Evaluation of oxidative stress parameters and activation of intracellular signaling pathways in the placenta in experimental methionine-induced hyperhomocysteinemia

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Риск развития преэклампсии и задержки внутриутробного развития, а также нарушений развития центральной нервной системы плода в ряде случаев ассоциирован с повышением в крови матери содержания аминокислоты гомоцистеина — так называемой материнской гипергомоцистеинемией (ГГЦ) [1–3]. В клинической практике ГГЦ рассматривают преимущественно как маркер дефицита фолатов, с ним связывают развитие осложнений беременности и дефекты нервной трубки плода. При этом зачастую даже в отсутствие оценки содержания фолатов в крови женщинам в период беременности назначают прием фолиевой кислоты, предполагая либо восполнить вероятный дефицит, либо скомпенсировать нарушение работы фолатного цикла, обусловленное возможным наличием полиморфизма генов ферментов одноуглеродного метаболизма. Однако подобный бесконтрольный подход не гарантирует решение проблемы ГГЦ — отдельного, нередко фолат-независимого фактора риска акушерских осложнений [4, 5]. Вместе с тем не выяснено посредством каких механизмов гомоцистеин и его метаболиты, обладающие цитотоксическим потенциалом, при материнской ГГЦ могут негативно влиять на плаценту [6]. Общее итоговое воздействие различных неблагоприятных факторов обычно проявляется в недостаточном кровоснабжении плаценты [7]. При этом морфофункциональные нарушения в плаценте могут привести к неблагоприятному исходу программирования развития плода и способствовать формированию когнитивных расстройств в постнатальной жизни.

Несмотря на решающее значение клинических исследований в выявлении участия патогенных факторов, таких как ГГЦ, в развитии акушерских осложнений, существуют очевидные ограничения, не позволяющие подробно изучить многие механизмы, вовлеченные в тот или иной синдром. Кроме того, данные, полученные в ходе исследований на людях, часто являются коррелятивными и не позволяют установить причинно-следственные связи. Именно поэтому исследования проводят in vitro на клеточных культурах клеток эндотелия, трофобласта, децидуальных стромальных клеток, а также in vivo с использованием экспериментальных моделей ГГЦ, что позволяет ученым наблюдать множество сигнальных путей для подтверждения выдвинутых гипотез.

Модель ГГЦ с метиониновой нагрузкой активно используют при изучении нервной ткани у взрослых животных, особенно в контексте последствий эксайтотоксических эффектов воздействия ГГЦ. Значительно меньше данных получено при исследовании влияния экспериментальной ГГЦ на плаценту [8–10]. Данная модель ГГЦ приводит к зависимому от срока беременности дисбалансу факторов, участвующих в процессах ангиогенеза в плаценте и, соответственно, недостаточному развитию плацентарной сосудистой сети. Снижение кровотока, как известно, вызывает в плаценте состояние гипоксии, оксидативного стресса (ОС), снижение пролиферативной активности и увеличение клеточной гибели в различных отделах плаценты, задержку роста плаценты и уменьшение площади поверхности обмена между матерью и плодом, приводящие в итоге к нарушению транспортной и других плацентарных функций [11], что частично подтверждено на модели метионин-индуцированной ГГЦ [8, 12].

В настоящее время хорошо изучены механизмы развития ОС под воздействием гомоцистеина, что достаточно подробно представлено во многих обзорах [13–15]. При этом ряд вопросов, связанных с особенностями развития ОС и его последствий в плаценте при ГГЦ, остаются малоизученными. Так, например, отсутствует информация относительно того, посредством каких сигнальных путей ОС при ГГЦ может привести к изменению факторов ангиогенеза в плаценте. Кроме того, в целом, несмотря на то что развитие ОС в плаценте ассоциировано с неблагоприятными исходами беременности, связь между активными формами кислорода (АФК) и развитием сосудов до конца не определена. Выяснение того, посредством каких сигнальных путей ОС вызывает плацентарные нарушения вследствие ГГЦ у матери, будет способствовать лучшему пониманию специфических клеточных путей, связывающих факторы стресса с плацентарной дисфункцией.

Цель исследования

Оценить показатели оксидативного стресса и активации внутриклеточных сигнальных путей в плаценте при экспериментальной метионин-индуцированной ГГЦ.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено рандомизированное клиническое исследование.

Условия проведения исследования

Исследование выполнено в НИИ АГиР им. Д.О. Отта с апреля по июнь 2025 г.

Критерии соотвествия (отбора)

Эксперимент проводили на самках крыс линии Wistar (биопитомник «СМК Стезар», Владимирская область) в возрасте 3–4 мес., массой 180–220 г, со стабильным эстральным циклом, равным 4 дням.

