью устранить стрессовые состояния в организме матери).

Поскольку получены свидетельства того, что экспрессия Gpx3 в эндометрии лабораторных животных и человека активируется прогестероном [16, 23], перспективным представляется определение активности GPX3 при проверке гестагенной активности новых синтетических стероидов в экспериментах in vivo и в культуре клеток эндометрия (при обязательном добавлении соединений селена в культуральную среду). Уровень активации GPX3 может послужить показателем эффективности препаратов с предполагаемой гестагенной активностью.

Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Авторы признательны ведущему научному сотруднику группы фармакологии НИИ АГиР им. Д.О. Отта, канд. биол. наук М.А. Петросян и директору Центра фармакологических исследований СПХФА, канд. биол. наук Д.Ю. Ивкину за предоставленную возможность выполнения проверочных опытов по оценке гомоцистеинпероксидазной активности в эндометрии лабораторных животных.

About the authors

Alexey V Razygraev

St Petersburg State Chemical-Pharmaceutical Academy

Author for correspondence.
Email: alexeyrh@mail.ru

scientific researcher

Russian Federation, Saint Peterburg, Russia

Mariya O Matrosova

Peter the Great Saint Petersburg Polytechnic University

Email: rolli402018@gmail.com

student

Russian Federation, Saint Peterburg, Russia

Irina A Titovich

St Petersburg State Chemical-Pharmaceutical Academy

Email: irina.titovich@pharminnotech.com

graduate student

Russian Federation, Saint Peterburg, Russia

References

Supplementary files