Описание вмешательства

Самок крыс линии Wistar содержали в виварии с искусственной вентиляцией и контролируемым 12-часовым циклом света и темноты при постоянной комнатной температуре. Животные получали стандартный лабораторный корм и воду ad libitum.

Подсадку самцов к самкам осуществляли на стадии проэструса, первым днем беременности (Е1) считали следующий день после обнаружения сперматозоидов во влагалищном мазке. Для создания модели экспериментальной материнской ГГЦ использовали разработанный авторами метод, основанный на дозированной метиониновой нагрузке, создаваемой путем принудительного ежедневного перорального введения экспериментальным животным водного раствора L-метионина в дозе 0,6 г/кг массы животного, начиная с 4-го дня беременности (Е4) до вывода из эксперимента [16]. Контрольным животным в течение того же периода времени ежедневно перорально вводили воду.

На 14-й (Е14) и 20-й (Е20) день беременности самок обеих групп выводили из эксперимента. Для иммуногистохимического исследования плаценты сразу помещали в 10% нейтральный забуференный формалин. Ткани плаценты для биохимического анализа хранили при температуре −80℃. Перед началом биохимического анализа замороженную ткань плаценты отмывали от крови в холодном 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,4) и гомогенизировали в буфере RIPA (50 мМ трис-гидрохлорида с pH 8,1; 1% Тритон Х-100; 0,1% додецилсульфат натрия; 0,5% дезоксихолат натрия; 1 мM этилендиаминтетрауксусной кислоты; 150 мM хлорида натрия), содержащем коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз. Затем ткань плаценты центрифугировали 20 мин при 16 000 g при температуре +4℃, супернатант подвергали анализу. От каждой самки в группе для анализа отбирали по одной плаценте. Концентрацию общего белка в пробах оценивали методом Бредфорда [17] на спектрофотометре NanoDrop One (Thermo Scientific, США).

При экспериментах соблюдали требования, сформулированные в Директивах Совета европейского сообщества (86/609/ЕЕС) об использовании животных для экспериментальных исследований.

Исходы исследования

Основной исход

Предполагаемая гипотеза заключалась в том, что несмотря на сохранение беременности, умеренная ГГЦ посредством усиления окислительного стресса, подтверждаемого увеличением содержания малонового диальдегида и сижением содержания NRF2, приводит к активации стресс-индуцированного пути митоген-активируемой протеинкиназы (p38 MAPK) и увеличению содержания p53 в плаценте.

Дополнительные исходы

Патологическое воздействие ГГЦ на плаценту приводит к дисрегуляции молекулярных сигналов, необходимых для нормального развития плацентарных структур. В результате могут быть активированы программы клеточной гибели, что экспериментально подтверждает повышенная экспрессия апоптоз-индуцирующего фактора (AIF).

Методы регистрании исходов

Оценка показателей оксидативного стресса. Перекисное окисление липидов оценивали путем определения малонового диальдегида по стандартной методике с использованием тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Количество ТБК-активных продуктов в бутанольной фракции измеряли на длинах волн 535 и 580 нм [18].

Для определения активности каталазы использовали модифицированный метод Гота, основанный на определении количества стойкого окрашенного комплекса, образующегося в результате взаимодействия раствора перекиси водорода с раствором молибдата аммония. Максимум поглощения окрашенного комплекса находится при длине волны 374 нм [19].

Оценку антирадикальной активности сыворотки крови проводили по калибровочной кривой спектрофотометрическим методом с использованием стабильного хромогенрадикала 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (Sigma-Aldrich Chem. Co., США) при 517 нм. В качестве стандартного антиоксиданта использовали аскорбиновую кислоту, соответственно, антирадикальную активность выражали в микромолях-эквивалентах аскорбиновый кислоты на грамм общего белка (мкмоль-экв./г) [20]

Иммуноблотинг. Методом иммуноблотинга оценивали содержание сигнального белка и активатора транскрипции 3 (STAT3), фактора 2, подобного ядерному фактору эритроидного происхождения 2 (NRF2), белка p53, p38 MAPK и ее фосфорилированной формы (p-p38 MAPK). Образцы, содержащие по 50 мкг белка, разделяли в 10% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях по Лэммли и переносили на мембрану из поливинилиденфторида. Мембраны блокировали 3% раствором альбумина (Sigma-Aldrich Chem. Co., США) в трис-буферизированном солевом растворе с детергентом Твин-20 (50 мM трис-гидрохлорида; 150 мM хлогида натрия; 0,1% Tween-20). Содержание белков интереса в исследуемых образцах выявляли с помощью специфичных первичных антител: STAT3 (D3Z2G) (rabbit mAb, 1:1000, Cell Signaling, США), NRF2 (D1Z9C) (rabbit mAb, 1:1000, Cell Signaling, США), p53 (DO-1) (mouse mAb, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, США), p38 MAPK (D13E1) (rabbit mAb, 1:1000, Cell Signaling, США), p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (28B10) (mouse mAb, 1:1000, Cell Signaling, США), β-Actin (rabbit mAb, 1:1000, Cell Signaling, США). Инкубацию проводили при температуре +4℃ в течение ночи. После инкубации с соответствующими HRP¹-конъюгированными козьими антителами (1:1000, BioRad, США) сигналы визуализировали, используя усиленную хемилюминесценцию (Clarity Western ECL Substrate, BioRad, США). Мембраны сканировали в гель-документирующей системе ChemiDoc Touch Imaging System (BioRad, США), интенсивность полос определяли при помощи программного обеспечения ImageLab (BioRad, США). Руководствуясь существующими рекомендациями по процедуре нормализации содержания белка-мишени [21], полученные данные нормализовали по содержанию либо β-Актина (β-Actin), либо общего белка в геле, определяемому с применением технологии stain-free (BioRad, США) согласно инструкции производителя.

Иммуногистохимический анализ. После 24-часовой фиксации в 10% нейтральном забуференном формалине каждую из исследуемых плацент разрезали на три фрагмента и осуществляли гистологическую проводку с применением гистологического процессора Sakura Tissue-tek VIP 5 (Sakura Finetek Japan Co., Ltd., Япония). Далее при помощи модульной системы заливки парафином Medite TES 99 (Medite GmbH, Германия) формировали парафиновые блоки, и из них методом микротомирования получали срезы толщиной 3–4 мкм. Иммуногистохимическое исследование включало оценку экспрессии AIF с использованием моноклональных кроличьих антител к AIF (клон SZ05-01) в стандартном разведении 1:1000 по протоколу производителя HHBiotechnology (Китай). Количественную оценку результатов имунногистохимической реакции проводили на микрофотографиях, полученных с помощью системы фиксации микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Olympus Olympus BX46 (Olympus Co., Япония) с использованием программного обеспечения. Экспрессию маркеров рассчитывали с помощью программы «ВидеоТесТ-Морфология 5.2» (ООО «ВидеоТесТ», Россия). В каждом срезе в 10 полях зрения оценивали следующие показатели: оптическую плотность экспрессии (величина вычислялась автоматически в соответствии с законом Бугера–Ламберта–Бера); относительную площадь экспрессии [S, отношение площади иммунопозитивных клеток к общей площади препарата в процентах: S=(S_{позитив}/S_общ)×100, где S_{позитив} — отношение площади иммунопозитивных клеток; S_общ — общая площадь препарата).

Статистические процедуры

Для обеспечения высокой статистической мощности при обнаружении умеренных эффектов на оба срока беременности в контрольной и экспериментальной группах было включено по 10 животных (всего n=40), что характеризует стандартный и обоснованный размер выборки в исследованиях на грызунах.

Для выявления статистически значимых различий данные обрабатывали с помощью программы Statistica 10.0 (StatSoft, США). Для сравнения исследованных показателей использован t-тест для независимых выборок либо непараметрический критерий Манна–Уитни. Выбор статистического метода основан на оценке характера распределения признаков. Данные проверены на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро–Уилка. Расчет корреляций проводили методом корреляции Пирсона. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Формирование выборки

У самок крыс до введения в эксперимент оценивали эстральные циклы, после чего подсаживали самцов к самкам с нормальным эстральным циклом (3 последовательных 4-дневных цикла) в стадию проэсруса. После спаривания беременость подтверждали наличием сперматозоидов во влагалищном мазке. В результате в эксперимент вошли 40 беременных самок. С 4-го дня беременности посредством блоковой рандомизации они были разделены на контрольную (n=20) и подопытную (n=20) группы. Из каждой группы чать животных вывели из эксперимента на 14-ый день берменности (по 10 грызунов в контрольной и подопытной группах), остальные были выведены из эксперимента на 20-ый день беременности (по 10 грызунов в контрольной и подопытной группах). Для обеспечения независимости наблюдений у каждой самки анализировали в одной плаценте показатели окислительного стресса, молекулярные показатели, оцениваемые иммуноблотингом и отдельно AIF. Таким образом размер выборки соответсвовал количеству самок, а не плацент.

Характеристики выборки

Изучены самки крыс линии Wistar. Контрольные и подопытные животные не отличались по размеру помета, замершие плоды не обнаружены.

Основные результаты исследования

В результате оценки показателей ОС в плаценте крыс при метионин-индуцированной ГГЦ отмечено повышение содержания малонового диальдегида (маркера перекисного оксиления липидов) по сравнению с контрольным показателем как на 14-й (p < 0,05), так и на 20-й (p < 0,01) дни беременности. По активности каталазы и антирадикальной активности, характеризующей активность низкомолекулярных антиоксидантов, значимых различий между контрольными и подопытными животными ни в один из двух проанализированных сроков беременности не обнаружено (табл. 1). При этом показано наличие положительной корреляционной связи между содержанием малонового диальдегида и антирадикальной активностью в плаценте крыс на 20-й день беременности. На данном сроке в контрольной группе также обнаружена прямая корреляция содержания малонового диальдегида с активностью каталазы, отсутствующая в группе с метионин-индуцированной ГГЦ (табл. 2).

 

Таблица 1. Содержание маркеров оксидативного стресса в плаценте самок крыс на 14-й и 20-й дни беременности в норме и в модели метионин-индуцированной гипергомоцистеинемии

Table 1. Oxidative stress parameters in the placenta of pregnant rats on gestational days 14 and 20 under normal conditions and in a methionine-induced hyperhomocysteinemia model

День беременности	Показатель	Контроль	Гипергомоцистеинемия	p
14-й	Содержание малонового диальдегида, мкмоль/мг белка	16,2±1,47	21,3±1,33	0,024*
	Активность каталазы, Ед/мкг белка	3,14±0,098	3,08±0,110	0,711
	Антирадикальная активность, мкмоль-экв./г белка	0,037±0,0009	0,035±0,0015	0,32
20-й	Содержание малонового диальдегида, мкмоль/мг белка	9,8±1,13	14,1±1,34	0,007*
	Активность каталазы, Ед/мкг белка	3,50±0,105	3,38±0,082	0,361
	Антирадикальная активность, мкмоль-экв./г белка	0,058±0,0012	0,061±0,0029	0,44

Примечание. Данные представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего. *p < 0,05.

 

Таблица 2. Корреляционные взаимосвязи показателей антиоксидантной защиты и содержания малонового диальдегида в плаценте крыс

Table 2. Correlational relationships between antioxidant defense parameters and malondialdehyde level in the rat placenta

Показатель		День беременности
		14-й			20-й
		всего	контроль	ГГЦ	всего	контроль	ГГЦ
Активность каталазы	R	0,149	0,377	0,113	0,181	0,903	−0,297
	p	0,520	0,283	0,740	0,503	0,002	0,476
Антирадикальная активность	R	−0,020	0,414	−0,075	0,548	0,652	0,611
	p	0,931	0,235	0,827	0,028	0,080	0,107

Примечание. R — коэффициент корреляции Пирсона; ГГЦ — гипергомоцистеинемия.

 

На 14-й день беременности в плаценте при ГГЦ не обнаружено значимых изменений в содержании NRF2, STAT3 и p53. По отношению p-p38/p38 MAPK, характеризующему активацию пути p38 MAPK, группы также не отличались, отмечена лишь тенденция к его снижению при метиониновой нагрузке (рис. 1). При этом на 20-й день беременности в плацентах с ГГЦ было снижено содержание NRF2 и повышены содержание p53 и отношение p-p38/p38 MAPK, чем в группе контроля. В то же время общее содержание STAT3 и активация р38 MAPK при ГГЦ в плаценте не изменялись (рис. 2).

 

Рис. 1. Влияние материнской гипергомоцистеинемии на содержание внутриклеточных сигнальных молекул в плацентах крыс на 14-й день беременности: a — содержание фактора 2, подобного ядерному фактору эритроидного происхождения 2 (NRF2); b — содержание сигнального белка и активатора транскрипции (STAT3); c — содержание транскрипционного фактора p53; d — активация общей митоген-активируемой протеинкиназы p38 (p38 MAPK); e — отношение фосфорилированной и общей форм p38 MAPK (р-p38/p38 MAPK); f — репрезентативный вестерн-блот исследованных маркеров. Полосы получены методом иммуноблотинга. За условную единицу принято контрольное содержание показателя. Данные представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего. ГГЦ — гипергомоцистеинемия.

Fig. 1. Effect of maternal hyperhomocysteinemia on the levels of intracellular signaling molecules in the rat placenta on gestational day 14: a, nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2); b, signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3); c, tumor protein p53; d, p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK); e, phospho-p38/p38 MAPK ratio; f, representative Western blot images of the markers under study. The bands were obtained by immunoblotting. The control level of the marker is taken as the reference (arbitrary unit). The data are presented as the arithmetic mean and standard error of the mean. ГГЦ, hyperhomocysteinemia.

 

Рис. 2. Влияние материнской гипергомоцистеинемии на содержание внутриклеточных сигнальных молекул в плацентах крыс на 20-й день беременности: a — содержание фактора 2, подобного ядерному фактору эритроидного происхождения 2 (NRF2); b — содержание сигнального белка и активатора транскрипции (STAT3); c — содержание транскрипционного фактора p53; d — активация общей митоген-активируемой протеинкиназы p38 (p38 MAPK); e — отношение фосфорилированной и общей форм p38 MAPK (р-p38/p38 MAPK); f — репрезентативный вестерн-блот исследованных маркеров. Полосы получены методом иммуноблотинга. За условную единицу принято контрольное содержание показателя. Данные представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего. ГГЦ — гипергомоцистеинемия. *p < 0,05; **p < 0,01.

Fig. 2. Effect of maternal hyperhomocysteinemia on the levels of intracellular signaling molecules in the rat placenta on gestational day 20: a, nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2); b, signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3); c, tumor protein p53; d, p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK); e, phospho-p38/p38 MAPK ratio; f, representative Western blot images of the markers under study. The bands were obtained by immunoblotting. The control level of the marker is taken as the reference (arbitrary unit). The data are presented as the arithmetic mean and standard error of the mean. ГГЦ, hyperhomocysteinemia. *p <  0.05; **p <  0.01.

 

С использованием иммуногистохимического метода выявлено повышение содержания AIF в плаценте крыс на 20-й день беременности после метиониновой нагрузки по сравнению с контрольным показателем, что было выражено в более высоком значении относительной площади экспрессии (табл. 3, рис. 3).

 

Таблица 3. Экспрессии апоптоз-индуцирующего фактора в плаценте крыс на 20-й день беременности

Table 3. Expression of the apoptosis-inducing factor in the placenta on gestational day 20

Показатель	Контроль	Гипергомоцистеинемия	p
Площадь экспрессии, %	26,32 [24, 60; 27, 29]	36,56 [29, 26; 37, 64]	0,012
Оптическая плотность экспрессии, усл. ед.	0,160 [0, 147; 0, 187]	0,184 [0, 146; 0, 199]	0,497

Примечание. Данные представлены в виде медианы, первого и третьего квартилей.

 

Рис. 3. Экспрессии апоптоз-индуцирующего фактора в плаценте на 20-й день беременности контрольных крыс (a) и крыс с метиониновой нагрузкой (b). Увеличение ×200.

Fig. 3. Apoptosis-inducing factor expression levels in the placenta on gestational day 20 in control rats (a) and rats subjected to methionine load (b). Zoom ×200.

 

Нежелательные явления

Нежелательных явлений в ходе эксперимента не отмечено.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

При метионин-индуцированной ГГЦ у крыс на 20-й день беременности в плаценте выявлено повышение содержания малонового диальдегида, свидетельствующее об усилении оксидативного стресса, сопровождающегося подавлением транскрипционного фактора NRF2, активацией стресс-индуцированных сигнальных путей (повышением содержания p53 и р-p38 MAPK), а также значительным увеличением экспрессии AIF. При этом активность каталазы и общая антирадикальная способность ткани остаются неизменными. Ряд патологических изменений, обнаруженных на 20-ый день не выражены на 14-й день беременности, что свидетельствует о нарастании дисфункции плаценты в данной модели к более поздним срокам.

Интерпретация результатов исследования

Обнаруженное повышение содержания малонового диальдегида (конечного продукта перекисного окисления липидов) подтверждает усиленное образование АФК в плаценте при ГГЦ матери уже на 14-й день беременности. Известно, что ГГЦ усиливает образование такой АФК, как супероксидный анион-радикал, вступающий в реакцию с оксидом азота. В результате этого образуется сильный прооксидант пероксинитрит [22], ингибирующий электронно-транспортную цепь. Он приводит к повреждению ДНК, окисляет сульфгидрильные группы в белках и вызывает перекисное окисление липидов, не нуждаясь в металлах переменной валентности.

Ранее в данной модели ГГЦ авторы продемонстрировали снижение активности супероксиддисмутазы в плаценте при ГГЦ, связанное либо с усиленной нейтрализацией супероксидного анион-радикала, либо с инактивацией самого фермента вследствие его окисления пероксинитритом [8]. В обоих случаях возможно изменение содержания образующейся перекиси водорода и гидроксильного радикала. Взаимодействие последнего с ненасыщенными жирными кислотами, а также пуриновыми и пиримидиновыми основаниями нуклеиновых кислот приводит к инициации перекисного окисления липидов и окислительной модификации ДНК соответственно. Однако предполагаемого изменения активности каталазы, как и антирадикальной активности, не происходит. Строгий контроль количества образующихся АФК в норме, при физиологически протекающей беременности, подтвержден наличием выявленных высоких корреляций активности каталазы и антирадикальной активности с содержанием малонового диальдегида на 20-й день беременности. Тогда как в группе с ГГЦ подобные взаимосвязи нарушены и тенденция сохраняется только для антирадикальной активности. Отсутсвие должного изменения активности каталазы и антирадикальной активности может быть связано с общей дисрегуляцией работы различных звеньев антиоксидантной защиты при ГГЦ, что приводит к увеличению количества активных форм кислорода и азота, в частности усиленному образованию супероксидного анион-радикала, пероксинитрита, гидроксильного радикала и накоплению продуктов окислительной модификации макромолекул.

Выраженные колебания соержания кислорода могут способствовать увеличению продукции АФК, действуя как сигнальные молекулы, и их следует рассматривать в качестве вторичных мессенджеров во многочисленных сигнальных путях [23]. Это может быть особенно актуально для тканей с высокой потребностью в энергии или содержащих большое количество митохондрий, таких как плацента [24]. При этом необходимо учитывать, что в норме продукция АФК изменяется в течение беременности, что подчеркивает важность окислительной сигнализации в плаценте. По мере прогрессирования беременности и роста метаболических потребностей плода увеличивается как масса митохондрий плаценты, так и активность ферментов митохондриальной электрон-транспортной цепи. Это способствует дополнительному повышению продукции АФК и усилению ОС. Более того, во время беременности наблюдают увеличение системного окислительного повреждения, что соответствует инвазии вневорсинчатого трофобласта и развитию сосудистой сети плаценты. Следовательно, передача сигналов АФК во время беременности имеет ключевое значение для глобальных процессов, таких как развитие сосудистой сети плаценты. Таким образом, АФК, генерируемые клетками в качестве основных или побочных продуктов, могут функционировать как сигнальные молекулы или как клеточные токсины [25].

Избыточный уровень ОС способен негативно влиять на плацентарный ангиогенез и ремоделирование спиральных сосудов плаценты, в частности за счет изменения уровня экспрессии различных транскрипционных факторов [фактора 8, подобного Ktuppel (KLF8); фактора, специфичного для трансформации E26 (Ets-1); ядерного фактора каппа-В; специфических белков 1 и 3 (Sp1, Sp3); STAT3; NRF2], регулирующих экспрессию и активность белков, вовлеченных в процессы ангиогенеза и инвазии трофобласта [26]. Повышенное содержание АФК способствует обширному повреждению ДНК, проницаемости митохондриальной мембраны, активации апоптотической сигнализации и индукции клеточной смерти. Многие исследования показали, что высокое содержание АФК может усиливать открытие митохондриальных пор и активировать поли(АДФ-рибозо)полимеразу 1 (PARP-1), что приводит к транслокации AIF из митохондрий в ядро [27].

Недавние исследования показали, что АФК действуют и как восходящий сигнал, запускающий активацию p53, и как нисходящий фактор, опосредующий апоптоз. При этом содержание и распределение p53 в клетках имеет свою определенную клеточную функцию, он проявляет либо антиоксидантную, либо прооксидантную активность в зависимости от степени стрессовых сигналов [28]. В условиях слабого стресса или его отсутствия p53 индуцирует антиоксидантные гены, такие как сестрины 1/2, Mn-SOD, GPX1, ALDH4, GLS2, для снижения содержания АФК в клетках [28]. Кроме того, p53 индуцирует p21, что способствует повышению содержания в клетках NRF2, индуцирующего экспрессию антиоксидантных генов для снижения содержания АФК. Эта антиоксидантная активность защищает клетки от повреждения ДНК и мутаций, вызванных ОС, а также способствует выживанию клеток. Известно, что в условиях сильного стресса повышенное внутриклеточное содержание АФК активирует p53, индуцирующий прооксидантные гены, включая PIG3, PIG6, FDRX, Bax и Puma, для дальнейшего повышения содержания АФК в клетках, что, в свою очередь, дополнительно активирует p53, а также сигнальный путь p38 MAPK [29]. Эта прооксидантная активность может приводить к p53-опосредованному каспазо-зависимому апоптозу, каспазо-независимой клеточной смерти с эффективной активацией AIF посредством регуляции экспрессии его гена [30], и/или старению клеток [31]. Повышенное содержание p53 и AIF в плаценте с ГГЦ по сравнению с контрольными значениями на 20-й день беременности, обнаруженное в исследовании, подтверждает предположение о возможной активации каспазо-независимой клеточной смерти в плаценте на фоне ГГЦ.

Разнонаправленным также может быть модулирующий эффект p53 на NRF2, способный косвенным образом увеличивать активность NRF2 через индукцию p21, напрямую взаимодействющий с NRF2 и предотвращающий его деградацию, ингибируя его убиквитинирование [32]. В свою очередь NRF2, ингибируя p53, индуцирует p65 и белок, ассоциированный с B-клеточной лимфомой (Bcl2), оказывающие антиапоптотическое влияние [33]. С другой стороны, p53 может ингибировать экспрессию NRF2 посредством ингибирования связывания Sp1 с промоторной областью гена NRF2, блокируя при этом активацию генов-мишеней антиоксидантов NRF2, таких как x-CT, NQ01 и GST-α1 [34]. Предположительно, существуют две фазы модуляции NRF2 p53: в первой из них низкое содержание p53 индуцирует p21 и, следовательно, NRF2, во второй — после серьезного повреждения ДНК и высокой экспрессии p53 он ингибирует реакцию выживания, опосредованную NRF2, что вызывает гибель клеток [28, 35]. В настоящем исследовании на фоне ОС, вызванного ГГЦ, на 20-й день беременности отмечено повышение содержания p53, при этом наблюдали снижение содержания NRF2 в плаценте, что демонстрирует нарушение ответа со стороны системы антиоксидантной защиты и отсутствие реализации компенсаторного внутриклеточного сигнала в модели метионин-индуцированной ГГЦ.

Важно, что p53 посредством индукции p21 (ингибитора циклинзависимой киназы) способствует остановке клеточного цикла, что характеризует процесс клеточного старения [36]. В то же время показано, что p53 способен индуцировать аутофагию, подавляющую старение [37] и снижающую апоптоз. Таким образом, p53 можно рассматривать как переключатель между процессами аутофагии и апоптоза [28]. При этом p38 MAPK, активируемая различными типами стресса, также может участвовать в p53/p21-опосредованном старении клеток [38] или p53/АФК-опосредованном запуске процессов клеточной смерти [29]. В представленном исследовании также продемонстрировано одновременное повышение содержания p53 и активации p38 MAPK, выраженной в увеличении содержания ее фосфорилированной формы, в плаценте крыс на 20-й день беременности на фоне метионин-индуцированной ГГЦ. Являясь многофункциональной сигнальной киназой, она реагирует на стрессовые стимулы, участвует в поддержании клеточного гомеостаза, а ее несвоевременная активация или сверхактивация может привести к клеточной дисфункции и неблагоприятным исходам беременности. p38 MAPK — один из факторов, реагирующих на повреждение ОС, при этом способный запускать множество процессов в плаценте.

В исследованиях, связанных с изучением плацентарных клеток, p38 MAPK активируют гипоксия, липополисахариды и перекись водорода. Показано, что индукция ОС в клетках трофобласта линии Jeg-3 вызывает апоптоз через активацию сигнального пути с участием p53 и p38 MAPK [39]. В ряде исследований, выполненных in vitro в культуре клеток трофобласта, продемонстрировано повышение содержания маркеров апоптоза под влиянием высоких концентраций гомоцистеина [40–42]. Ранее было показано повышение активности каспазы-3 в базальной зоне плаценты при метионин-индуцированной ГГЦ [8]. Однако комплексного изучения воздействия материнской ГГЦ на внутриклеточные пути активации апоптоза в плаценте in vivo не проводили.

Известно, что плацентарный апоптоз усугубляет преэклампсия, и он коррелирует с повышением экспрессии p53. Важно, что устойчивая активация p38 MAPK при этом ставит под угрозу инвазию клеток трофобласта и приводит к усилению процесса апоптоза клеток [43, 44]. Показано, что гомеостаз p53 в трофобласте поддерживает регуляторная петля обратной связи с p38 MAPK в ответ на гипоксический стресс, нерегулируемый из-за преэклампсии, что приводит к чрезмерному апоптозу [45]. Предположительно, контроль активации p38 MAPK и, следовательно, ее последующих патологических эффектов может быть полезным для снижения частоты неблагоприятных беременностей. Однако единое мнение по данному вопросу отсутствует отчасти в связи с тем, что p38 MAPK по некоторым сообщениям принимает участие в передаче внутриклеточных сигналов при формировании и развитии плаценты на различных сроках беременности, при этом конкретные механизмы еще не выявлены [46]. Показана роль p38 MAPK в процессах остановки клеточного цикла и формировании синцития при нормальной беременности [47]. При этом обнаружено, что экспрессия фермента фосфотазы 1, индуцированной диким типом белка p53 (Wip1), дефосфорилирующего p38, предположительно, подавляемая при повышении фосфорилирования p38, на самом деле повышается в плацентах с преэклампсией [45]. Возможно, недостаточная активация пути p38 MAPK в плаценте также может привести к нарушению ее формирования, при этом в настоящей модели на 14-й день беременности в плаценте на фоне ГГЦ отмечена лишь тенденция к снижению фосфорилирования p38 MAPK.

Ограничения исследования

Несмотря на то что выбор исследованных показателей позволил получить результаты, обладающие высокой информативностью и подходящие для интерпретации в комплексном контексте, ограничения использованных методов могут препятствовать выявлению некоторых типов взаимосвязей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исходя из полученных данных, авторы предполагают, что усиление ОС способствует нарушению сигнальных путей в плаценте, и это приводит к изменениям в процессах, необходимых для развития ее сосудистой сети. Это может быть потенциальным механизмом, приводящим к неблагоприятным исходам беременности, наблюдаемым при ГГЦ матери. С учетом важности понимания уровня потенциальной опасности ГГЦ во время беременности для развития плода необходимы дальнейшие исследования конкретных механизмов морфофункциональных нарушений формирования и развития плаценты в модели ГГЦ in vivo.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Ю.П. Милютина — определение концепции, проведение исследования, анализ данных, написание черновика рукописи; И.В. Залозняя, А.В. Горбова — проведение исследования, анализ данных; А.В. Михель — проведение исследования; А.В. Кореневский, А.В. Арутюнян — пересмотр и редактирование рукописи; Г.Х. Толибова — проведение исследования, пересмотр и редактирование рукописи; О.Н. Беспалова — определение концепции, привлечение финансирования. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой ее части.

Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено локальным комитетом НИИ АГиР им. Д.О. Отта, (протокол № 141 от 04.03.2025). Исследование и его протокол не регистрировали.

Источники финансирования. Статья подготовлена к публикации в рамках выполнения государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации № 1025102300010-7-3.2.2 «Создание биологических моделей нарушений репродуктивной функции для разработки индивидуальных подходов к фармакологической коррекции».

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими организациями), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При проведении исследования создании настоящей статьи авторы не использовали ранее полученные и опубликованные сведения (данные, текст, иллюстрации).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, представлены в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внутренних рецензента.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: Yu.P. Milyutina: conceptualization, investigation, formal analysis, writing—original draft; I.V. Zalozniaia, A.V. Gorbova: investigation, formal analysis; A.V. Mikhel: investigation; A.V. Korenevsky, A.V. Arutjunyan: writing—review & editing; G.Kh. Tolibova: investigation, writing—review & editing; O.N. Bespalova: conceptualization, resources. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: The study was approved by the local Ethics Committee of the Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott (Protocol No. 141 dated March 4, 2025). The study and its protocol were not registered.

Funding sources: This work was part of the State Assignment No. 1025102300010-7-3.2.2 “Creating biological models of reproductive disorders to develop personalized pharmacological correction” of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation.

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text, images, or data) was used in this study or article.

Data availability statement: All data obtained in this study are available in this article.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer-review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved two in-house reviewers.

 

¹ Пероксидаза хрена.

About the authors

Yuliya P. Milyutina

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Author for correspondence.
Email: milyutina1010@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1951-8312
SPIN-code: 6449-5635

Dr. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Irina V. Zalozniaia

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: irinabiolog2012@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0576-9690
SPIN-code: 2488-3790

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Anastasiia V. Mikhel

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: anastasia.michel39@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1352-9125
SPIN-code: 1064-6884

MD

Russian Federation, Saint Petersburg

Alexandra V. Gorbova

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: alekss137@mail.ru
ORCID iD: 0009-0005-9774-8908
Russian Federation, Saint Petersburg

Andrey V. Korenevsky

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: a.korenevsky@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0365-8532
SPIN-code: 7942-6016

Dr. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Gulrukhsor Kh. Tolibova

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: gulyatonbova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6216-6220
SPIN-code: 7544-4825

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Saint Petersburg

Alexander V. Arutjunyan

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: alexarutiunjan@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0608-9427
SPIN-code: 9938-5277

Dr. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Olesya N. Bespalova

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: shiggerra@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6542-5953
SPIN-code: 4732-8089

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files